全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 3期·综述与专论·
收稿日期：2008-09-25
基金项目：国家支撑计划项目（2006BAD06A06）
作者简介：李正丰（1981-），男，在读硕士研究生，从事动物病毒学与免疫学
通讯作者：王永录，Tel：0931-8343796，E-mail：Wyonglu@yahoo.com.cn
口蹄疫（foot-and-mouth disease，FMD）病毒抗原
保护剂具有保护病毒和营养细胞的功能，其作用机
制目前还不清楚 ，但可达到以下效果 ：延缓细胞老
化，减少营养液中病毒的失活，提高疫苗效价，使完
整病毒粒子数提高，缺陷粒子数减少，减小病毒对
温度的敏感性，并能延长冷冻保存，减少疫苗冻干
过程中病毒的失活，疫苗稀释使用后有效保存时间
延长，增强疫苗的免疫原性。 提高本动物的抗体水
平，使其离散度减小，免疫持续期延长。
21 世纪动物疫苗研究飞速发展， 人们不仅研
究出了大量细菌和病毒的灭活疫苗以及活的弱毒
疫苗，而且生产出了基因工程疫苗 ，为畜牧业的发
展作出了巨大贡献。但是我国动物疫苗将面临新的
挑战。 如疫苗在运输过程中必须冷藏保存，而在我
国经济欠发达的农村地区，运输条件往往达不到要
求（-15℃），难免会造成疫苗失活 ，免疫失败 ，疫病
爆发，为此给国家带来巨大的经济损失。
目前，动物疫苗中 ，活的冻干疫苗占相当大的
比例 ，国内常用的保护剂主要为牛奶 、蔗糖 、明胶
等，组方简单，保护功能差。加之国外对疫苗保护剂
研究的保密， 致使成品疫苗的长期保存和运输受
限。 我国在活疫苗冻干保存方面作了研究，如王栋
等已经研制出了一种耐热冻干保护剂，但仍未全面
推广应用。口蹄疫病毒在 4℃比较稳定，于-20℃，特
别是-50~-70℃十分稳定，可以保存几年之久；30℃
于 24 h 内使病毒灭活 ； 对酸很敏感最适 pH 值为
7.4~7.6。 因此，病毒在存放和运输过程中 ，温度对
病毒活力有很大影响 。 应用适宜的病毒保护剂 ，
能够有效防止病毒在不同保存条件时受到破坏 ，
延长病毒的存放期 ，保持病毒滴度 。 口蹄疫病毒
的理化性质决定了它对有机溶剂不敏感 ，对热敏
感 ，耐低温 [1~3]。
保护剂及其在口蹄疫疫苗中的研究进展
李正丰 1，2 王永录 2
（1中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室 农业部畜禽病毒学重点开放实验室 农业部草食动物疫病
重点开放实验室，兰州 730046；2甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070）
摘 要： 保护剂在动物疫苗中具有重要的作用，直接影响疫苗的质量。以保护剂为核心介绍了在疫苗保存前病毒
抗原和保护剂的准备，保护剂的选用原则，分类、作用机理，着重讨论了保护剂在口蹄疫疫苗中的研究进展以及当前存在
的问题，并对其应用前景提出展望。
关键词： 保护剂 口蹄疫疫苗 研究进展
Study Progress of the Protectant in FMD Vaccine
Li Zhengfeng1，2 Wang Yonglu1
（1State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology，Key Laboratory of Animal Virology of Agriculture，Key Laboratory
of Grazing Animal Diseases of Ministry of Agriculture，Lanzhou Veterinary Researcher Institute，Chinese Academy of
Agriculture Sciences，Lanzhou 730046；2College of Veterinary Medicine，Gansu Agriculture University，Lanzhou 730070）
Abstract： Protectant direct impact on the quality of vaccine. This paper introduced preparation of virus antigen
before conservation，selected principle， categories and functional mechanism of protectant. Also，potential problems， and
the application prospect were pointed out.
