全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·综述与专论· 2008年第5期
收稿日期:2008-05-07
基金项目:黑龙江省自然科学基金(TC2005-10)
作者简介:余丽芸(1965-),女,教授,从事乳酸菌基因工程疫苗研究;E-mail:yuliyun@hlau.cn
乳酸菌(LAB,lacticacidbacteria)是一群能大
量发酵碳水化合物并产生乳酸的革兰阳性细菌,是
人和大多数动物肠道内的常见细菌,在工业、农业
和医药等与人类生活密切相关的重要领域应用价
值很高,被公认为安全级 (GRAS,generalyrecoas
safe)微生物。和益生作用有关的如乳杆菌属、乳球
菌属、肠球菌属和双歧菌属等乳酸菌尤其受到人们
的重视,利用一些乳酸菌在胃肠道、泌尿、生殖系统
中或粘膜部位粘附存活且无病原性等特点,开展活
菌口服疫苗研究,受到了广泛的重视。
口服疫苗通过胃肠粘膜进行抗原递呈,可经不
同的免疫通路,产生与常规注射类似的免疫反应。
随着医学和分子生物学技术的发展,口服疫苗在粘
膜抗原递呈方面的研究取得了很大的进步,能有效
地诱导机体产生免疫应答和免疫耐受。
1 口服疫苗的优点
口服疫苗与其他途径相比,有一系列的优点。
口服疫苗可直接口服,无须静脉注射给药,避免了
由于静脉注射而导致感染的危险;模仿自然感染途
径,能够保证大部分黏膜表面区域接触疫苗,开发
了由 sIgA介导的第一道防线;高效,即能引起黏膜
免疫反应,也能引起系统免疫反应;口服疫苗也能
诱导全身耐受性,抵抗特异 T细胞介导的迟发性炎
症反应。另外,对一些病原体进行口服免疫可产生
群体免疫,即一小部分个体获得免疫后,免疫可在
群体中传播。口服免疫每天产生的抗体超过 60%分
泌到胃肠道,使许多细菌、病毒和病原体很难经由
身体粘膜表面进入身体组织中。口服免疫经常会同
时引起局部或系统免疫反应,可以有效地消除病原
体。
2 乳酸菌表达系统的特点
近年来,对疫苗传递系统的研究过程中,人们
期待找到一种能够在体内较长时间存在,而对机体
本身既安全又能产生持续免疫力的传递载体。作为
乳酸菌作为口服疫苗载体的研究进展
余丽芸 1 王桂华 1 唐彦君 2
(1黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院,大庆 163319;2黑龙江八一农垦大学食品学院,大庆 163319)
摘 要: 乳酸菌是一类重要的工业菌株,是食品级安全菌。利用乳酸菌作为表达载体制成的口服疫苗安全无毒,乳
酸菌口服疫苗通过胃肠粘膜进行抗原呈递,能诱导机体产生有效的免疫应答和免疫耐受。近年来对于乳酸菌口服疫苗的
研究成为热点,并在此方面取得了突破性成果。
关键词: 乳酸菌 口服疫苗 表达载体
AdvancementofLacticAcidBacteriaasOralVaccine
YuLiyun1 WangGuihua1 TangYanjun2
(1ColegeofLifeScienceandTechnologyHLJAugustFirstLandReclamationUniversity,Daqing163319;2ColegeofFood
ScienceHLJAugustFirstLandReclamationUniversity,Daqing163319)
Abstract: Lacticacidbacteriaareimportantmicroorganism usedinindustry.Antigenpresentingiscompleted
throughamucosalrouteinlacticacidbacteriaoralvaccinewhichiscouldbeappropriateforimmuneactivationaswel
astoleranceinduction.Moreandmoreinterestshavebeenfocusedonthelacticacidbacteriaconsumedasoralvaccine
foroveronedecade.Therefore,manydevelopmentshavebeenachieved.
