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生物技术通报
B IO TECHNOLO GY　BULL ETIN 2009年第 9期
无机焦磷酸化酶基因转化甘蔗的遗传研究
赵丽宏　王俊刚　杨本鹏　张树珍　黄东杰　蔡文伟
(中国热带农业科学院热带生物技术研究所 农业部热带作物生物技术重点开放实验室 ,海口 571101)
　　摘 　要 : 　甘蔗是我国最为重要的糖料作物 ,也是一种重要的能源作物 ,提高甘蔗的含糖量是甘蔗育种的主要目标。通
过农杆菌介导法将无机焦磷酸化酶 ( PPase)基因导入甘蔗 ,以期获得提高蔗糖含量的转基因植株。经过 PPT抗性筛选获得 72
株抗性植株 ,并对其进行 PPase基因和 bar筛选标记基因的双重 PCR检测 ,其中有 13株都呈阳性。结果初步证明无机焦磷酸
化酶基因已整合到甘蔗的基因组中。
关键词 : 　甘蔗 　无机焦磷酸化酶基因 　遗传转化
Genetic Transformation of Inorgan ic Pyrophosphatase Gene of Sugarcane
Zhao L ihong　W ang Jungang　Yang Benpeng　Zhang Shuzhen　Huang Dongjie　Cai W enwei
( Key Laboratory of Tropical Crop B iotechnology, M inistry of Agriculture, Institu te of Tropical B ioscience and B iotechnology,
Chinese Academ y of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101)
　　Abs trac t: 　Sugarcane is the most important of sugar crop s in China and still an key potential energy crop s. Increasing sugar con2
tent in sugarcane is a main objective of sugarcane breeding. In this study, transgenic p lants with high sugar content was to be obtained
by transform ing inorganic pyrophosphorylase ( PPase) gene into sugar cane via A grobacterium mediation. The transformed shoots were
screened under the selective p ressure of PPT and 72 resistant shoots were obtained. 13 transgenic p lants were confirmed by using the
method of PCR through amp lifying PPase gene and bar gene simultaneously from obtained resistant shoots. Thus, it showed that the
PPase gene was integrated into the sugarcane genome.
Key wo rds: 　Sugarcane　 Inorganic pyrophosphatase gene　Genetic transformation
收稿日期 : 2009205217
基金项目 :国家自然科学基金 (30660097) ,中央级公益科研院所基本科研业务费 ,现代农业产业技术体系建设专项资金
作者简介 :赵丽宏 (19782) ,女 ,硕士研究生 ,研究方向 :植物转基因 ; E2mail: zhaolihongjs123@163. com