Key words： Protectant FMD vaccine Study progress
2009年第 3期
1 保护剂的作用机理
目前被广为接受的液体状态下蛋白质稳定的
机理之一是优先作用原理，即在有起稳定作用的保
护剂存在的条件下，细胞膜蛋白优先与水作用（优
先水合），而保护剂优先被排斥在蛋白质区域外（优
先排斥），在这种情况下，膜蛋白表面就比其内部有
较多的水分子和较少的保护剂分子。但是优先作用
机理不能完全解释用聚合物或高浓度蛋白质自身
作为保护剂保护蛋白质的现象， 在冻干过程中，由
于蛋白质的水合层被除去 ， 优先作用机理不再适
用。 对于保护机理仍在探索阶段，目前主要有两种
假说。
1.1 “水替代”假说
许多学者认为，由于蛋白质分子中存在大量氢
键，结合水通过氢键与蛋白质分子联结。 当蛋白质
在冷冻干燥过程中失去水分后，保护剂的羟基能替
代蛋白质表面的水的羟基，使蛋白质表面形成一层
假定的水化膜，可保护氢键的联结位置不能直接暴
露在周围的环境中， 从而稳定蛋白质的高级结构，
防止蛋白质冻干而变性，使其即使在低温冷冻和干
燥失水的情况下，仍保持蛋白质结构与功能的完整
性。
1.2 “玻璃态”假说
玻璃化是指物质以非晶态形式存在的一种固
体状态，黏度极大，物质兼有固体和液体的的行为，
不容易形成结晶，且分子扩散系数很低。 具有黏性
的保护剂包围在蛋白质分子的周围，形成一种在结
构上与玻璃壮的冰相似的碳水化合物玻璃体，使大
分子的物质的运动受阻， 阻止膜蛋白的伸展和沉
淀，维持蛋白质分子三维结构的稳定，从而起到保
护作用。
目前，“水替代”假说和“玻璃态”假说并不能完
全解释所有的冷冻干燥保护过程。大部分学者赞同
“水替代学说” 因为可以通过实验检测到膜蛋白和
保护剂之间的氢键作用， 为理论提供证据。 但是，
“水替代”假说不能解释某些现象。 例如，对 L-天门
冬酰氨酶的研究表明，虽然四甲基葡萄糖和聚乙烯
吡咯烷酮 （PVP）都不能作为水替代物与蛋白质分
子形成氢键，但在干燥过程中仍然能有效防止蛋白
失活。 同样，“玻璃态”假说也有一些不能解释的问
题，如高温下海藻糖对生物制品的稳定性问题。 总
之，对冻干过程的保护机理仍需深入研究 [28，29]。
王镇等 [30]曾对 FMDV 保护剂作探索性研究。 运
用 BHK-21 细胞生产疫苗 ，在接毒的同时 ，在培养
液中加入不同浓度的 PEG 或 DMSO， 每隔 24 h 取
培养上清测定病毒的滴度。结果表明，PEG 对 FMD-
V 在 BHK-21 细胞中的繁殖有促进作用，并且产生
的子代病毒量在一定范围内随 PEG 浓度的增加而
有所增加。DMSO 对 FMDV 增殖的影响不如 PEG 明
显，但似乎对维持病毒水平有作用。 用体外培养细
胞增殖 FMDV 往往产量较低 。 如何提高滴度是
FMDV 疫苗生产中急待解决的问题 [31]。 兰州兽医研
究所王永录研究员用 0.5﹪的水解乳蛋白液做母
液， 加入 2％~16％的甘油 2％~8％的蛋白胨和 5％~
20％蔗糖，充分混匀后，加入到口蹄疫病毒液中，放
到低温下保存，经实验证明，该保护剂对其抗原具
有良好的保护效果，并成功地申请了专利，这为口
蹄疫疫苗保护剂的研究奠定了基础，有望在未来能
够研制出理想的口蹄疫疫苗保护剂。
2 保护剂的分类及作用
保护剂可按照不同的方式进行分类。 （1）按相
对分子量可分为低分子量化合物和高分子量化合
物。低分子量的化合物如氨基酸、有机酸、低分子量
糖类、醇类等；高分子量的物质如蛋白质、多糖 、聚
乙烯吡咯烷酮 （PVP）等 ；（2）按其是否能渗到细胞
内部可分为渗透型和非渗透型 2 种。渗透型如 DM-
