全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 5期
丙酮破碎法提取重组大肠杆菌
表达的转谷氨酰胺酶酶原
沈徐凯 周斌 王云艳 王斌 杨慧林 潘力
(华南理工大学生物科学与工程学院,广州 510006 )
摘 要: 以茂原链霉菌 ( S trep tomycesm obaraensis )的基因组 DNA为模板, PCR扩增出转谷氨酰胺酶酶原基因 ( protrans
g lutam inase, proTG ) ), PCR产物连接到 pMD18T克隆载体后亚克隆到表达载体 pET22b(+ ), 转化到表达宿主大肠杆菌 BL21
( DE3)。重组大肠杆菌经 IPTG诱导后,转谷氨酰胺酶酶原 ( proTG )主要以可溶性蛋白表达。菌体离心后用丙酮高速搅拌破
碎细胞, 亲和层析成功地纯化到了转谷氨酰胺酶酶原。转谷氨酰胺酶酶原经胰蛋白酶切割激活后其酶活为 5028 U / g CDM
(菌体干重 )。采用 BSA交联试验证实成熟的转谷氨酰胺酶 ( TG )具有功能。采用丙酮破碎法提取重组大肠杆菌表达的转谷
氨酰胺酶酶原对大规模工业化生产转谷氨酰胺酶进行了有益的探索。
关键词: 转谷氨酰胺酶酶原 表达 纯化 丙酮破碎 BSA交联
Extraction of ProTransglutam inase Production in Recombinant
Escherichia coli using Acetone CellBreak
Shen Xuka i Zhou B in W angYunyan W ang Bin YangH uilin Pan L i
( Schoo l of B io science and Bioeng ineering, South China University of T echnology, Guangzhou 510006)
Abstrac:t The protransg lutam inase( proTG ) gene w as obta ined by PCR am plification us ing S trep tomyces m obaraensis genom e
DNA as tem plate and subc loned to the express ion p lasm id pET22b (+ ) by pMD18T vector, then transform ation into E. coli BL21
( DE3) . Recom binant pro te in expression w as induced by IPTG as so lub le form. The cellw as broken by ace tone and purified by a ffin ity
chrom atography. The enzym e activ ity reached 5028 U / g CDM after proTG prote in w as activa ted by trypsin. The BSA po lym eriza tion
confirm ed the ma tureTG has function. A ll that prov ided a c lue to the industria l produc tion o f TG.
Key words: P rotransg lutam inase Expression Pur ification B roken by ace tone BSA po lym eriza tion
收稿日期: 20101102
基金项目:广东省科技攻关项目 ( 2006B13001006)
作者简介:沈徐凯,男,硕士,研究方向:微生物生理及发酵; Em ai:l is. xuka@i m ai.l scut. edu. cn
通讯作者:王斌,男,研究方向:微生物遗传学; Em ai:l w angb in19810621@ 163. com
微生物转谷氨酰胺酶 ( m icrobe transglutam inase,
M TG, EC 23213)是一种催化酰基转移反应的转
移酶,可通过催化蛋白质或多肽中谷氨酰胺基的
转移反应, 使蛋白质或多肽分子间或分子内形成
共价交联, 直接改变蛋白质本身或蛋白质所附着
的细胞、组织等的特性, 从而改变其结构和理化
性质, 甚至带来新的功能。因此, 转谷氨酰胺酶
在工农业、食品、化妆品和医药领域有着极为广
泛的应用 [ 1, 2 ]。
首先转谷氨酰胺酶被应用于畜肉制品中, 可使
肉类中的肌球蛋白 B、肌球蛋白发生聚合, 在热诱导
的肌球蛋白 B凝胶和生香肠肉中, MTG处理后用电
子显微镜可以发现网络结构比对照好 [ 3]。其次, 应
用于乳制品中,可增加凝胶强度,提高奶制品质量,
改善乳蛋白乳化特性,提高乳白的热稳定性,减少乳
制品的脂肪含量等。再次,应用于水产品中,提高水
产品凝胶的持水性、营养价值及提高鱼糜制品的强
度等。此外, 还可应用于固定化技术, 大豆蛋白产
品, 小麦粉制品中等 [ 4]。
国内外在转谷氨酰胺酶特性及应用的研究已经
