全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2016, 42(4): 501512 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-20), 国家公益性行业(农业)科研专项(201503119)和福建省高等学校新世纪优秀
人才支持计划(JA14095)资助。
This study was supported by the China Agriculture Research System (CARS-20), the Special Fund for Agro-Scientific Research in the Public
Interest (201503119), and the Program for New Century Excellent Talents in Fujian Province University (JA14095).
* 通讯作者(Corresponding author): 阙友雄, E-mail: queyouxiong@126.com
第一作者联系方式: 刘峰, E-mail: 760733016@qq.com; 苏炜华, E-mail: 410946470@qq.com
Received(收稿日期): 2015-09-07; Accepted(接受日期): 2016-01-11; Published online(网络出版日期): 2016-01-19.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160119.1327.002.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2016.00501
甘蔗 Na+/H+逆转运蛋白基因的克隆与表达分析
刘 峰 苏炜华 黄 珑 肖新换 黄 宁 凌 辉 苏亚春
张 华 阙友雄
福建农林大学农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室 / 国家甘蔗产业技术研发中心, 福建福州 350002
摘 要: Na+/H+逆向转运蛋白基因 SOS1 (salt overly sensitive 1)是植物耐盐性的必需基因之一, 在植物抵御盐胁迫过
程中发挥十分重要的作用。本研究以小麦 EST序列 KJ563230为探针, 利用电子克隆技术结合 RT-PCR,获得一条甘蔗
SOS1基因的 cDNA序列, 命名为 ScSOS1 (GenBank登录号为KT003285)。序列分析结果表明, 该基因全长 1403 bp, 包
含一个 1272 bp的开放阅读框, 编码 423个氨基酸的蛋白质。ScSOS1蛋白的相对分子质量为 47.6 kD, 理论等电点(pI)
为 9.12。氨基酸序列分析表明, ScSOS1蛋白具有一个 CAP-ED superfamily结构域。生物信息学预测显示, ScSOS1的
编码蛋白为亲水性蛋白, 不存在信号肽, 二级结构元件多为无规则卷曲, 主要参与中间代谢。实时荧光定量 PCR 分
析表明, ScSOS1基因的表达具有组织特异性, 在甘蔗叶鞘、蔗皮、蔗髓、侧芽和根中均有表达, 其中在叶鞘中的表达
量最高, 根中的表达量最低。此外在 NaCl、PEG、ABA、SA和 MeJA的胁迫过程中, 该基因表达均受到调控, 其中
受 NaCl和 PEG诱导后上调表达, 均在 24 h表达量达最高, 分别约为对照组的 1.5倍和 4.0倍。推测该基因的表达与
甘蔗耐盐性和抗渗透胁迫有关。
关键词: 甘蔗; SOS1基因; 电子克隆; 生物信息学; 实时荧光定量 PCR
Isolation and Characterization of a Na+/H+ Antiporter Gene from Sugarcane
LIU Feng**, SU Wei-Hua**, HUANG Long, XIAO Xin-Huan, HUANG Ning, LING Hui, SU Ya-Chun,
ZHANG Hua, and QUE You-Xiong*
Key Laboratory of Sugarcane Biology and Genetic Breeding (Fujian), Ministry of Agriculture, Fujian Agriculture and Forestry University / Sugarcane
Research & Development Center, China Agricultural Technology System, Fuzhou 350002, China
Abstract: Salt overly sensitive 1 (SOS1) gene, encoding a Na+/H+ antiport protein, plays an important role in biological processes
of plants against salt stress. Using a SOS1 mRNA sequence from Triticum aestivum (KJ563230) as the probe, the homologous
ESTs of sugarcane were obtained from NCBI database. A sugarcane cDNA sequence of SOS1 gene was cloned by in silico cloning
combined with RT-PCR, and named as ScSOS1 (GenBank accession number: KT003285). The bioinformatics analysis showed
that ScSOS1 has a length of 1403 bp with a complete open reading frame (ORF, 107 to 1423 bp), encoding a 423 amino acid resi-
dues of sugarcane SOS1 protein with an estimated molecular weight of 47.6 kD and a calculated isoelectric point (pI) of 9.12. The
protein of ScSOS1 belongs to a conserved CAP-ED superfamily. Yet the ScSOS1 protein has no signal peptide and belongs to
hydrophilic protein with the main function for intermediary metabolism. The mainly secondary structure element of ScSOS1 pro-
tein is random coil. Real-time quantitative PCR (RT-qPCR) analysis revealed that ScSOS1 was tissue-specifically expressed in
leaf sheath, bark, pulp, bud and root of sugarcane, with the highest expression in leaf sheath and the lowest in root. Besides, the
expression of ScSOS1 gene could be regulated by the treatments of NaCl, PEG, ABA, SA, and MeJA, and up-regulated by the
stresses of NaCl and PEG, with the highest inducible expression levels of 1.5 times and 4.0 times as high as those of control at 24
hours, respectively. This paper suggested that ScSOS1 involves in sugarcane tolerance salt and osmotic stresses. It can set up a
502 作 物 学 报 第 42卷
basis for the elucidation of sugarcane salt resistance mechanism.