SO（Dimethl sulfoxide，二甲基亚砜 ）、甘油 、蔗糖等 ，
能渗入细胞内，降低因外界温度较低而增加的渗透
压， 防止细胞内病毒因温度较低可能产生的损坏。
非渗透型 PVP（Polyvingpyrrolone，聚乙烯吡咯烷酮）、
Piccoll、蛋白质等，能防止细胞由外向内渗透溶质，
可保护细胞内病毒在外界温度升高时可能产生的
损害。（3）根据化学性质，保护剂又可分为多羟基化
合物、糖类、氨基酸、聚合物和蛋白质等几大类。
2.1 多羟基化合物保护剂
多羟基化合物主要用于蛋白质的保护剂，常见
的有甘油、甘露醇 、肌醇、山梨醇、硫醇和聚乙二醇
等。 在微生物研究中，甘油常用来保存菌种和病毒
株，也可促进冻干处理的过氧化氢酶复性，且当甘
油浓度上升至 0.8﹪，过氧化氢酶可完全复性 [8]。 甘
李正丰等：保护剂及其在口蹄疫疫苗中的研究进展 7
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 3期
露醇不仅可作为优良的骨架剂使用，还能兼作病毒
和生物制品的冻干保护剂 [9]。 甘露醇对蛋白质的保
护作用与其浓度、形态结构有关，而浓度与结晶形
态有时又有一定的关联性。无定型甘露醇具有使蛋
白质稳定的作用，而结晶态的甘露醇则失去保护功
能 ；1％或更低浓度的甘露醇通过无定型结构的形
成而阻止蛋白质分子的聚集，但是高浓度的甘露醇
则易于形成结晶，会促进蛋白质的聚集 [10]。
2.2 糖类化合物保护剂
糖是最常见、使用最广的一类保护剂 ，是蛋白
质的非特异性稳定剂。糖的保护作用与蛋白质的种
类有关 [11]。 常用作保护剂的糖类，包括单糖，主要为
葡萄糖；二糖有蔗糖、海藻糖、乳糖；聚糖有葡聚糖。
它们有一个共同的特点就是具有大量的自由羟基，
其中，葡萄糖、乳糖具有还原性，蔗糖、海藻糖、葡聚
糖没有还原性。 Saez 等研究表明，在-45℃时添加蔗
糖、 葡萄糖等保护剂对保持物质的活性是必需的，
而且 20%的浓度使保护效果最佳。在比较不同温度
下葡萄糖、蔗糖、海藻糖和葡聚糖对纤维素酶的酶
热稳定性的影响时发现，在 20℃条件下，蔗糖和葡
萄糖对纤维素酶都有保护作用，在高温下两种糖都
破坏了纤维素酶的稳定性[12]。根据“水替代学说”[15~17]，
在低温条件下，葡萄糖的羟基可能代替水分子同蛋
白分子作用，防止蛋白质因失水而引起的主相变温
度的升高，减缓酶在存放过程中失活。在高温下，由
于葡萄糖是还原性糖，其羟基会同蛋白质活性部位
的氨基酸残基反应，使酶变性失活，因此蔗糖在高
温下很难形成玻璃态，起不到保护作用。Mouradian[18]
也认为还原性保护糖的醛基能与蛋白质的伯氨基
发生非酶性棕色反应，从而影响蛋白质的功能。 糖
的还原性越弱， 对冻干生物分子的贮存稳定性越
强。例如，海藻糖是一种稳定的非还原性二糖，其羟
基也能代替水分子同蛋白质分子表面部分结合，对
蛋白质形成保护。同时，海藻糖的分子较小，易于以
分子的形式填充到蛋白质分子的空隙中，有效限制
蛋白质分子内部的结构发生变化，从而能避免变性
失活。值得注意的是，虽然海藻糖与蔗糖都是二糖，
水化能力也基本相同，但海藻糖的保护作用却远高
于蔗糖。 这是由于海藻糖有较高的玻璃化温度，较
易形成玻璃态，将蛋白质分子支撑和包裹起来使之
不易变性 [19]。目前海藻糖已应用于酶和其它的蛋白、
疫苗和抗体、 生物膜、 脂质体、DNA 或 DNA 溶液、
细菌和酵母、有核哺乳动物细胞、哺乳动物血细胞、
哺乳动物器官等微生物的冷干保护，但由于海藻糖
价格较贵，阻碍了其在生产中的使用。
大分子糖类对蛋白质提供的保护作用似乎不
及小分子糖类物质，诸多研究均显示分子量大的多