通讯作者 :杨本鹏 (19652) ,男 ,副研究员 ,硕士生导师 ,研究方向 :种质资源的研究与利用 ; Tel: 0898266986392, E2mail: y2bp@163. com　　甘蔗 (S accharum off icinarum L. )是我国最为重要的糖料作物 ,也是一种重要的能源作物 ,提高甘蔗的含糖量是甘蔗育种的主要目标。与其他作物一样 ,甘蔗中蔗糖含量的提高主要是通过常规育种调节有机碳的分配来实现的。1997年 Moore等 [ 1 ]研究表明 ,理论上甘蔗茎中蔗糖含量可占甘蔗鲜重的25%以上 ,与 Bull和 Glaszion[ 2 ]的推断是一致的 ,而生产上甘蔗中蔗糖的含量仅约为理论值的一半。由于甘蔗的繁殖系数大 ,遗传背景复杂 ,而全国甘蔗的种质资源又十分有限 ,要进一步提高甘蔗的含糖量是非常困难的。因此 ,利用基因工程技术进行甘蔗含糖量提高的改良具有很重要的意义。无机焦磷酸化酶 ( PPase)催化焦磷酸分解为磷 酸 ,是蔗糖合成途径的调控点之一。蔗糖的合成是在甘蔗的叶肉细胞中进行的 ,其合成过程中会产生大量的焦磷酸 ,而焦磷酸在叶肉细胞中积累不利于蔗糖的合成。因此 ,将无机焦磷酸化酶基因导入甘蔗中使其在叶肉细胞中有效的表达 ,将有利于蔗糖的合成 ,进而提高甘蔗的蔗糖含量。目前 ,德国科学家已将 PPase基因克隆到高效表达载体并转入烟草和马铃薯中 ,与野生型相比 ,其蔗糖含量增加了 2～10倍 [ 3 ] ,但在甘蔗上未见报道。本试验将从酵母中克隆的无机焦磷酸化酶基因连接叶肉细胞特异表达启动子 rbcs一起导入甘蔗基因组中 ,初步鉴定 , PPase基因克以整合到甘蔗的基因组中 ,以期从分子育种角度探讨培育高糖甘蔗新品
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 9期
种的可能性。
1　材料与方法
111　试验材料
11111　植物表达载体 pCB IPR (以 rbcs启动子驱动
PPase基因 )由本实验室保存 ;转化材料为甘蔗 (Sac2
charum off icinarum L. )品种 ROC22,由本实验室提供。
11112　甘蔗所用转化培养基 　①胚性愈伤组织诱
导培养基 (M1) :MS + 2, 42D 1 mg/L +蔗糖 30 g/L +
卡拉胶 8 g/L , pH518; ②胚状体分化培养基 (M2) :
MS + 62BA 1 mg/L + KT 015 mg/L +蔗糖 30 g/L +
卡拉胶 8 g/L , pH518; ③分化培养基 (M3) : MS + 62
BA 1 mg/L +蔗糖 30 g/L +卡拉胶 8 g /L , pH518; ④
壮苗培养基 (M4) : MS + IBA 5 mg/L +蔗糖 30 g /L
+卡拉胶 8 g /L , pH518; ⑤生根诱导培养基 (M5) :
MS(大量元素减半 ,其它成分不变 ) + NAA 2 mg/L
+蔗糖 20 g/L +椰水 100 m l/L +卡拉胶 8 g/L +活
性炭 012 g/L , pH518; ⑥转化用液体培养基 (MR ) :
1 /5 MS大量元素 +MS其他成分 + 2, 42D 1 mg/L +
10 mmol/L果糖 + 10 mmol/L葡萄糖 + 30 g/L蔗糖
(固体培养基应加入卡拉胶 8 g /L) , pH513。
112　甘蔗遗传转化的方法
11211　植物表达载体 pCB IPR的活化与鉴定 　取出
保存在 - 70℃冰箱含有植物表达载体 pCB IPR (以
rbcs启动子驱动 PPase基因 )的农杆菌菌液 ,在含链
霉素 ( Str) ,卡那霉素 ( Km) ,利福平 (R if)的 YEP培养
基中进行活化 ,划线待形成单菌落后 ,随机挑取 4个
单菌落进行菌落的 PPase基因 PCR,引物为 PPaseA1 /
PPaseA2。
11212　愈伤组织的准备 　选生长健壮的植株 ,取其
尾稍部分 ,逐层剥去外层老叶 ,取其距离顶端生长点
约 10 cm左右的幼叶组织作为外植体 ,先用 75%的
酒精浸泡 30 s后 ,再用 011%的升汞处理 8 ～10
