全 文 ：· 药用植物栽培 ·
浙贝母愈伤组织超低温保存的研究
浙江省中药研 究所 苏 新 方 坚
摘要 本文研究结果表明 , 培养30 ~ 35 夭的愈伤组织适宜于低温保存 , 较好的冷冻 保护 剂是 10 %
D M S O ( 二甲基亚讽 ) 干 5 %甘油 。 较佳的 冷冻 程 序 是以 1一 5℃加 in 的降温 速度 从 。 ℃降至 一 18
℃ , 停留 1 小时 , 再降至 一 40 ℃停留 2 小时 , 然后投入液氮中贮存 , 解冻方法以采 用 40 ℃ 水浴迅速化
冻效果较好 , 解冻后的愈伤组织在暗培养中生长好 , 存活率高。 经过冷冻后的浙贝 母 愈伤组织成功地
得到增殖及再生植株。
随着植物组织培养工作广泛迅速地开展 ,
关于植物离体细胞超低温保存技术的研究也在
逐渐兴起 。 因为超低温保存不仅能长期保存无
性优 良品系和纯系 , 还可解决组织和细胞继代
培养中的变异 , 保存稀有珍贵和濒危的种质资
源 〔 ` ’ 。 目前超低温保存已在 40 多种植物中获得
成功`“ ’ a 〕。 本文报道浙贝母愈伤组织 的 超低温
保存以及影响其存活率的一些主要因素 。
材 料 与 方 法
一 、 材 料 浙 贝 母 ( rF i t i l l a r i a t h nU b e gr i i
M iq
.
)愈伤组织是由鳞茎芽诱导而来 , 在 M s培
养基 十 N A A I . sm g / L + 2 . 4一D l . om g / L + 水 解酪
蛋白 3 0 m g / L 十 蔗糖 40 9 / L 中进行培养 , 培养
温度 1 8~ 2 0℃ ,光照 1 0 0 0~ 1 5 0 0 l x , p H S . 8 , 经
过多次不同培养年龄的对比试验后 , 采用培养
30 ~ 35 天迅速生长的愈伤组织为冷冻材料 , 分
化培养基 用 M S + 6扔 A 1 . Ogm / L 十 N A A 0 . 5
m g/ L + 蔗糖 3 09 / L 。
二 、 预处理 选择 2 ~ 4m m 大 小 的愈伤
组织块 ,在含有 5 % D M S o 的M S 培养基中培养
7 天 , 然后取出置于聚乙烯小试管中 , 加入不
同配比的冷冻保护剂 : ( 1 )不同浓度的 D M s o 。
( 2 ) D M S O + 不 同浓度 甘 油 。 ( 3 ) D M so + 糖及
糖醇 + PE G ( 聚乙二醇 ) 。 然后密封试管 , 让
试验材料在 O ℃冰中静置 30 分钟 。
三 、 冷冻方法 将材料用冷冻保护剂预处
理后 , 采取快速冷冻法及慢速冷冻分别冷却 。
快速冷冻法是将材料直接从 O ℃投 入液氮中保
存 。 慢速冷冻法是将试管放入能调控的低温冰
箱中 , 以 1~ 5 ℃ /m in 的冷却速度降到 一 18 ℃ ,在
此温度停留 1小时 , 然 后 再 以 1~ 5 ℃ /m ln 的
冷却速度降到一 40 ℃ 。 在 一 40 ℃设几个不同停留
时 间 ( 0 , 0 . 5 , 1 , 2 , 5 , 1 0小 时 ) 进行
试验 , 在达到预定的停留时间后 , 将试管投入
液氮中保存。
四 、 解冻 材料经液氮保存18 天后取出 ,
进行了四种解冻方法试验 ( l) 在 40 ℃水浴中迅
速解冻 。 ( 2 ) 置于室温 ( 2 0~ 2 4 ℃ )下解冻 。 ( s )
1 ~ 3℃冰箱内解冻 。 ( 4) 试管置于自来水龙头
下 , 用流水冲洗解冻 , 水温约 18 ℃ 。 解冻后的
组织用 M S 液体培养基冲洗数次 , 以免发生质
壁分离。 待冷冻保护剂完全去除后 , 可将材料
保存在合适的培养基内。
五 、 细胞活力及植株再生能力的检洲 试
验材料用 M S 液体 培 养 基 冲 洗 后 , 用 T T C
法 ( 氯 化 三 苯 基 四 氮 哇 还原法 ) 测试川 。
称取 5 0 m g 愈伤组织 , 加入 0 . 1% T T C溶液 (用
O
.