糖不是冻干保护剂的最佳选择 [9，13，14]。 但也有研究
结果与此恰好相反， 如对大分子量菊糖的研究表
明，聚合度高于 5.5～6.0 的菊糖对碱性磷酸酶的活
性保护作用明显高于海藻糖与低聚合度的菊糖 [12]。
葡聚糖和蛋白质均为大分子，葡聚糖分子不容易进
入蛋白质分子内部，仅在蛋白质分子周围形成玻璃
态的保护外壳，处于壳内的蛋白质分子可以作一定
限度的空间结构的变化，引起部分失活。 而在高温
下，葡聚糖与蛋白质分子之间混合作用增大 ，有部
分葡聚糖分子在蛋白质分子内部形成玻璃态，从而
更有效地限制蛋白质分子空间结构发生变化 [14，20，21]。
糖对蛋白质的保护作用与其浓度有关，糖获得
最大稳定作用的最低浓度是其足够在蛋白质表面
形成一个单分子层的度 [13]。 实际上，糖对蛋白质的
保护作用不仅取决于糖的总体浓度，而且还与两者
的比例有关。 Costantino 等 [11]研究发现，当甲基 q-D-
吡喃甘露糖、乳糖、海藻糖、纤维二糖等与重组人生
长激素的摩尔比为 131∶1 时， 它们均能 100％地占
据重组人生长激素上所有的水结合位点，对其提供
最佳的保护效果；当摩尔比达 300∶1 及 1 000∶1 时，
糖对重组人生长激素的保护作用不再提高，甚至会
有所下降。
2.3 氨基酸保护剂
氨基酸是常见的蛋白质保护剂之一，常用的氨
基酸类保护剂有脯氨酸 、色氨酸 、谷氨酸 、谷氨酸
钠、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸盐酸盐、肌氨酸、L-酪氨
酸、苯丙氨酸、精氨酸等。 在冷冻过程中， 低浓度的
甘氨酸可通过抑制 10～100 mmol 磷酸缓冲盐结晶
所致 pH 值的改变，从而阻止蛋白质变性 [22]。无定型
甘氨酸可阻止冻干过程中重组人生长激素的聚集；
结晶型甘氨酸能升高成品的塌陷温度，阻止因塌陷
而引起的蛋白质结构的破坏。
2.4 聚合物类保护剂
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2009年第 3期
聚乙二醇 （P E G）、聚乙烯吡咯烷酮 （P V P）、
明胶、聚乙烯亚胺等聚合物也常作为蛋白质及微生
物的冷冻干燥保护剂。聚合物一般和其他种类的保
护剂联用， 其稳定作用取决于聚合物的多重性质。
如 PVP 是一种多聚体， 对生物或生物大分子具有
非特异性保护作用，同时它也是一种非渗透性保护
剂，通常和糖一起，主要通过与糖类间的氢键作用
改变糖类的玻璃化温度发挥作用。 此外，不同浓度
和不同分子量的 PVP 的作用不一样。 Zeng 等 [23]研究
了 PVP 分子量对蔗糖的玻璃化和结晶作用的影
响， 证明大分子量的 PVP 能够有效的抑制蔗糖的
结晶作用，通过稳定糖类的玻璃化结构 ，这些多聚
物还可以提高共同冻干的蛋白质和肽类的稳定性。
此外，Berggren 等 [24]研究结果显示除分子量这个因
素外，PVP 的浓度也影响了乳糖的结晶温度、 湿度
诱导的结晶时间和颗粒形态。 由此可以得出结论，
增加 PVP 的浓度和分子量也可以提高非结晶型糖
类的物理稳定性。
2.5 蛋白质
蛋白质类保护剂可分为两种：一种是蛋白质制
品自身，另一种为外来蛋白质。 某些蛋白质经冻融
后的活性与其起始浓度有直接关系，起始浓度升高
有时会促进蛋白质的复性 [25，26]。当制品浓度较低时，
常用外来蛋白质类作为保护剂。如血清白蛋白是一
种经典、优良的蛋白质稳定剂，常用于保护冻干的
白细胞介素 、巨噬细胞集落刺激因子 （MCSF）等疏
水性细胞。已有人把重组人白蛋白推荐为血清白蛋
白的替代品 [27]。