m in,用无菌水洗 3～4次后 ,放于无菌的报纸上 ,将
其横切成 012～015 mm厚的薄片接种于 M1固体培
养基上 , 25℃黑暗培养。22 d左右长可长出胚性愈
伤组织。挑选具有黄白色颗粒突起 ,表面高低不平 ,
颜色鲜艳 ,有光泽 ,质地坚实 ,较硬的颗粒状愈伤组
织来供甘蔗的遗传转化用。
11213　农杆菌菌液的准备 　从农杆菌保存的平板
上挑取单菌落接种到 5 m l YEP (含有 Kan 50μg/
m l, Str 25μg /m l, R if 25μg/m l)的液体培养基中 ,于
28℃, 200 r/m in振荡培养约 24 h,然后转摇至 40 m l
含有相同抗生素的 YEP培养基中 ,培养至 OD值为
016左右 ,转移到离心管中 , 4℃, 5 000 r/m in离心 5
m in,倒掉上清 ,吸干残液 ,用含 150μmol/L的 AS的
等体积的 MR液体培养基重悬细菌 ,于 28℃ 200 r/
m in激活 2 h,诱导细菌 V ir基因的表达 ,作为转化材
料的侵染液。
11214　农杆菌菌液浸染愈伤组织及共培养 　首先
将农杆菌培养基摇至 OD600为 015～016时 ,离心收
集菌体 ,然后用含 150μmol/L AS的 MR液体培养
基重悬并在 28℃摇床上预表达 2 h,接着将胚性愈
伤组织在工程菌液中浸染 30 m in左右。随后将浸
染后稍晾干的愈伤组织转入含 100μmol/L AS的
MR固体培养基中共培养 4 d,然后把共培养后的愈
伤组织转移到 M2培养基上 ,约 15 d后转接到 M3
培养基上 ,在这期间需要经常剔除褐化和被农杆菌
污染的愈伤组织块 ,于 28℃光照培养 15 d左右后发
现愈伤组织表面的不同部位出现绿色小芽点 ,绿点
渐渐分化出芽 ,然后开始成苗。
113　农杆菌侵染后的愈伤组织分化成苗
11311　甘蔗幼苗 PPT的筛选试验 　将 M3分化培
养基上生长良好的分化苗转接到分别含 PPT浓度
为 0、118、210、215、310 mg/L的一系列 M4固体培
养基上 , 25℃光照培养 ,根据绿苗的生长和分化情况
确定 PPT的筛选浓度。
11312　甘蔗小苗 PPT筛选试验 　在 M5培养基中
添加 PPT作为敏感性试验 ,其浓度梯度为 010、
310、315、410 mg /L。将长至 3～5 cm左右的小苗
接种到 M5含 PPT选择压的培养基上 ,观察甘蔗苗
在不同 PPT浓度下的生根情况 ,以确定生根筛选
浓度。
114　转化植株的分子检测
采用 CTAB法提取甘蔗叶片的总 DNA [ 4 ] ,用转
化植株总 DNA为模板 ,未转化植株为负对照 ,用植
物表达载体 pCB IPR所提取的质粒为正对照 ,根据
所转入的目的基因无机焦磷酸化酶 ( PPase)和筛选
标记基因 bar设计引物进行 PCR扩增。 PCR引物
如表 1。
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2009年第 9期 赵丽宏等 :无机焦磷酸化酶基因转化甘蔗的遗传研究
表 1　引物序列
引物名称 序列 (5′→3′)
PPaseA1 CAATTTACTAATGACCTACACT
PPaseA2 TCATTTTCAATTCAAAATATTTT
PPaseB1 TGGTCAAATCAATACCCTTGCTGTC
PPaseB2 GACACCAAGAAGGGCAAGTTGAGAT
bar1 CGGATGAGCCCAGAACGACGCCC
bar2 CGGTCAGATCTCGGTGACGGGCAG
PCR反应程序 : (1)预变性 94℃, 5 m in;变性为
94℃, 30 s;退火 51℃, 30 s; 72℃延伸 115 m in;进行
30个循环 ,最后 72℃,延伸 10 m in, 4℃保存。 ( 2 )
预变性 94℃, 5 m in; 94℃变性 , 1 m in; 60℃退火 , 1
m in; 72℃延伸 1 m in;进行 30个循环 ,最后 72℃,延
伸 7 m in, 4℃保存。
2　结果与分析