Keywords: Sugarcane; SOS1 gene; in silico cloning; Bioinformatics; Real-time quantitative PCR
土壤盐渍化是一个世界性难题 , 我国约有
3.3×107 公顷的盐渍化土壤, 严重影响我国农业的生
产效率和可持续发展[1]。土壤盐分过多会对植物生
长发育造成危害, 如引起离子平衡和渗透平衡的失
调, 影响酶的活性, 甚至会抑制光合作用等一些重
要的代谢途径[2-5]。前人研究表明, 在受到盐胁迫时,
植物细胞内活性氧的增加会加快叶绿体的氧化降解
速度, 进而抑制叶绿体片层的合成, 降低叶片中的
叶绿素含量, 最终降低光合作用[6-12]。同时, 在盐胁
迫下, 植物细胞内还会产生大量氧自由基, 降低超
氧化物歧化酶(SOD)的活性, 改变细胞膜通透性, 从
而损伤细胞结构和细胞功能[13-15]。
植物抗盐或耐盐的生理基础主要包括渗透调
节、离子区域化、光合作用途径改变、抗氧化防御
系统的活性增加和植物激素调节[16]。有机小分子物
质和无机离子如脯氨酸、甜菜碱、甘露醇、Na+、
K+等可以调节植物的渗透压平衡, 还可以通过离子
区域化将盐离子储存在细胞器或组织中, 减轻盐离
子对植物的损害[17]。另一方面, 在盐胁迫下, 植物主
要通过增加水的利用率和改变光合碳同化途径增强
耐盐性, 同时体内的 SOD、过氧化物酶(POD)、过氧
化氢酶(CAT)等酶的活性升高 , 以有效清除过多的
活性氧, 防止膜脂过氧化[16]。当植物处于盐胁迫环
境时, 植物内源信号激素脱落酸(ABA)被诱导合成,
通过改变植物体内水分和离子平衡, 对盐胁迫作出适
应性反应, 最终提高植物的耐盐性[18]。陈义强等[19]研
究发现, 在 200 mmol L–1NaCl处理下, 斑茅体内的
超氧化物歧化酶和过氧化物酶(POD)活性升高 , 表
现出较强的抗盐性。
迄今 , 离子区域化酶类基因 , 尤其是Na+/H+逆
向转运蛋白基因SOS (salt overly sensitive)的克隆和
功能分析 , 是植物耐盐分子机制研究的热点。
Gaxiola等[20]从拟南芥克隆到一个液泡膜Na+/H+逆向
转运蛋白基因AtNHX1 (Na+/H+ exchanger, NHX), 发
现该基因与拟南芥H+-PPase基因AVP1 (Arabidopis
thaliana vacuolar-type H+-pumping pyrophosphatase 1)
共同执行Na+的液泡转运功能。Waditee等[21]的研究
发现 , 藻青菌的质膜Na+/H+逆向转运蛋白基因
ApNhaP (a halotolerant cyanobacterium)编码蛋白的
主要作用是驱使Na+的外排 , 这也是光合生物耐盐
性的关键因素。前人研究揭示, SOS信号通路与植物
耐盐性密切相关, 目前, 研究者 [22-26]已从拟南芥中
获得6个耐盐基因SOS1、SOS2、SOS3、SOS4、SOS5
和SOS6, 其中SOS1在SOS信号通路中扮演十分重要
的角色[27-29]。拟南芥SOS1基因编码一个质膜Na+/H+
逆向转运蛋白 , SOS1的C-末端为一长亲水性尾链 ,
位于胞质中 , 作为感受器感知胞质中Na+浓度的变
化, 进而引发胞质Ca2+信号的产生, 随后Ca2+信号刺
激SOS3-SOS2复合物激活SOS1, 最后将Na+排出胞
外, 提高植物的耐盐性[27-29]。拟南芥SOS1蛋白是质
膜Na+/H+的逆向运输体 , 同时也是SOS信号通路中
最初的调节对象[30]。拟南芥SOS1突变体对盐非常敏
感, 表明SOS1基因在拟南芥耐盐性中发挥重要的作
用。权庚等[31]研究发现, 过量表达互花米草SaSOS1
的转基因水稻对盐胁迫具有较强的适应能力, 说明
该基因可以增强植株的耐盐性。此外, SOS1基因也已
经在包括水稻[32]、小麦[33]、大叶补血草[34]等植物上
被克隆和鉴定。但是, 国内外尚未见甘蔗SOS1基因
的克隆和表达分析的报道。
我国甘蔗主要种植在盐碱地和旱地[35], 研究表
明, 盐胁迫对甘蔗的发芽率和植株生长具有重要的影
响, 是造成甘蔗产量和糖分下降的主要原因之一[36-37]。
因此, 了解甘蔗耐盐机理和挖掘甘蔗耐盐基因对培
育耐盐甘蔗品种具有非常重要的意义。本研究以甘
蔗品种崖城05-179 (YC05-179)为材料, 利用电子克
隆结合RT-PCR及RT-qPCR技术, 分析甘蔗中ScSOS1