2.6 其他类型的保护剂
吐温 80、普朗尼克 、布里杰 、十二烷基磺酸钠
及抗坏血酸等一些表面活性剂或还原剂有时对
冷冻及干燥过程中的蛋白质也起到一定的保护
作用 [13，20]。
3 保护剂的选择原则
选择保护剂时，应遵循以下原则 ：有免疫活性
而无药理活性；能在冻干和保存时维持疫苗的稳定
性；在初次干燥时适宜的温度下疫苗不倒塌 ；低成
本，易取得；易灭菌；可溶性好；外型美观。同时还需
要考虑其溶液在冷冻干燥时的崩解温度，因为在此
温度以上，被干燥物质虽然仍呈冻结状态，但由于
保护剂的崩解温度过低而失去了刚性 ， 变得有粘
性，妨碍水蒸汽的顺利逸出。 故在达到同等保护效
用的条件，应该选择崩解温度较高的保护剂。
4 疫苗保存前病毒抗原和保护剂的准备
4.1 病毒抗原的选择和处理原则
在选择病毒株时 ，利用病毒毒株库技术 ，对收
集保存的代表毒株进行病原学，流行病学和免疫学
研究，选择免疫原性好，抗原谱广 ，遗传性能稳定，
对实验动物和制苗材料具有良好的适应性，而且是
我国近年来流行的代表毒株， 用其作制苗毒株，对
实际防疫具有针对性 。 保存前有时需要将病毒浓
缩 ，提高抗原的纯度，这对提高保存病毒的存活率
是有益的。
4.2 病毒抗原浓度与保护剂浓度的配比原则
浓度是影响病毒抗原存活率的一个因素 [4，5]，
Wright 等 [6]研究认为病毒抗原与保护剂的浓度比例
会影响保护效率，原因是高浓度的保护剂可能在病
毒抗原表面形成胶团的保护层，降低了病毒抗原暴
露在介质中的面积。 如果保护剂太少，则细胞表面
被覆盖的程度以及维持细胞中蛋白质结构等的作
用不够，可能导致细胞在冻干时暴露区域及细胞通
透性较大，从而增加死亡。如果保护剂太多，细胞的
通透性就会受影响。因此，病毒抗原、保护剂的具体
比例应通过实验取得 [7]。
5 当前存在的问题
目前，有关病毒和生物制品保护剂的研究重点
是保护剂的选择及浓度对温度变化后病毒和生物
制品蛋白质质量的影响。在温度变化过程中压力的
改变能否引起蛋白质变性还不清楚， 对玻璃化、去
玻璃化和结晶规律的了解甚微，温度降低过程中降
温速率对蛋白质活性的影响也未见报道。关于低温
的病毒制品复水后的活性、渗透压及功能的变化研
究很少。 病毒制品的保护机理过程是复杂的传热、
传质过程，其直接影响制品的质量和保存时间。 但
国内在这方面的研究相对滞后，因此要借鉴国外的
研究成果 ，着重研究在温度变化过程中，降温速率
对病毒制品活性的影响 ，以及溶液的结晶、玻璃化
与去玻璃化的转变对病毒制品的变性机理。有文献
报道了温度降低过程中降温速率对病毒及生物材
料营养成分及活性的影响，以及有关玻璃化保存方
李正丰等：保护剂及其在口蹄疫疫苗中的研究进展 9
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 3期
面的问题。 同时，应研究在温度升高过程中加热温
度对病毒制品失水率和活性的影响。
6 展望
随着生物技术的飞速发展，保护剂已经越来越
多地应用于各种生物制品中，如动物细胞、微生物
和蛋白质的保存。但在使用该项技术时仍需要采取
一些有效的辅助手段，例如蛋白质分析手段为蛋白
质保护剂的研究提供了方便；计算机技术使得研究
者能够通过建立相应的数学模型对冻干过程中物
料的真实状态进行模拟解析，从而使冻干技术得以
完善与提高。我国对常温疫苗保护剂的研究方面尚
未见到报道，为此兽医工作者还应该进一步了解蛋
白质的保护机理，开发出具有潜能的常温疫苗保护
剂，来提高动物疫苗的质量。 这是现今生物技术研
究的热点之一。
参考文献
1 殷震，刘景华，动物病毒学（第 2版）.北京：科学出版社，1997，
479~499.