ZM 磷酸缓冲液调 p H 7 ) 染 色 8 小 时 , 吸去
T T C 溶液 , 用蒸馏水冲洗 2 ~ 3 次 , 然后将愈
伤组织放入研钵中 , 加入适量的 丙 酮研 磨提
取 , 把提取液倒入 l om l的离心管中 , 在 3 00Or/
m in 的速度下离心 5 分钟 , 吸取上清液 ,用 721
型分光光度计在 4 9 On m 波长处测定吸收值 。
浙贝母愈伤组织经过测定其细胞活力后 ,
转移到新鲜的分化培养基上诱导增敬 , 在培养
过程中 , 观察愈伤组织的生长及分化情况 , 一
个月后统计存活率。
结 果 与 讨 论
币哥材第 2 3卷第 2 2期 2 0 9 0 年 1 2月
DOI : 10. 13863 /j . i ssn1001 -4454. 1990. 12. 001
一 、 愈伤组织的培养时间对容活率的影响
杭寒力的提高与细胞沁分裂和生长活动等
各种生理状态有密切关系 t“ , 。 因此 , 当我们在
研究组织细胞的超低温保存时 , 也特别注意到
愈伤组织的培养时间对冷冻保存后存活率的影
响。 经过试验 , 结果如图 1 、 ’ 图中曲线表明 ,
T C 法的测定值和再培养后愈 伤 组 织恢复生
长的存活率这二者的基本趋势是一致的 , 这一
结果进一步证明 T T C 法钧:为鉴定细 胞 活力的
一种初步手段是可靠的 。 实验结果指出 , 当愈
伤组织转移到 M S 培养基上 后的头 10 天 内 , 其
抗冻性较弱 , 在冷冻保存后的细胞活力和存活
率较低 , 培养 20 天时组织的抗冻性有所增强 ,
培养 30 ~ 35 天的愈伤组织具有较 高 的抗 冻能
力 。 当培养天数再延长时 , 其 抗 冻 能 力又降
低 。 选择 30 ~ 35 日龄的浙贝母愈伤组织作为超
低温保存材料较为适宜 。
的渗透压提高 , 因而 可减轻脱水损伤和敞冰月
的渗透冲击 。 本实验结果表明 , 虽然葡萄糖、
蔗糖 、 山梨糖醇 、 甘露糖醇 、 P E G 具 有一定
的冷冻保护作用 , 但最有效的冷 冻保 护 剂是
1 0% D M S O 十 5 %甘油 。 同时使用 2 种以上的
冷冻保护剂可以提高细胞的存活率 。 ( 表 1 )
夸, 冷冻保护荆对浙贝愈伤组舰妞低通保存后存活率的影响
冷 冻 保 护 剂
存活率ǎ%甲
.1208咕叼.0
1 1℃ 值
人 4 9 0
5 % D M S O
10% D M S O
1 5% D M S O
1 0% D M S O + 5%甘油
1 0% D M S O + 1 0%甘油
1 0% DM S O + 1 5%甘油
I Q% D M S O
+ 蔗糖
0言5川 0 1 /1+ 5% P E G
10 % D M S O 十葡萄糖
0
。
5m o l/ 1+ 5% P E G
10 % DM S O
+ 甘露糖醇
0
。
s m o l /1+ 5% PE G
二
10% D M S O
+ 山梨醇
0
。
s m o l /1+ 5% P EG
1 0 1 5 2 0 2 5 30 35 4 0 4
培养天数
1 愈伤组织的培养日赞对超低沮保存存活率
的影晌
` _ 二 、 减培养与存活率的关系
… 冷冻前 , , 将愈伤组织转入含 5 %D M S o 的
M S
, 培养基 中进行 7 天 的预培养。 对愈伤组织
进行预培养的目一的是提高分裂细胞 的比例和减
少细胞内自由水的含量 , 以此来增加细胞对低
温条件的适应能 力 。 把经过预培养的愈伤组织
_与不经过预培养而直接冷冻的 愈 伤 组 织相比
挽 , 一 结果表明 , 经过预培养的愈伤组织存活率
比未经过预培养的愈伤 组织高, 为 71 % , 而不
经过预培养的愈伤组织存活率只有42 % 。
。 三 、 冷冻保护荆与存活率的关系
_ 常用的冷冻 保 护 剂为 DM S O 、 甘油 、 糖
类 、 、糖醇等 。 它们属低分子量偏中性的溶质 ,
在溶液中能与多个水分 一子结合 , 可提高溶液的
粘度 , 同时使溶液的冰点下降 。 由于冷冻保护
剂还能缓慢地惨透至衫田胞质内部 , 可使细胞内
四 、 愈伤组织冷冻后的存活率与冷冻方法
的关系
至今已报道的降温冰冻方法主要有三种 :
( 1) 快速冷冻法 ( 2) 分步冷冻法 ( 3) 慢速冷冻
法 r Z , 。 目前 , 慢速冷冻法被广泛地采用 。 我们主
要探讨慢速降温方法中应该分儿个步骤 、 每步
停留多长时间。 实验结果表明 , 慢速及快速二
种冷冻方法经解冻后都可存活 , 但慢速冷冻法
存活率较高。 通过实验我们发现 , 在慢速降温
的终点温度停留多长时间对达到高存活率起着
关键的作用 , 如表 2 所示 。 当慢速降温到 “ 40 ℃
时 , 不立即投入液氮 , 而使其停留 2小时 , 则
冷冻存活率明显增加 。 由此看来 , 浙贝母愈伤
组织较为适宜的冷冻程序是以 1~ 5℃ /m i n的降
温速度从 O ℃降到 一招 ℃停 留 1小 时 , 一再以同
样速度降到 一 40 ℃停留 2 小时 , 然 后 投入液氮
中保存 。
五 、 解冻方法对细胞活力的影晌
一般认为在 40 ℃水中快速解冻 比在室温中
. 霉 . 中药材第 1 3卷第 2 2期 1 0 0 0 年 2 2月
衷 2 降细冷冻方法对浙贝母愈伤组织
超低沮保存后存活率的影晌
冷 冻 方万 法 { T Tc 色 存活率 ( %)
0 ℃ , LN
O℃ , 一 理O℃ ) L N
O℃` 一 1 8℃ l h r ,
一 住 0 ,C ) L N
0℃ , 一 1 8 oC l h r ,
一 4 0℃ 3 0m主n , L N
0℃ ) 一 1 8℃ l h r、一 40℃ l h r , L N
O ,C ) 一 18℃ l h r今一 40℃ Zh r令 L N
0℃今 一 1 8℃ l h r争一 4 0℃ s h r、 L N
0℃ , 一 1 8℃ l h r )
