全 文 ：
研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2010年第 9期
金葡菌肠毒素促鸡淋巴细胞增殖及
增强疫苗效价的初步探讨
冯永宁 1, 2 张惠文 1 徐明恺1 徐威2 张成刚 1
( 1中国科学院沈阳应用生态研究所,沈阳 110016;
2沈阳药科大学 生命科学与生物制药学院,沈阳 110016)


摘
要:
为了探讨了金黄色葡萄球菌肠毒素 C2 ( rSEC2)作为家禽免疫增强剂的可行性, 利用 MTT比色法, 研究了
rSEC2对体外培养的鸡脾脏淋巴细胞的增殖影响; 利用微量凝集抑制试验 (H I), 研究了连续口服 rSEC2对家禽疫苗免疫效果
的影响。试验结果表明, 最低浓度为 1 ng /mL的 rSEC2即可在无 C onA情况下显著提高淋巴细胞活性, 浓度梯度组间差异显
著, 存在剂量依赖性;对点眼免疫新城疫 ( ND )减毒疫苗的鸡群进行抗体检测结果显示 ,给药组明显高于对照组, 且延长了抗
体持续时间。证明了 rSEC2可有效激活家禽免疫系统,并有可能作为免疫增强剂而应用于家禽饲养。
关键词:
鸡
金黄色葡萄球菌肠毒素 C2
淋巴细胞增殖 血凝抑制试验
Effects of Staphylococcal Enterotoxin C2 on Proliferation of
Chicken Spleniclym Phocytes Cultured in vitro and
Enhancement of ND Vaccine
Feng Yongn ing
1, 2
ZhangH uiw en1
XuM ingkai1
XuW ei2
Zhang Chenggang1
(
1
Institute of App lied Ecology ChineseA cademy of Science, Shenyang 110016;
2
College of B iology and B iopharmaceutical Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016)


Abstrac:t
Feasibility o f staphy lococca l entero tox in C2 ( rSEC2 ) as an immunopo tentiators in poultry w as evalua ted. E ffects of
rSEC2 on the pro liferation of ch icken sp len ic lym phocytes and enhancem ent o f live New castle disease was tested byMTT co lorim e try
and H I test, respectively. The results show ed that treatm ents w ith m inim a l 1 ng /mL o f rSEC2 fo r 48 h prom oted the pro life ration of
ch icken splenic 1ymphocytes in v itro s ignificantly in the absence of concanava lin ( C onA ), and the prom otion effec t o f rSEC2 is o f a
dose
depended m anner. The live ND vacc ineH I test show ed that oral adm in istration rSEC2 increased the peak concen tra tion and pro

long the duration of antibod ies in chicken serum. The resu lts showed the possibility o f rSEC2 as an imm unopotentiators in pou ltry.
Key words:
Ch icken rSEC2 Lym phocy tes pro liferation H I test
收稿日期: 2010
02
04
作者简介:冯永宁,男,硕士,研究方向:超抗原的药理学研究; E
m ai:l fengyongn ing@ gm ai.l com
通讯作者:徐明恺,副研究员,研究方向:蛋白质结构与功能; E
m ai:l mkxu@ iae. ac. cn
徐威,教授,研究方向:抗生素产生菌的基因工程; E
m ai:l shxuw ei8720@ 163. com
超抗原 ( superan tigen )是无需抗原递呈细胞
(APC)加工,能直接引起高效免疫活性的一类来源
于细菌或病毒的蛋白质。金黄色葡萄球菌肠毒素
( SE s)属于细菌超抗原, 它是由葡萄球菌分泌的一
类结构和功能相似的蛋白家族 [ 1]。 SEs结合主要组
织相容性复合物 ( MHC )
的方式与普通异种抗原
不同, 它与 MHC
分子外侧结合, 然后激活带有特
异 T细胞受体 ( TCR) V
链的 T细胞大量增殖 [ 2, 3]。
因此, 少量的 SE s即可刺激大量 T 细胞活化, 从
而产生大量细胞因子 [ 4, 5 ]。到目前为止已经鉴定
出的 SE s血清型 10余种, 并且陆续有新的血清
型被发现, SEC是其中研究较早的一型。 SEC存
在 3个亚型 SEC1、SEC2和 SEC3, 三者同源性极
高。已有国内学者完成 SEC2的克隆表达和构效
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2010年第 9期
关系研究 [ 6, 7 ]。
国内外的研究主要集中于 SEs导致的食物中毒
和畜禽疾病上,近年来应用其超抗原介导的细胞毒
作用 ( SDCC )进行了大量抗肿瘤研究。基于 SE s超
抗原活性,以及其对不同种属动物的活性差异,本研
究着力于 SEC2对较低等的家禽脾淋巴细胞的增殖
影响研究, 探究其作为家禽免疫增强剂的科学性。
并依照其作用机理,在家禽免疫前后,合适剂量口服
给以 SEC2,以凝集抑制试验 (H I)检测抗体表达水
平,验证其作为免疫增强剂的可行性。
1
材料与方法
1
1
材料
1
1
1
主要试剂 基因工程重组表达的金黄色葡
萄球菌肠毒素 C2( rSEC2)本实验室制备; 胎牛血清
为杭州四季青公司产品; RPM I
1640培养基为 GIB