211　植物表达载体 pCB IPR的活化与鉴定
取出保存在 - 70℃冰箱含有植物表达载体
pCB IPR (以 rbcs启动子驱动 PPase基因 )的农杆菌
菌液 ,在含链霉素 ( Str) ,卡那霉素 ( Km ) ,利福平
(R if)的 YEP培养基中进行活化。划线待形成单菌
落后 ,随机挑取 4个单菌落进行菌落的 PPase基因
PCR (引物为 PPaseA1 /PPaseA2)鉴定 ,其扩增片段
大小为 864 bp 左右 ,结果如图 1。说明获得的含
pCB IPR植物表达载体的 EHA105菌株是正确的。
M. 100bp Ladder DNA marker;
CK + . 质粒 pCB IPR; CK - . 未转化的 EHA105; 1～4. 单菌落
图 1　植物表达载体 pCB IPR的菌液 PCR鉴定
212　甘蔗幼苗 PPT抗性筛选
将刚分化的小苗转接到含有不同 PPT浓度梯
度的 M3培养基上 ,于光照培养箱中培养。半个月
后观察发现 ,当 PPT浓度为 0 mg/L时 ,小苗继续生
长 ,颜色鲜绿 ;当 PPT浓度为 118 mg/L时 ,开始褐
化死亡 ,随着 PPT浓度的提高 ,褐化死亡就越严重。
当 PPT浓度达到 310 mg/L时 ,大部分小苗已经褐
化死亡 ,只有少数几棵存活 (图 2)。所以 ,在对刚分
化的小苗筛选时用 310 mg/L作为筛选浓度。
PPT筛选浓度分别是 A1010 mg/L; B. 118 mg/L;
C. 210 mg/L; D. 215 mg/L; E. 310 mg/L
图 2　甘蔗愈伤组织分化成苗的 PPT抗性筛
213　甘蔗小苗 PPT抗性筛选
PPT的筛选浓度分别是 A. 010 mg/L; B1310 mg/L;
C1315 mg/L; D1410 mg/L
图 3　甘蔗苗的 PPT抗性筛选
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 9期
把一直生长在 M4的小苗转接到含不同 PPT浓
度的 M5培养基上。光照培养 15 d左右发现 ,当
PPT浓度为 0 mg/L时 ,小苗明显比以前长高 ,并且
开始有根生长 ;当 PPT浓度为 310 mg/L时 ,有少数
小苗黄花死亡 ,大部分还是绿色 ;当 PPT浓度达到
315 mg/L时 ,根部变黑褐色 ,只有少数几株存活 ;但
当 PPT浓度达到 410 mg/L时 ,根部变黑褐色 ,几乎
没有存活的植株 (图 3)。所以在进行生根筛选时 ,
以 315 mg/L作为筛选浓度。将 PPT抗性筛选所得
到的抗性植株转入 M5培养基中诱导生根 ,最后将
其抗性植株种在沙床上炼苗 (图 4)。
图 4　抗性植株
214　植株的 PCR检测
21411　植株 ba r基因的 PCR检测 　根据筛选标记
基因 ba r的系列 ,设计 bar1 /bar2引物 ,以所提 72株
抗性植株的 DNA为模版进行 PCR检测 ,同时设立
阳性对照 ( PPase基因的质粒 pCB IPR )和阴性对照
(未转化甘蔗基因组的 DNA)。共有 13株能扩增到
与预期 bar基因片段大小一致的条带 ,集中这 13株
进行重复 PCR检测 ,结果如图 5。初步证明 ba r基
因已经整合到甘蔗基因组中。
CK + 1质粒 pCB IPR;M1DNALadder; CK1未转化植株的
PCR扩增 ; 1～131抗性植株的 PCR扩增
图 5　抗性苗的 ba r基因检测
21412　抗性植株 PPase基因的 PCR检测 　根据目
的基因 ( PPase)的系列 ,设计 PPaseB1 /PPaseB2 引
物 ,以所提 72株抗性植株的 DNA为模版进行 PCR
检测 ,同时设立阳性对照 (质粒 pCB IPR )和阴性对
照 (未转化植株的 DNA )。共有 13株能扩增到与预
期 PPase基因片段大小一致的条带 ,集中这 13株进
行重复 PCR检测 ,结果如图 6。初步证明 PPase基
因已经整合到甘蔗基因组中。
CK + 1质粒 pCB IPR;M1DNALadder; CK - 1未转化植