基因的表达情况, 以期进一步揭示该基因的功能和
作用模式。
1 材料与方法
1.1 试验材料和试剂
甘蔗品种 YC05-179 由福建农林大学农业部福
建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室提供。主要试
剂为 PrimeScript TM RT-PCR Kit 反转录试剂盒
(TaKaRa, 中国大连、TRIzol Reagent (Invitrogen,
Carlsbad, CA, USA)、Gel Extracti on Kit (Tiangen
Biotech Co., 中国北京)、SYBR Green PCR Master
Mix Kit (Roche, USA)。
1.2 材料处理
从田间挑选健康无病长势相近的 YC05-179 蔗
株, 将其切成单芽茎段, 并种植于经过高温高压灭
菌的营养土中催芽(16 h/8 h, 光/暗, 28℃), 直至蔗
第 4期 刘 峰等: 甘蔗 Na+/H+逆转运蛋白基因的克隆与表达分析 503
苗长出 4~6叶。其次, 选取长势一致的蔗苗, 用于组
培苗的诱导、壮苗、生根。最后, 将组培甘蔗幼苗
移出并在温室内开放水培一周, 再挑选长势均一的
组培苗分为对照和 4 个试验组, 设置 3 次生物学重
复。试验组处理[35]为 5 mmol L–1水杨酸(SA: 6、12
和 24 h)、100 μmol L–1茉莉酸甲酯(MeJA: 6、12和
24 h)、100 μmol L–1脱落酸(ABA: 6、12和 24 h)、
25.0% PEG (模拟干旱: 6、12和 24 h)和 250 mmol L–1
NaCl (高盐: 12、24和 48 h) 水溶液培养, 以处理 0 h
的蔗苗为对照。取以上所有植物材料的样本立即投
入液氮速冻并保存于–80℃冰箱至 RNA提取。
1.3 总 RNA提取和 cDNA合成
用 TRIzol Reagent 试剂提取样品 RNA, 包括组
织特异性材料 YC05-179的叶片、叶鞘、侧芽、蔗皮、
蔗髓、根及经 SA、MeJA、ABA、PEG 和 NaCl 胁
迫处理的蔗苗, 根据 Prime-Script RT Reagent Kit操
作说明书, 将 RNA反转录合成 cDNA, 用 1.0%琼脂
糖凝胶电泳检测质量。
1.4 甘蔗 SOS1基因的电子克隆和 RT-PCR
采用电子克隆方法 , 以小麦 SOS1 基因
(KJ563230)的 EST 序列作为探针 , 应用 NCBI 的
BlastN 工具检索甘蔗 EST 数据库, 将获得的甘蔗
EST序列群(表 1), 同源性达到 84%以上者, 用CAP3
sequence Assembly Program (CAP3) (http://pbil.univ-
lyon1.fr/cap3.php)软件拼接组装获得 cDNA序列。最
后利用 ORF finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
projects/gorf/)在线软件, 对所获得的 cDNA 序列进
行 ORF预测分析。
以上述电子克隆获得的 cDNA 序列为模板, 设
计一对特异性的 RT-PCR 扩增引物 SOS1-1F 和
SOS1-1R (表 2)用于验证电子克隆序列的正确性。采
用 TRIzol法, 以 NaCl处理过的 YC05-179蔗苗为材
料, 提取总 RNA并反转录为 cDNA作为模板。PCR
扩增体系总体积 25 L, 含 10Ex Taq buffer 2.5 L、
10 mmol L–1 dNTPs 2 L、20 mol L–1上下游引物各
1.0 L、Ex Taq酶 0.125 L、cDNA模板 1.0 L、ddH2O
17.375 L。PCR反应程序为: 95℃预变性 4 min, 95
℃变性 30 s, 48℃退火 30 s, 72℃延伸 2 min, 35个循
环; 72℃延伸 10 min。将 PCR产物切胶回收后连接
到 pMD19-T载体上, 随后转化到大肠杆菌 DH5α感
受态细胞中。将 PCR扩增验证筛选获得的阳性单菌
落的菌液送往上海生工生物工程技术服务有限公司
测序。
1.5 甘蔗 SOS1基因序列的生物信息学分析
生物信息学分析方法[38]如下。利用 ORF finder
在线软件, 对甘蔗 SOS1基因进行开放阅读框分析并
翻译; 利用 ExPASy 中 ProtParam pI/Mw (http://web.