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 5期
有很多报道,主要利用从动物器官组织中提取的酶
样品进行试验。但由于动物组织来源少、提取工艺
复杂、回收率低、产品成本过于昂贵的缘故, 酶的生
产应用一直受到很大限制。日本 Ando[ 5]报道以茂
原链霉菌发酵法直接生产微生物转谷氨酰胺酶,将
产品大批量投放市场,并获得了一定的经济效益,吸
引了国内外各方的广泛关注和极大兴趣, 但产量仍
远未达到市场要求。随着基因工程技术的发展,用
大肠杆菌来表达外源蛋白成为降低成本的一个选
择。实验室通常采用超声波或者酶法破碎大肠杆
菌,但难以应用于大规模生产。
本试验构建了一株表达转谷氨酰胺酶酶原的重
组大肠杆菌。通过 IPTG诱导成功地获得了可溶性
表达, 并对表达产物进行亲和层析纯化,酶原激活及
酶活测定。本研究采用丙酮破碎法提取大肠杆菌胞
内的 proTG, 制成的干燥粉状菌体有利于生产中的
保存, 且操作起来简便、快捷。只要控制好破壁时
间,同样能收到超声破碎法的效果。粉碎后,要使菌
体足够干燥, 避免残留的丙酮继续作用于 proTG,
使其变性失活 [ 6 ]。为大规模工业化生产转谷氨酰
胺酶提供了有益的探索。
1 材料与方法
11 材料
茂原链霉菌 (Strep tomycesmobaraensis),大肠杆菌
DH5及 BL21( DE3), pET22b(+ )为实验室保藏; LA
Taq酶, pMD18T载体,限制内切酶 Nde I, Xho I购于
宝生物工程 (大连 )有限公司。基因组 DNA提取试剂
盒,质粒提取试剂盒, PCR产物纯化试剂盒, DNA胶
回收试剂盒均购于北京普博欣公司。 PCR引物及
DNA测序均在 Invitrogen完成。NCBZG lnG ly购
于 S igma,其余均为国产分析纯试剂。
12 方法
121 基因组 DNA提取及 PCR扩增酶原基因 采
用细菌基因组 DNA提取试剂盒提取茂原链霉菌的
基因组 DNA, 以基因组 DNA为模板 PCR扩增转谷
氨酰胺酶酶原基因。引物序列见表 1, 分别在上下
游引物序列加入 Nde I和 Xho I酶切位点和相应保
护碱基。PCR反应总体系为 50 L( prem ix LA Taq
25 L,上游引物 1 L,下游引物 1 L,模板 1 L,水
22 L) , 反应程序: 95 预变性 5 m in; 95 变性 30
s, 60 退火 30 s, 72 延伸 75 s,共 30个循环; 72
延伸 10m in。
表 1 PCR扩增引物序列
引物名称 序列 ( 5 3) 酶切位名
proTGsense GCACATATGGACAATGGCGC GGGGGAAG Nde I
proTGant isen se CCGCTCGAGCGGCCAGCCCT GCTTTACC Xho I
122 表达载体的构建 用 PCR产物纯化试剂盒
纯化 proTG基因的 PCR产物后, 与克隆载体 pMD
18T进行连接, 得到 pMD18TproTG质粒并转化到
E. coli DH5中,挑取转化子提取质粒并测序验证。
用 Nde I和 Xho I分别酶切重组质粒 pMD18Tpro
TG和表达载体 pET22b(+ ) ,分别胶回收纯化后, 用
T4 DNA连接酶连接并转化到 E. coli DH5中。随
机挑取转化子提质粒验证, 并将阳性质粒转化到表
达宿主 E. coli BL21 ( DE3) , 此菌株命名为 E. coli
BL21 /proTG。
123 诱导表达 将 E. coli BL21 /proTG接种到
LB液体培养基 (含 Amp, 100mg /L )中, 37 培养过夜
后取 5mL转接到 100mL LB液体培养基中 (含 Amp
100mg /L) 37 振荡培养 ( 200 r /m in)约 2 h后, 待其
OD600达到 06,加入 IPTG至终浓度 06mmol /L,将温
度降低到 24 诱导培养 8 h后离心收集菌体。另一
组未加 IPTG,但其他条件相同作对照。
124 丙酮破碎及纯化 离心收集菌体后, 按菌
体体积的 10倍加入预冷的丙酮 [ 7] ,在研磨缸里手动
研磨约 20 m in; 用磁力搅拌器高速搅打, 转速在
500 r/m in以上, 时间约 30m in; 将破碎后菌体过滤,
碎菌体用风吹干; 再将破碎菌体溶解于缓冲液中
( 100 mmo l/L N aC ,l 30 mmo l/L EDTA )
[ 6 ]
,溶液约为
菌体体积的 10倍, 慢速搅拌约 40 m in;把上述抽提
液用高速离心分离 ( 11 000 r /m in, 15 m in ), 取上清
液既为粗酶液。上清和沉淀分别制备蛋白 SDS
PAGE样品。亲和层析采用 GE公司的 H istag亲和
层析柱,按照标准的操作流程进行。
125 酶原激活及酶活测定 取 05 mL破碎离
心后的上清粗酶液和亲和层析纯化后的纯化酶, 加
入 50 L胰蛋白酶溶液 ( 01 g胰蛋白酶加入到 50
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2011年第 5期 沈徐凯等:丙酮破碎法提取重组大肠杆菌表达的转谷氨酰胺酶酶原