Keywords: Lacticacidbacteria Oralvaccine Expresionvector
2008年第5期
一种原核表达系统,乳酸菌表达系统在表达外源基
因上有以下特点:(1)某些菌种本身带有大量的染
色体外因子,易于发展新的表达载体系统;(2)易培
养,遗传操作方法成熟、简便,且效率高,重复性好;
(3)本身为食品级细菌,易于构建成食品级的基因
克隆及表达系统,可以有效提高基因工程产品的安
全性;(4)本底表达水平低,表达量较高,易于纯化;
(5)具有强烈的高度可调控的启动子系统,可表达
毒素基因;(6)可在细胞内表达,也可在细胞表面进
行展示表达或分泌到细胞外;(7)乳酸菌安全、没有
内毒素,表达的外源蛋白无需经过纯化,可以直接
连同菌体一起服用;(8)乳酸菌的某些菌株如乳杆
菌对机体粘膜有极强的粘附作用,乳酸菌表达与治
疗或免疫作用的蛋白可以源源不断在粘膜处生产,
持续向机体释放目的抗原蛋白,能有效引起机体的
免疫应答和免疫耐受,提高对人、畜的免疫作用,是
一种极具广泛应用前景的、理想的抗原呈递载体。
3 乳酸菌作为口服疫苗载体的应用研究
近年来,对乳酸菌遗传学方面的研究取得了显
著的进展,导致了一系列关于乳酸菌的基因工程技
术、转化流程、载体系统、整合及扩增系统的快速进
展,并已作为一种新的表达系统成功表达了多种外
源基因。
陈思维等[1]为实现人胰岛素基因在乳酸菌中的
表达,探索其用作口服疫苗治疗Ⅰ型糖尿病
(T1DM)的可行性。将人胰岛素基因克隆至乳酸菌
表达载体中,利用电激转化法导入到干酪乳杆菌中
进行表达。用含有表达重组人胰岛素的菌体饲喂非
肥胖糖尿病小鼠,发现可刺激小鼠产生特异性抗
体,同时使与免疫耐受相关的细胞因子 IL-4水平
明显升高,揭示了其对非肥胖糖尿病小鼠产生免疫
耐受有一定的作用,为研制乳酸菌口服疫苗防治Ⅰ
型糖尿病的可行性进行了有益的探索。杨光等用乳
酸菌表达的白细胞介素 IL-12用于哮喘小鼠,试验
结果表明,携带 IL-12基因乳酸菌鼻腔滴注能引起
代表 Th1反应的 IFN-γ升高,以及代表 Th2反应的
IL-4降低,使 BALF中 EOS数减少。
乳酸菌是一种良好的疫苗活载体,将治疗性蛋
白或抗原传递至黏膜表面,同时诱导粘膜免疫和系
统免疫。细胞表面展示表达技术的出现更是将乳酸
乳球菌疫苗的研制提升到一个新的高度。第一个成
功的例子是 Ribeiro[2]将流产布鲁氏菌的抗原核糖
体蛋白 L7/L12,通过酿脓链球菌 M6蛋白锚表达于
乳酸乳球菌细胞表面,做成口服活疫苗治疗布鲁氏
菌病,开创了治疗布鲁氏菌病的疫苗策略的新方
法。谷贵章等采用金黄色葡萄球菌蛋白 A锚定域
成功地构建了一个将抗原靶向在乳酸乳球菌表面
展示表达系统,为国内口服活菌疫苗的研究提供了
可行性操作平台。国外用破伤风毒素C片段(TTFC)
作模型抗原已获得许多乳酸菌用于免疫接种的知
识,开辟了乳酸杆菌作为活疫苗的真实前景[3]。
预防严重的急性呼吸道综合症(SARS)病毒
感染,诱导黏膜免疫可能是十分重要的。为了安全
有效的将病毒抗原传递到黏膜免疫系统,Lee等[4]
将 SARS-CoVS基因与表达载体连接,通过多聚谷
氨酸合成酶 A蛋白(pgsA)锚定到干酪乳酸杆菌细
胞表面进行展示表达,间接免疫荧光和流式细胞术
检测试验表明重组菌表达蛋白定位于菌体表面。将
重组菌口服和滴鼻免疫小鼠后,不同时间采集小鼠
血液样本,测定其血清中抗 SARS的特异性 IgG抗
体水平,结果表明重组菌能够刺激机体产生明显的
免疫反应,口服和滴鼻免疫没有明显的差异。分别
在 70d和 84d收集肠液和肺液,间接 ELISA检测粘
膜 IgA抗体水平,结果表明无论是在小肠粘液中还
是在肺泡液中均可检测到大量的抗体。更重要的
是,这些抗体可以中和严重的急性呼吸道综合症
(SARS)假病毒粒子,经口免疫的中和抗体反应大
于经鼻免疫。上述结果显示,重组 SARS病毒 S蛋
白干酪乳酸杆菌能够激发抗病毒的保护性免疫反
应。
Hou等[5]将猪流行性腹泻炎病毒(PEDV)N基
因与表达载体连接,通过多聚谷氨酸合成酶 A蛋
白(pgsA)锚定到乳酸杆菌细胞表面进行展示表达,
并将重组菌口服和滴鼻免疫小鼠后,不同时间采集