expasy.org/compute_pi/)在线工具对甘蔗 SOS1 基因
所编码蛋白一级结构进行预测; 利用 GOR IV (http://
npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_
gor4.html)进行甘蔗 SOS1 二级结构预测 ; 利用
SWISSMODEL (http://swissmodel.expasy.org/)进行
甘蔗 SOS1 三级结构预测; 利用 SignalP 4.1 Server
(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 进 行 甘 蔗
SOS1 蛋白信号肽分析; 利用 ProtScale (http://web.
expasy.org/protscale/)进行甘蔗 SOS1 疏水性/亲水性
预测 ; 利用 Profun 2.2 Server (http://www.cbs.dtu.
dk/services/ProtFun/)对甘蔗 SOS1 进行功能预测以
及利用 Psort (http://www.psort.org/)在线工具预测其
亚细胞定位。同时, 用 NCBI上 Blast工具进行同源
氨基酸序列查找, 并利用 DNAMAN 对所获得同源
氨基酸序列以及甘蔗 SOS1 蛋白序列进行序列比对,
最后在 MEGA6.0 中采用 NJ (Neighbor-Joining)法
(BootStrap 1000)构建进化树。
1.6 甘蔗 SOS1基因表达的 RT-qPCR分析
根据甘蔗ScSOS1基因序列设计定量PCR引物
SOS1-2F和SOS1-2R (表1)。本试验采用2个内参基因
CUL和CAC, 内参基因的定量引物见(表2)[39]。采用
RT-qPCR技术检测ScSOS1基因在甘蔗YC05-179上的
相对表达量。PCR反应体系(20 μL)含: SYBRGreen
Primix Ex Taq (2×) 10 μL、上/下游引物(10 μmol L–1)
各0.8 μL、cDNA 2.0 μL、ddH2O 6.4 μL。根据ABI7500
实时荧光定量PCR仪默认程序设定实时定量PCR扩
增程序为50℃ 2 min; 95℃ 10 min; 95℃ 15 s; 60℃
1 min; 45个循环; 反应时设置3次技术重复, 以无菌
水作对照 [40]。荧光定量PCR反应结束后 , 在ABI
PRISM7500 Real-time PCR System软件上对定量数
据进行初步分析, 导出数据文件, 采用2–ΔΔCt [41]算法
分析试验结果。
2 结果与分析
2.1 甘蔗 ScSOS1基因序列的获得
以小麦 SOS1 基因(GenBank 登录号为 KJ563230)
的 E S T 序列为探针 , 借助电子克隆技术结合
RT-PCR 扩增验证, 从甘蔗中分离获得一条 SOS1 基
因的 cDNA 序列。利用特异性引物进行 RT-PCR 扩
504 作 物 学 报 第 42卷
表 1 本研究电子克隆中用到的甘蔗 EST序列
Table 1 ESTs of sugarcane used in silicon cloning of this study
EST名称
ESTs name
GenBank登录号
GenBank accession
number
EST名称
ESTs name
GenBank登录号
GenBank accession
number
EST名称
ESTs name
GenBank登录号
GenBank accession
number
EST1 CA123479 EST10 CA168442 EST19 CA206185
EST2 CA150498 EST11 CA170239 EST20 CA249301
EST3 CA150493 EST12 CA171815 EST21 CA289178
EST4 BQ535756 EST13 CA168447 EST22 CA236771
EST5 CA266652 EST14 CA205250 EST23 DV731203
EST6 CA300522 EST15 CA207265 EST24 DV734298
EST7 CA268212 EST16 CA281315 EST25 DV734918
EST8 CA149566 EST17 CA217234 EST26 DV637625
EST9 CA157407 EST18 CA093373 EST27 GT873350
表 2 ScSOS1基因克隆与表达所用引物
Table 2 Primers used in ScSOS1 gene cloning and expression analysis
引物
Primer
引物序列
Sequence information (5–3)
退火温度
Tm (℃)
用途
Purpose
SOS1-1F GGTGCTACGAGTGCTAAA
SOS1-1R ATATGACAGCGCAAAGAG
48℃ 基因克隆
Gene Cloning
SOS1-2F GTATGTACGGCAGCATGGTGAG
SOS1-2R GGCATTCTTGGGTAGGAGGAG
61℃ 荧光定量 PCR (RT-qPCR)分析
Real-time quantitative PCR (RT-qPCR) analysis
CUL TGCTGAATGTGTTGAGCAGC
CUL TTGTCGCGCTCCAAGTAGTC
55℃ 内参基因
Reference genes
CAC ACAACGTCAGGCAAAGCAAA
CAC AGATCAACTCCACCTCTGCG
57℃ 内参基因
Reference genes
图 1 甘蔗 ScSOS1基因的 RT-PCR扩增
Fig. 1 RT-PCR amplification of ScSOS1 gene in sugarcane
M: marker 2000 bp; 1: RT-PCR产物。
M: DNA marker 2000 bp; 1: RT-PCR product.