一 4 0 oC 1 0 h r、 L N
0
。
3 8
0
一
2 7
4 3
。
3
3 1
。
5
0
。
5 8 6 5
。
0
0
。
6 5 7 4
。
5
0
。
6 1 7 1
。
8
0
。
8 7 7 8
。
2
愈伤组织恢复生长表现出明显的差异 。 培养于
黑暗条件下的愈伤组织能较快地恢复生长 , 存
活率也较高 , 为 81 % , 而培养在光照条件下则
为 5 1% 。
七 、 浙贝母愈伤组 织冷冻后的增殖与分化
经过冷冻后的愈伤组织 , 用液体培养基冲
洗几次后 , 转移到 M S 培养基中 , 大约 7 天左
右开始增殖 , 新生愈伤组织呈白色及淡黄色 ,
待生长旺盛后转入分化培养基中 , 30 夭左右诱
导出根 , 50 天后形成完整植株 。
今 考 文 做
0
。
7 2 7 6
。
7
0
。
5 2 6 1
。
3
注 : 降沮速度为 z~ 5℃ /m i n
慢速解冻效果要好 。 然而 w i the sr 在玉米和胡
萝 卜培养细胞的超低温保存试验中发现 , 在室
温 ( 2 0℃ )下的慢速化冻和 4 0 ℃水浴快速化冻一
样能获得高的存活率 〔“ J。 因此 , 我们在浙贝母
愈伤组织的超低温保存中 , 系统地比较了四种
解冻方法的差别 。 结果表明 , 解冻时细胞内容
易发生剧烈的再结晶现象 , 冰晶体增大 , 使细
胞死亡 。 采用 40 ℃水浴迅速解冻的方法 , 则使
再结晶过程来不及发生 , 细胞活力提高 , 解冻
后再培养能具有较高的存活率 , 其佘三种解冻
方式细胞活力较低 。 ( 图 2 )
丁T C 值
A 4 9 0 :::
:{:
{ {一 。 。
!…
日_ }
温度℃
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v o l
.
1
,
T e c h n i q u阳
f o r P r o Pa g a t io n a n d b r e e d i n g ( D
.
A
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a ·
n s , e d s
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) P
.
8 0 6
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1 98 3
〔5〕 W i t h e r s , L . A · , C r y o P r e s e r v a ti o n o f P l a n t
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.
K
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K a r t h a e d )
,
C R C
P r e s s
,
I n e B o e a R a t o n
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F l o r i d a
,
P
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P l a n t C e l l a n d E n v i r o n m e n t 6 : 1 17 ,
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〔 7〕 B a ja J, Y . P . 5 . , P l a n t C e l l C u t u r e i n C rOP
Im P r o v e m e n t ( 5
.
K
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S e n a n d K
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L
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G i l es
.
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,
P l e nu m P
r e s s , N e w Y o r k
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P
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19
,
1 9 8 3
[ 8〕 K a r th a , K . K . e d . , C r y o p r e s e r v a t io n o f
P l a n t e e l l a n d o r g a n s
.
C R C P r e s s
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B o e a R a t o n
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六 、 光照对浙 贝母愈伤组织恢复生长的影
响
我们将解冻后的愈伤组织转移到新鲜培养
基上 , 分为两组 , 一组放 于 有光 照 ( 1 0 0 0~
1 50 l0 x ) 的培养 箱中 , 另一组放于 无 光照 的
培养箱中 ,温度均为 20 ℃ 。结果在两种情况下 ,
中药材第 1 3卷第 12 期 1 9 。 。 年 , : 月
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