2 张云浦，冯丽秋，李景鹏，等.中国兽医，2001，35（5）：34~35.
3 罗镇藩，房宜康.广东畜牧兽医科技，2002，27（3）：37~38.
4 Yang L，Ma Y，Zhang YX. Biologi-cals，2007，35：265~269.
5 Palmfeldt J. Cryobiology，2003，47：21~29．
6 Wright CT，Klaenhammer TR.Applied and Environmental Microbio-
logy，1981，41：807~815.
7 林云.科学试验与研究，2002，6：4~7.
8 Liao YH，Brown MB，Quader A，et al. Pharm Ras，2002，19（12）：
1854~1861.
9 Souillac PO，Middaugh CR，Rytting JH. Hit J Pharm，2002，235
（1~2）：207~218.
10 Wu SL，Leung D，Tretyakov L，et al.Int J Pharm，2000，200（1）：
1~16.
11 Costantino HR，Carrasquillo KG，Cordero RA，et al. Biochemical
Engineering Journal，2002，11：205~209.
12 Hinrichs WL，Prinsen MG，Frijlink HW.Int J Pharm，2001，215：
163~174.
13 Wang W.Int J PHarm，2000，203：1~60.
14 Pikal-Cleland KA，Carpenter JF. J Pharm Sci，2001，90（9）：
1255~1268.
15 Arakawa T，Yoshiko K，Carpenter JF. Pharm Res，1991，8：285~
291.
16 武华丽，胡一桥.中国药学杂志，2001，36：436~438.
17 Allison SD，RandolpH TW，Manning MC，et al. Arch Biochem
Bivphys，1998，358：171~181.
18 Boonyaratanakornkit BB，Park CB，Clark DS. Biochim Biophys
Acta，2002，1595（1~2）：235~249.
19 刘传斌，云战友，冯朴荪，等．中国医药工业杂志，1998，29
（7）：327~331.
20 Carpenter JF，Pikal MJ，Chang BS，et al. Pharm Res，1997，14：
969~975.
21 Chang BS，Reeder G，Carpenter JF. Pharm Res，1996，13：243~
249.
22 Mattern M，Winter G，Konert U，et al. Pharm Dev Technol，1999，4：
199~208.
23 Zeng XM，Martin GP.Int J Pharm，2001，218（1~2）：63.
24 Berggren J，Alderborn G. Pharm Res，2003，20（7）：1039.
25 Krelgaard L，Jones LS，Randolph TW，et a1.J Pharm Sci，1998，87
（12）：1597~1603.
26 Sarciaux JM，Mansour S，Hageman MJ，et a1. J Pharm Sci，1999，88
（12）：1354~1361.
27 Tarelli E，Mire-Sluis A，Tivnann HA，et a1. Biologicals，1998，26
（9）：331~346.
28 华泽钊，冷冻干燥新技术[M].北京：科学出版社，2006.
29 刘传斌，谢健，苗蔚荣，等.中国微生态学杂志，1998，6：59~61.
30 王镇，陆宇，丁明孝.中国病毒学国病毒学，2006，（2）：175~
178.
31 Gripon P，Diot C，Guguen-Guillouio C.Virol，1993，19（2）：534~
540.
10