mL pH78的 01 mo l /L C aC l2水溶液中 ), 混匀后
37 水浴 30m in, 即得到成熟的转谷氨酰胺酶。用
C rossow icz比色法 [ 8]测定酶活, NCBZG lnG ly作
为底物,以 L谷氨酸 单羟肟酸作标准曲线。酶活
力单位定义为: 37 时 1m in催化 1 mo lNCBZ
G lnG ly生成 L谷氨酸 单羟肟酸的酶量。
126 成熟 TG的 BSA交联反应 取成熟的 50
L TG,加入到 450 L BSA溶液中 ( 2 mg /mL BSA,
01 mo l/L T risHC l buffer, pH75, 20 mmo l /L
DTT
[ 9]
) ,反应时间设置为 0、2、5、10、15、20和 30
m in,反应后加蛋白上样缓冲液终止反应。
2 结果
21 PCR扩增 proTG及其表达载体的构建
以茂原链霉菌基因组 DNA为模板进行 PCR,扩
增出得到与预计大小相符的 DNA片段,约为 12 kb
左右 (图 1A )。将此 PCR产物与 pMD18T载体连
接后, 用N de I、Xho I双酶切,胶回收目的基因,然后
与经过 Nde I, Xho I双酶切的 pET22b (+ )相连接,
最终构建了表达载体 pET22bproTG。图 1B为
Nde I, Xho I双酶切验证 pET22bproTG的电泳图,
酶切大小约为 12 kb, 与预期相符。 pET22b (+ )表
达载体上有一段信号肽 pelB,可以将蛋白分泌到大
肠杆菌的周质空间。在我们已报道的试验中 [ 9 ] ,将
proTG与信号肽 pe lB融合表达, 但是发现 proTG
主要还是在胞内,并没有分泌到周质空间,而且表达
的蛋白中可溶性的部分与包涵体的部分比例相当。
根据有关文献报道 [ 10] , proTG不与信号肽 pelB融
合表达时, 可溶性比例要高于与信号肽 pe lB融合表
达的。本研究通过用 N ed I切除了 pe lB信号肽,表
达的蛋白存在胞内。
22 诱导表达及丙酮破碎纯化
重组大肠杆菌过夜培养后,转接到 100 mL LB /
500mL摇瓶中培养至对数生长中期加入 IPTG诱导
表达。采用丙酮破碎细胞, 高速离心, 进行 SDS
PAGE电泳检测 proTG的表达情况。如图 2所示,
加入 IPTG后将培养温度降低至 24 培养时进行诱
导表达,收菌破碎后分别将上清和沉淀制成样品,以
未加 IPTG诱导上清为空白。
M. DNA M arker; 1. proTG PCR扩增产物; 2.表达质粒;
3.表达质粒双酶切
图 1 PCR扩增 proTG基因 (A)及
表达载体双酶切鉴定 (B )
M.蛋白分子量标准; 1.对照; 2.上清; 3.沉淀
图 2 proTG诱导表达 SDSPAGE电泳图
23 酶原激活及酶活测定
转谷氨酰胺酶酶原用胰蛋白酶处理后, 可被
激活成成熟的转谷氨酰胺酶, 然后用比色法测其
酶活。酶活数据如表 2所示, 粗提酶为丙酮破碎
离心后的上清液, 纯化酶为粗提酶亲和层析纯化
后的样品,经过亲和层析后, 纯化酶的比酶活是粗
提酶的 89倍。
表 2 酶活分析结果
样品 酶活 ( U /mL) 体积 (mL) 总酶活 (U ) 回收率 (% ) 蛋白浓度 ( mg /mL) 蛋白量 (m g) 比酶活 ( U /m g)
粗提酶 760 1810 13756 100 520 9412 146
纯化酶 3250 380 12350 90 250 950 1300
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24 BSA交联反应结果
为了验证丙酮破碎提取蛋白的活性, 采用 BSA
交联试验验证其成熟 TG的交联特性。以未经反应
的纯化后成熟 TG和 BSA作为对照。如图 3所示,
BSA含量随着时间的增加慢慢变少, BSA交联成的
大分子停滞在进样孔上。
M.蛋白分子量标准; 1. MTG; 2. BSA; 3- 9. 成熟 TG的
BSA交联时间分别为 0, 2, 5, 10, 15, 20, 30 m in
图 3 成熟 TG的 BSA交联
3 讨论
茂原链霉菌是少数几种可分泌转谷氨酰胺酶的
菌种, 但在自然状态下该菌分泌的转谷氨酰胺酶的
产量很低。目前,转谷氨酰胺酶已广泛应用于工农
业、食品、化妆品和医药领域中,因此,需要筛选高产
菌株或者通过基因工程手段来提高 MTG产量。
本研究构建了一株大肠杆菌基因工程菌, 实现
了转谷氨酰胺酶酶原蛋白在大肠杆菌中的可溶性表
达,为生产更廉价的 MTG提供了新的方法。此外,
考虑到普通超声波破碎法在实现大规模生产应用上
的局限性,本研究尝试有机溶剂丙酮破碎法, 通过
BSA交联试验验证了通过此方法提取的转谷氨酰
胺酶具有活性,为大规模工业化生产转谷氨酰胺酶
提供了有益的探索。
参 考 文 献
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(责任编辑 马鑫 )
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