增, 产物经2%琼脂糖凝聚电泳得到单一条带如图1。
经测序验证, 电子克隆所得核酸序列与测序序列(图
2)的同源性达98.34%, 表明电子克隆序列是正确的,
最终得到的序列是使用2个克隆的测序结果校对所
得的, 其中部分碱基的差异可能是 PCR 扩增中的错
配所致。该基因被命名为 ScSOS1, GenBank 登录号
为 KT003285。其 cDNA 序列片段长1403 bp, 包含
一个 1272 bp的开放阅读框, 编码一个 423个氨基酸
的蛋白。
2.2 甘蔗 ScSOS1基因的生物信息学分析
2.2.1 甘蔗 SOS1 基因编码氨基酸的一级结构预
测 通过在线工具 ExPASy中 ProtParam pI/Mw,
预测甘蔗 ScSOS1基因编码蛋白质的一级结构显示,
该蛋白分子式为 C2078H3357N621O622S19, 分子量Mw
为 47.6 kD, 包含 423 个氨基酸残基。SOS1 蛋白等
电点(pI)为 9.12, 有负电荷残基(Asp+Glu) 47 个 ,
正电荷残基(Arg+Lys) 54个 , 蛋白质三维结构不稳
定系数 (II)为 60.01, 平均疏水性 (GRAVY)-0.396,
脂肪系数(AI) 86.69。蛋白质不稳定系数大于 40,
蛋白质表现为不稳定状态[42], 因此推测甘蔗 ScSOS1
基因编码的蛋白质为不稳定的碱性蛋白质。
2.2.2 甘蔗 ScSOS1蛋白二级结构预测和分析
根据 GOR IV软件预测, 甘蔗 SOS1蛋白无规则
卷曲所占的比例高达 51.30%, 其次是 α-螺旋占
32.86%, 延伸链所占比例是 15.84%, β-螺旋的比例
为 0 (表 3)。
第 4期 刘 峰等: 甘蔗 Na+/H+逆转运蛋白基因的克隆与表达分析 505
图 2 甘蔗 ScSOS1基因的 RT-PCR扩增验证所获得的序列及其推导的氨基酸序列(*: 终止密码子)
Fig. 2 Nucleotide acid sequence and deduced amino acid sequence of sugarcane ScSOS1 gene obtained by cloning (* stop codon)
黑色框部分为特异性引物在基因序列中的位置。
The sequence fragment complementary to primer is highlighted in black box.