株的 PCR扩增 ; 1～131抗性植株的 PCR扩增
图 6　抗性苗的 PPa se基因的检测
3　讨论
目前 , Sonnewald 等 [ 5 ] 已将无机焦磷酸化酶
( PPase)基因与组成型启动子 ( 35S)组成嵌合表达
载体转入马铃薯和烟草中 ,与野生型相比 ,转基因植
株源叶片中可溶性糖与淀粉的比例增加了 2～3倍。
在转基因烟草的源叶片中 ,葡萄糖含量提高 68倍 ,
果糖提高 24倍 ,蔗糖提高 12倍 ,淀粉提高 8倍 ;这
一结果没有在马铃薯中出现 ,在马铃薯中碳水同化
产物分配的改变是因为蔗糖提高了 2倍 ,淀粉含量
降低。转基因的植株矮化 ,节间变短 ,无机焦磷酸
( PPi)的含量下降 ,老叶片中可溶性糖的含量是野
生型的 100倍 [ 6 ]。造成转基因植株矮化的原因推测
可能是应用的启动子是组成型启动子。
本研究将叶肉细胞特异表达 rbcs启动子驱动
PPase基因进行甘蔗的遗传转化 ,而该启动子不仅
可以在转基因甘蔗叶片中表达 ,增加碳水同化物向
蔗糖转化的目标基因 ,而且还可以克服利用组成性
表达启动子导致蔗糖运输受阻 ,植物矮化的现象 ,显
示出极好的转基因育种应用价值。
在甘蔗的遗传转化过程中 ,抗性筛选是很重要
的 ,若没有一个很高效的筛选体系 ,会使众多未转化
的假阳性植株存活 ,直到最后进行分子检测时才能
辨别 ,大大增加了研究的工作量。本研究主要以甘
蔗 ROC22为转化受体 , EHA105为转化的农杆菌菌
株 ,抗 PPT的 bar基因为筛选 , rbcs启动子驱动无机
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2009年第 9期 赵丽宏等 :无机焦磷酸化酶基因转化甘蔗的遗传研究
焦磷酸化酶 ( PPase)基因为目的基因 ,然后对甘蔗
进行遗传转化。具有 PPT抗性的转化细胞在筛选
培养基上能够生存增值 ;未转化细胞在筛选培养基
上生长受抑制或被杀死。根据本试验的研究结果 ,
甘蔗在发芽成苗期即对应于组织培养中的分化成苗
期 ,对 PPT比较敏感。依据甘蔗不同基因型 , PPT有
效筛选浓度范围在 118～3145 mg/L。在筛选培养
基上培养 10 d左右 ,非转花苗就有明显的白化表现
或生长不良现象 ;筛选培养 30 d后仍为绿色生根正
常的苗 ,几乎不存在转化假阳性问题。在本试验中 ,
经过 PPT抗性筛选获得了 72株抗性植株 ,并对其
进行 PPase基因和 bar筛选标记基因的双重 PCR检
测 ,其中有 13株都呈阳性 ,结果初步证明无机焦磷
酸化酶基因已整合到甘蔗的基因组中。下一步将对
转基因植株中外源基因的表达、遗传稳定性分析和
生理变化做进一步的检测。
参 考 文 献
1　Moore PH, Botha FC, Furbank RT, Grof CPL, Potential for Overco2
m ing Physico2biochem ical L im its to Sucrose Accumulation, In: Keat2
ing BA, W ilson JR ( eds) . Intensive Sugarcane Production: Meeting
the Challenges Beyond 2000, W allingford: CAB Int, 1997, 141
～155.
2　Bull TA, Glasziou KT. Aust J B iol Sci, 1963, 16: 737～742.
3　黄东杰 ,张树珍 ,冯翠莲 ,顾丽红. 热带作物学报 , 2007, 28 ( 2) : 67
～73.
4　李明刚 ,植物基因操作原理与技术手册. 天津 :天津科学技术出
版社 , 2000, 300～301.
5　Sonnewald U. Plant J, 1992, 2: 571～581.
6　司丽珍 ,储成才. 中国生物工程杂志 , 2003, 23 (1) : 11～29.
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