CO公司产品; 刀豆蛋白 ( ConA )和四甲基偶氮唑盐
(MTT)为 Sigma公司产品; 家禽淋巴细胞分离液
( d= 1
090)为中国医学科学院血液学研究所产品;
新城疫
系 Lasota减毒活疫苗购自 ABIC ( Lo :t
204568A1) ;新城疫标准抗原及标准血清均购自青
岛万邦生物技术公司。
1
1
2
主要仪器 加湿 CO2培养箱 ( Harasaw a
W J

3)倒置显微镜 ( O lympus
IM )酶标仪 ( InterM ed
N J

2100)。
1
1
3
试验动物 1日龄健康 AA肉雏鸡, 购自辽
宁省沈阳伟峰种鸡场。
1
2
方法
1
2
1
鸡脾淋巴细胞的分离与培养 7至 14日龄
雏鸡放血致死后, 无菌条件下取脾脏, 用灭菌 PBS
冲洗数次,去膜、清洗、剪碎,置于 200目不锈钢筛网
上,研磨挤压; PBS稀释后用淋巴细胞分层液分离淋
巴细胞, 1 000 r /m in离心 10 m in, 收集中间层白色
絮状淋巴细胞, 经用 PBS清洗 3次, 用适量含
100mL /L灭活小牛血清以及 100 IU /mL青霉素与
链霉素的 RPM I
1640重悬细胞;取少量脾淋巴细胞
涂于玻片, 用改良快速瑞氏
姬姆萨染色液染色,从
细胞的形状、染色特性对鸡脾淋巴细胞进行初步鉴
定,然后用台盼蓝法进行细胞活力测定,计数; 置于
40
、50 mL /L CO2、饱和湿度培养箱中培养。
1
2
2
重组金黄色葡萄球菌肠毒素 C2( rSEC2)对
鸡脾淋巴细胞增殖转化的影响 [ 8]
将细胞浓度调
整为 5
106 /mL,并以 0
1mL /孔接种至 96孔细胞
培养板上,设 1个对照组、5个处理组和一个阳性对
照组, 每组 4个复孔。对照组加入 100
L RPM I

1640培养液 (含 100 mL /L小牛血清、青、链霉素各
100 IU /mL和 HEPES),阳性对照组加入含 10
g /mL
C onA的 RPM I
1640培养液, 处理组分别用含有
1 ng /mL、10 ng /mL 和 100 ng /mL、10
g /mL、100

g /mL rSEC2的 RPM I
1640培养液培养细胞, 培养
48 h。培养结束前 4 h加入 20
g /mL MTT 30
L,
培养结束时 1 500 r/m in离心 10 m in, 小心吸弃上
清, 加入 DMSO 100
L, 振荡 10 m in以溶解甲臢颗
粒, 通过酶标仪以检测波长 570 nm, 参比波长 630
nm条件下检测吸光值。试验结果以增殖指数 ( P I)
表示: P I=试验组吸光值 /阴性对照组吸光值。
1
2
3
口服重组金黄色葡萄球菌肠毒素 C2( rSEC2)
对 ND减毒疫苗免疫效果的影响 将 40只 1日龄
AA肉雏鸡随机分为空白组和试验组,均按常规方法
饲养,饲喂相同的全价肉鸡饲料。均于 10日龄滴鼻
点眼免疫新城疫减毒活疫苗,试验组自免疫前一天
开始隔天灌服含 1
5 mg /mL rSEC2 0
2 mL, 同时
空白组灌服相同体积生理盐水, 共服用 3次。分
别在首免前 1 d和首免后第 7、14、21、28 d每组随
机抽取 8羽鸡, 翼下静脉采血, 分离血清, 用血凝
抑制试验 ( H I)测抗体效价, 求每组平均值, 结果以
x log2表示。
1
2
4
数据统计与处理方法 所得数据采用
SPSS11
5统计处理软件进行方差分析, 用邓肯氏新
复极差法进行多重比较和独立样本 t检验。
2
结果
2
1
rSEC2对鸡脾淋巴细胞增殖转化的影响
在无需 ConA诱导刺激下, 与阴性对照组相比,
1 ng /mL浓度的 rSEC2即可显著刺激鸡脾淋巴细胞
产生增殖 (P < 0
05) , 10 ng及以上浓度组对淋巴细
胞增殖作用极显著 (P < 0
001), 不同剂量组间差异
显著 (P < 0
05) ,但各剂量组细胞增殖能力均低于
阳性 ( ConA )对照组 (表 1)。由给药浓度细胞增殖
曲线 (图 1)可以看出, rSEC2对细胞作用存在剂量
依赖性,但非线性。
166
2010年第 9期