表 3 甘蔗 ScSOS1蛋白二级结构预测分析
Table 3 Secondary structure prediction of sugarcane ScSOS1 protein
二级结构类型
Secondary structure type
氨基酸残基数目(个)
Amino acid residue number (a)
百分比
Percentage (%)
α-螺旋 Alpha-helix 139 32.86
延伸链 Extended strand 67 15.84
无规则卷曲 Random coil 217 51.30
β-螺旋 Beta-helix 0 0
2.2.3 甘蔗 ScSOS1 蛋白质三级结构预测 根据
SWISSMODEL 软件预测, ScSOS1 空间结构以无规
则卷曲和螺旋为主。比较甘蔗、玉米、小麦和水稻
的 ScSOS1蛋白的三维结构虚拟图, 结果如图 3显示,
甘蔗 ScSOS1 蛋白的三级结构与高粱、水稻、小麦
和玉米 SOS1蛋白的三级结构都存在一定的差异。
2.2.4 甘蔗 ScSOS1 蛋白信号肽预测和分析 根
据 SignalP 4.1 Server软件预测可知, 第 40位赖氨酸
残基具有最高的原始剪切位点分值 0.130 和最高的
信号肽分值 0.125, 第 39 位丙氨酸残基具有最高的
综合剪切位点分值 0.267。由于最后获得氨基酸残基
的加权平均值较小, 为 0.0.118 (远远小于 0.5), 推测
ScSOS1基因所编码的蛋白不存在信号肽, 即为非分泌型
蛋白, 说明该蛋白在细胞质中合成后不能被转运(表 4)。
2.2.5 甘蔗ScSOS1蛋白疏水性/亲水性的预测和分
析 蛋白质的疏水性可根据蛋白的平均疏水性
(GRAVY)值来预测, 当GRAVY大于零时, 为疏水蛋
白 ; 当GRAVY小于零时 , 为亲水蛋白 [43]。根据
ProtScale软件预测, 第77位具有最高分值, 为2.589,
疏水性最强; 第332位具有最低分值, 为–3.644, 亲
水性最强。平均疏水性(GRAVY) –0.396, 故推测甘
蔗S0S1蛋白是一种亲水蛋白。
506 作 物 学 报 第 42卷
图 3 甘蔗、高粱、水稻、小麦和玉米 SOS1蛋白三级结构预测
Fig. 3 Predicted third structure of SOS1 protein in sugarcane, sorghum, nice, wheat, and maize
表 4 甘蔗 ScSOS1蛋白信号肽预测
Table 4 Signal P-NN prediction for sugarcane ScSOS1 protein
指标
Index
位点
Site
分值
Score
有无信号肽
Signal peptide
Max. C 40 0.130
Max. Y 40 0.125
Max. S 39 0.267
Mean S 1–39 0.112
D 1–39 0.118 Absence
C score: 原始剪切位点的分值; S score: 信号肽的分值; Y score: 综合剪切位点的分值; S-mean: 信号肽分值的平均值; D score:
S-mean和 Y-max的加权平均值。
C score: scores of Putative cleavage site; S score: scores of Signal peptide; Y score: scores of Synthesis cleavage site S-mean: the av-
erage of the S-score; D score: a weighted average of the S-mean and the Y-max scores.
2.2.6 甘蔗 ScSOS1 蛋白的功能预测 根据 Profun
2.2 Server软件预测, 该蛋白主要参与中间代谢, 可能
性为 3.189, 其次也可能参与翻译、氨基酸生物合成及
脂肪酸代谢, 可能性依次为 2.957、2.656和 1.729。
2.2.7 甘蔗 ScSOS1亚细胞定位预测 根据 Psort
软件预测, 甘蔗 ScSOS1 蛋白可能被定位于细胞核
(60.0%), 其次是微体(过氧化物酶体) (30.0%), 再次
是线粒体基质的空间(10.0%)、溶酶体(10.0%)。
2.2.8 甘蔗 ScSOS1 蛋白的保守结构域预测 如
图 4所示, 甘蔗 ScSOS1蛋白包含CAP-ED (catabolite
gene activator protein-effector domain) superfamily和
一个 Crp domain (cAMP-receptor proteins), 含有一
个 ligand 结合位点和一个 cNMP (cyclic nucleo-
tide-monophosphate)结合位点。
2.2.9 甘蔗 ScSOS1蛋白的氨基酸同源性分析
选择高粱(Sorghum bicolor, gb|XP_002443674.1|)、
海滨盐草(Distichlis spicata, gb|ACZ05629.1|)、海枣
(Phoenix dactylifera, gb|XP_008798100.1|)、黑麦草
( L o l i u m p e re n n e , g b | A AY 4 2 5 9 8 . 1 | )、芦苇