小鼠血液样本,测定其血清中抗 PEDV的特异性
IgG抗体水平。结果表明重组菌能够刺激机体产生
明显的免疫反应,口服和滴鼻免疫没有明显的差
异。分别在 70d和 84d收集肠液和肺液,间接
ELISA检测粘膜 IgA抗体水平,结果表明无论是在
小肠粘液中还是在肺泡液中均可检测到大量的抗
余丽芸等:乳酸菌作为口服疫苗载体的研究进展 49
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第5期
体。更重要的是,这些抗体可以中和猪流行性腹泻
炎病毒。上述结果显示,重组 PEDV-N蛋白干酪乳
酸杆菌能够激发抗病毒的保护性免疫反应。
复旦大学上海医学院附属妇产科研究所姚晓
英等[6]用表达 hCGβ的活重组乳酸杆菌经阴道黏膜
途径免疫不同品系小鼠,产生抗 hCGβ免疫应答。
取不同剂量的重组乳酸杆菌 LbhCGβ经阴道黏膜
首免 6～8周龄雌性 BALB/c和 C257BL/6小鼠,3周
后以相同剂量加强免疫一次。间接 ELISA检测初次
免疫后 2～8周血清和阴道灌洗液中抗 hCGβIgG和
IgA抗体滴度。分离免疫小鼠脾、子宫和阴道黏膜
的淋巴细胞,流式细胞仪分析其中 B和 T细胞的
增殖情况,ELISPOT分析分泌抗 hCGβIgG和 IgA
抗体的细胞克隆数。结果表明,高剂量接种 Lb
hCGβ可诱导小鼠产生有效的免疫应答;加强免疫
后,高剂量组 LbhCGβ诱导的抗血清中和 hCGβ抗
原的能力大于 100ng/ml。LbhCGβ阴道黏膜免疫后
T和 B细胞增殖;脾脏、子宫及阴道内均存在抗
hCGβIgG及 IgA抗体分泌细胞。因此,重组乳酸杆
菌活疫苗 LbhCGβ可经阴道黏膜免疫诱导有效的
免疫应答,产生的应答与免疫剂量呈正相关。
唐丽杰等将猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基
因与分泌型表达载体连接,并转入乳酸乳球菌细胞
内诱导表达,间接免疫荧光试验表明重组菌表达蛋
白定位于菌体表面。将表达 TGEV-S基因的乳酸乳
球菌口服免疫小鼠后,不同时间测定肠道粪便中抗
体 sIgA的结果表明,重组乳酸乳球菌可有效的刺
激小鼠肠道免疫系统产生特异性免疫应答,能够刺
激机体产生明显的免疫反应,且黏膜免疫水平效果
明显。初步证明了以乳酸乳球菌作为口服疫苗的可
行性。重组菌口服接种小鼠后未见有在增重和食欲
等方面的不良影响,说明重组菌对动物是安全的。
徐义刚等将构建的细胞表面表达和分泌表达猪细
小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌口服免疫BALB/c
小鼠。免疫后不同时间收集免疫小鼠粪便及肠黏液
样本测定小鼠产生抗 PPV的特异性 sIgA抗体水
平,采集小鼠血液样本测定其血清中抗 PPV的特
异性 IgG抗体水平。结果表明,2种表达系统均能
诱导小鼠产生黏膜及系统免疫应答,分泌型的重组
菌系统免疫小鼠诱导机体产生的抗 PPV的特异性
sIgA和 IgG抗体水平高于细胞表面表达型的重组
菌系统的免疫效果,表明分泌型的重组乳酸菌作为
活菌疫苗具有更好的免疫原性。
4 乳酸菌疫苗的展望
首先,乳酸菌作为口服疫苗载体虽然具有很多
优点,但是在乳酸菌疫苗市场化之前仍面临很多问
题。目前可用于构建疫苗的载体菌株仅限于乳酸乳
球菌和乳酸杆菌属中的几个菌株,表达的抗原蛋白
仅限于几种,构建成功的疫苗也不多,开发更多、更
有效的疫苗载体株,构建更多、更有效的疫苗是今
后的一个研究方向。第二,对目前构建的疫苗效果
的研究仅限于动物试验阶段和体外试验阶段,疫苗
的临床应用还需一段时间。第三,口服免疫是益生
菌疫苗的一个重要优势,这要求疫苗菌株要能够经
受人体胃肠道胃酸和胆盐的作用。而且,工程菌在
体内可以存活多久以及乳酸杆菌携带抗原表达的
效果也有待确定。另外,动物及人体肠道的微生态
系统非常复杂,疫苗菌株与其他微生物间是否相互
影响,这种影响是否会削弱疫苗的免疫效果是疫苗
临床应用中应考虑的问题。
参考 文献
1 陈思维,钟瑾,还连栋.微生物学报,2007,47(6):987~991.
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