冯永宁等:金葡菌肠毒素促鸡淋巴细胞增殖及增强疫苗效价的初步探讨
表 1
rSEC2对体外培养的鸡脾淋巴细胞增殖转化的影响
组别 n 吸光值
空白组 4 0
185
0
019
1 ng /mL 4 0
218
0
007 a
10 ng /mL 4 0
256
0
008b
100 ng /m L 4 0
311
0
015b
10
g /mL 4 0
358
0
018b
1 000
g /mL 4 0
420
0
025b
C onA组 4 0
462
0
038b
n表示重复;小写字母表示各处理组与空白组相比较差异显著
( a
P < 0
05, b
P < 0
001)
图 1
rSEC2促进鸡脾脏淋巴细胞增殖情况的分析
2
2
口服 rSEC2对 ND减毒活疫苗免疫效果影响
免疫后给药组较对照组存在显著差异 ( P <
0
05) ,给药组 ND抗体效价高于对照组,且抗体持
续时间延长。由结果 (表 2)可以看到, rSEC2口服
后增强了动物机体对疫苗的免疫应答, 且可使血液
中的抗体水平较长期地维持在较高的水平, 两组均
在免疫后第一周即达峰值,但给药组延续时间更长。
由前期的剂量安全性试验 (试验数据未给出 )可知,
本次试验所给剂量适中,完全在安全剂量范围内。
表 2
两组鸡不同时间平均血清抗体效价 ( x log2)
免疫前
1 d
免疫后
7 d
免疫后
14 d
免疫后
21 d
免疫后
28 d
对照组 3
7 5
9 5
4 2 1
9
给药组 3
7 6
5 6
5 4
6 3
9
3
讨论
SE s通过与 APC和 T细胞形成 TCR
Sag
MHC
复合物, 刺激 T细胞大量增殖。由于 SEs存在对
TCR的 V
区识别的特异性, 如 SEC2与鼠 V
8+、
V
10+等特异性结合; 同时与人 V
12+、V
13+等进
行特异性结合 [ 4, 9]。另外,不同种属的 T细胞其 V

特异性存在很大差别。以上因素导致 SEs超抗原活
性存在种属差异。通过鸡脾脏淋巴细胞增殖试验可
以得出, SEC2对家禽 T细胞同样存在强的超抗原活
性, 在体外环境下 1 ng /mL剂量下即可显著刺激 T
细胞增殖。此外, 与 SEC2对鼠 T淋巴细胞影响相
比 [ 6] , SEC2对家禽 T淋巴细胞刺激作用较弱, 0
1
ng /mL即可刺激鼠淋巴细胞显著增殖。 SEC2的超
抗原活性与其毒性存在某种程度的正相关 [ 6] , 这也
使得 SEC2作为禽用免疫增强剂具有较大的安全剂
量范围, 预试验结果表明, 1日龄雏鸡口服 1 mg
SEC2无病态反应, 1周龄解剖无主要脏器损伤; 但
与中药免疫增强剂、左旋咪唑类及其他细胞因子类
相比 [ 10
12 ] , SEC2无需 ConA诱导就可以显著提高细
胞增殖活性。
SE s体内刺激鼠 T淋巴细胞后 90m in内即可诱
导 IL
2达到峰值, 4 h内 IFN

、IL
4、IL
10分泌达
到峰值, 24 h恢复正常值; 3周后血清中 Ig水平明显
高于对照组 [ 5]。可见 SEs提高机体免疫的特点是作
用迅速,作用时间短,但由于免疫系统的级联放大效
应,其对整个免疫系统的影响持续时间较长。本试
验选用减毒疫苗进行黏膜免疫, 此疫苗作用于黏膜
后 24 h内繁殖并刺激黏膜免疫系统产生免疫应答,
与本样品的作用时间相吻合,达到最佳效果。另外,
前期的稳定性试验结果表明, rSEC2可以耐受较低
的 pH值,及一定浓度的胰蛋白酶水解, 说明其对动
物消化道环境具有一定抗性, 因此口服给药方式是
可行的。通过试验数据可以看出, 口服连续给药方
式提升了新城疫监督疫苗的免疫效果,并且延长了
抗体保护时间。
本试验仅是对 SEC2作为禽类免疫增强剂的初
步探讨,关于其作用机理的具体路径还有待于进一
步的研究。
参 考 文 献
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2和 IL
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170
174.

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