(Phragmites australis, gb|BAF41924.1|)、水稻(Oryza
sativa Indica Group, gb|EEC69753.1|)、小麦(Triticum
aestivum, gb|AEI28609.1|)、小米(Setaria italica,
g b | X P _ 0 0 4 9 6 3 3 5 4 . 1 | )、玉米 ( Z e a m a y s ,
gb|XP_008645743.1|)、中华大叶竹(Indosasa sinica,
gb|AGB06353.1|)进行氨基酸同源性分析 , 与甘蔗
ScSOS1蛋白的氨基酸序列相似性分别为 87%、58%、
53%、63%、72%、68%、64%、71%、81%和 69%。
从图 5可以看出, 甘蔗 ScSOS1蛋白与同属单子叶植
图 4 甘蔗 ScSOS1蛋白的保守结构域预测
Fig. 4 Conserved domain prediction of ScSOS1 protein
第 4期 刘 峰等: 甘蔗 Na+/H+逆转运蛋白基因的克隆与表达分析 507
图 5 甘蔗 ScSOS1蛋白与其他植物种蛋白的氨基酸序列比对
Fig. 5 Homology analysis of sequences from sugercane ScSOS1 and those of other species
508 作 物 学 报 第 42卷
物的高粱的氨基酸相似性最高, 而与海滨盐草和海
枣的的相似性较低。
系统进化树(图 6)显示, 同属禾本科植物的甘蔗
和高粱同源性最高。甘蔗、高粱、玉米、小米、黑
麦草、小麦、水稻、中华大节竹、海滨盐草和芦苇
为一个分支, 海枣属于棕榈科, 独立地成为一个分
支, 但是甘蔗与高粱的亲缘关系最近。
2.3 甘蔗 ScSOS1基因的组织特异性表达分析
组织特异性表达的RT-qPCR分析显示(图 7), 该
基因的表达具有组织特异性, 在甘蔗品种 YC05-179
的叶鞘、蔗皮、蔗髓、侧芽、根等组织中均有表达,
但是在根中的表达量最少 , 叶鞘中的表达量最高 ,
约是根的 23 倍; 其次是在蔗髓中的表达量, 约为根
的 5倍。
图 6 不同物种 SOS1蛋白的系统进化分析
Fig. 6 Phylogenetic analysis of SOS1 protein sequences from different species
图 7 甘蔗 ScSOS1基因在不同组织中的表达
Fig. 7 Relative expression of ScSOS1 gene in different sugar-
cane tissues
误差线为每组处理的标准误差(n = 3)。
The error bars represent the standard error of each treating group
(n = 3).
2.4 甘蔗 ScSOS1 基因在不同外源胁迫下的表达
特性分析
RT-qPCR表达分析结果表明, 甘蔗 ScSOS1基因
在不同外源胁迫下具有不同的表达特性(图 8)。从图
中可以看出, 在 NaCl处理下, ScSOS1基因在甘蔗品
种 YC05-179 中的表达量上调, 在 24 h 达到最高表
达量, 约为 0 h的 1.5倍。此外, 该基因在 48 h后的
表达量逐渐下降但还是高于 0 h 的表达量。在 PEG
处理的 3个时间点(6、12和 24 h), ScSOS1基因的表
达呈现上调的趋势, 在 24 h 达到最高, 约为 0 h 的
4.0倍。在 SA和 ABA处理下, 该基因的表达出现上
调和恢复两个阶段, 在 6 h和 12 h时呈现上调表达,
在 12 h 后表达量均达到最高, 分别是 0 h 的 2.0 和
1.5倍, 且都在处理 24 h后恢复到与 0 h相当的表达
水平。值得注意的是, 与 SA 和 ABA 胁迫下的表达
模式相反, 在 MeJA 的处理下, ScSOS1 基因的表达
量先减少后增加, 在 6 h的表达量最低, 约为 0 h的
0.5倍; 12 h后该基因的表达量逐渐上升并在 24 h到
达最高, 约为 0 h的 1.5倍。
3 讨论
植物耐盐性研究主要集中在盐胁迫的信号传导
机制[44]。SOS 信号途径是植物盐胁迫信号传导的重
要途径之一[25]。其中, SOS1是 SOS信号途径的一个重
要组成部分, 与植物耐盐性密切相关[25]。权庚等[31]的
水稻转基因实验证明, 过量表达 SaSOS1 能够增强
水稻植株的耐盐性。因此, 克隆并研究甘蔗 SOS1基
因的特征特性及其在甘蔗耐盐机制中的作用机理具
有较为重要的理论和实践意义。
本研究以小麦 SOS1 基因的 EST 序列为探针,
采用电子克隆和 RT-PCR 扩增验证相结合的方法,
第 4期 刘 峰等: 甘蔗 Na+/H+逆转运蛋白基因的克隆与表达分析 509
图 8 甘蔗 ScSOS1基因在不同外源胁迫下的表达
Fig. 8 ScSOS1 gene expression of sugarcane under different exogenous stresses
误差线为每组处理的标准误差(n=3)。
The error bars represent the standard error of each treating group (n=3).
成功克隆到甘蔗 ScSOS1基因。该基因具有完整的开
放阅读框。同源比对结果显示, ScSOS1蛋白与高粱
SbSOS1 蛋白的同源性最高, 达 87.0%, 说明 SOS1
基因的编码蛋白在不同物种间具有较高的保守性。
生物信息学分析显示, 甘蔗 ScSOS1 蛋白是一种亲
水性的不稳定蛋白, 这与 Zhao [45]对玉米 ZmSOS1基
因的生物信息学分析的结果相同。Tang等[46]研究发
现虽然胡杨 SOS1 蛋白主要定位于细胞膜, 也有少
量定位在细胞质中。但是, 本研究分析结果显示, 甘
蔗 ScSOS1蛋白可能定位于细胞核。此外, 该蛋白的
二级结构主要为无规则卷曲和 α-螺旋, 这与徐立新
等[47]等获得的木榄质膜型 Na+/H+逆向转运蛋白的二
级结构特征相符。从三级结构预测结果可以看出 ,
甘蔗 ScSOS1 与其他物种该蛋白的三级结构都存在
差异, 与高粱的差异较小, 而与水稻、小麦、玉米的
差异较大, 其原因可能是甘蔗与高粱的亲缘关系较
近而与其他物种的较远。保守结构域分析结果显示,
ScSOS1蛋白含有一个 CAP-ED superfamily, 该结构
域包含一个分解代谢物激活蛋白并且该蛋白主要位
于离子通道中, 推测 ScSOS1 参与中间代谢和离子
转运。cAMP为细胞内的第二信使, 当细胞外信号与
相应受体结合后, 导致细胞内 cAMP (cyclic adeno-
sine monophosphate)的水平变化而引起细胞发生反
应。本研究中, ScSOS1蛋白还含有一个 Crp结构域
和一个 cAMP 受体结构域, 推测该蛋白可能是胞内
SOS 信号通路最早的作用对象, 这与 Zhang 等[30]的
研究结论相符。
前人研究表明, SOS1基因在植物耐盐和抵抗渗
透胁迫方面发挥了重要的作用[48-53]。周玲玲等[48]研
究发现, 过量表达大叶补草 LgSOS1 基因的拟南芥,
耐盐性显著提高。王姝杰等[49]研究表明, 过表达蓝
藻质膜 Na+/H+逆向转运蛋白基因 Nhap 能够显著提
高转基因烟草 Fl代的耐盐性。此外, 还有研究表明,
在盐胁迫下, 质膜 Na+/H+逆向转运蛋白基因在拟南
芥、苔藓、胡杨、海草等植物中均呈现上调表达趋
势[50-53]。Munns等[54]认为, 植物激素与植物耐盐性之
间有着密切的联系, 其中 ABA在植物应答盐胁迫过
程中具有重要的作用, ABA 是植物适应盐胁迫过程
中的最初的信号物质。RT-qPCR表达分析结果表明,
ScSOS1基因在甘蔗叶鞘、蔗皮、蔗髓、侧芽和根中
均有表达, 其中在叶鞘中的表达量最高, 在根中的
表达量最低, 说明该基因在甘蔗中的表达具有组织
特异性。此外, 在 NaCl处理条件下, ScSOS1基因被
诱导表达 , 并在 24 h 的表达量达到最高 , 这与
Zhao[45]研究玉米 SOS1 基因的表达分析结果相同,
推测该基因可能在甘蔗耐盐机制中起作用。ScSOS1
基因的表达量在 PEG、SA和 ABA胁迫下都会增加,
其中受 PEG诱导最强烈并随处理时间的延长而持续
增加。前人研究表明, 当植物处于高盐环境时, 最先
受到水分胁迫的影响[55], 因此 PEG是模拟渗透胁迫
的理想物质[56]。有文献报道, ABA 处理植株能增强
其在盐胁迫条件下的适应能力[57]。谢崇波等[58]构建
的 SOS 转录调控网络中有依赖 ABA 途径和不依赖
ABA途径, 其中有 25个基因与ABA信号途径相关。
本研究结果揭示, 甘蔗 ScSOS1基因可能在甘蔗耐盐
性方面发挥一定的作用, 同时还可能参与了甘蔗的
抗旱反应。
4 结论
从甘蔗中成功克隆到一个 ScSOS1基因, 该基因
510 作 物 学 报 第 42卷
包含一个 1272 bp 的开放读码框, 编码 423 个氨基
酸。ScSOS1蛋白与高粱 SbSOS1蛋白的氨基酸同源
性最高, 达 87.0%。同时, 该基因的表达具有组织特
异性, 在叶鞘中的表达量最大。ScSOS1 基因在高盐
和其他非生物胁迫下的表达量都会增加, 推测该基
因可能在甘蔗耐盐和抗旱的分子机制上发挥一定的
作用。研究结果为甘蔗 SOS家族基因中其他成员的
克隆及其深入的功能解析积累了基础资料。
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