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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 9 期
asr基因酵母双杂交系统的构建及筛选鉴定
许奕1，3 金志强1，2 刘菊华1 贾彩虹1 张建斌1 徐碧玉1，3
(1中国热带农业科学院热带生物技术研究所 农业部热带作物生物技术重点开放实验室，海口 571101;
2中国热带农业科学院海口实验站，海口 570102;3海南大学农学院，海口 570228)
摘 要: 为研究 asr作用的分子机制，分析该基因表达产物在体内相互作用的靶蛋白，分别构建诱饵质粒载体和转基因
拟南芥 cDNA文库，通过转入酵母细胞中，初步的鉴定分析证实成功构建了诱饵质粒载体和拟南芥 cDNA 文库。构建的酵母
双杂交系统为发现 asr基因表达产物在体内相互作用的靶蛋白奠定了基础。
关键词: asr基因 酵母双杂交 构建 克隆 表达
Construction and Screening of Yeast Two-hybrid System of asr Gene
Xu Yi1，3 Jin Zhiqiang1，2 Liu Juhua1 Jia Caihong1 Zhang Jianbin1 Xu Biyu1，3
(1Key Laboratory of Tropical Crop Biotechnology，Ministry of Agriculture，Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，
Chinese Academy of Tropical Agricultural Science，Haikou 571101;2Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Haikou Experimental Station，Haikou 570102;3Department of Agriculture，Hainan University，Haikou 570228)
Abstract: To study the molecular mechanism of asr and find its interacting proteins，the“bait”vector and the cDNA library of
transgenic Arabidopsis were constructed and transfected to the yeast cells． Result revealed the successful construction of the“bait”vector
and the cDNA library of Arabidopsis by the preliminary study and analysis． The result of this study lays a foundation for discovering the
interacting proteins of the asr．
Key words: asr gene Yeast two-hybrid Construction Clone Expression
收稿日期:2011-02-24
基金项目:国家自然科学基金项目(31071788) ，现代农业产业技术体系建设专项资金(nycytx-33)
作者简介:许奕，女，硕士研究生，研究方向:热带植物分子生物学;E-mail:lukydog163@ 163． com
通讯作者:徐碧玉，博士，研究员，研究方向:热带园艺植物基因工程;E-mail:biyuxu@ 126． com
asr(ABA-，stress-，ripening-induced)基因是与植
物抗逆及成熟相关的一类基因，在植物体内以小的
基因家族的形式存在，其家族中的成员可能在不同
形式的胁迫应答中发挥作用。据报道，该基因与植
物的发育相关，在果实成熟过程中能被诱导表
达［1］，并且响应一些非生物胁迫，如水分缺失、盐和
冷等［2，3］。同时，asr 在非生物胁迫过程中，受乙烯
和脱落酸的共同调控。
酵母双杂交系统是近年来广泛应用的一种研究
蛋白质间相互作用的强有力方法［4］。该系统中转
录激活因子往往由两个或两个以上相互独立的结构
域构成，分为 DNA 结合结构域(DNA binding do-
main，DB)和转录激活结构域(activation domain，
AD)。单独的 DB 虽然能和启动子结合，但不能激
活转录。而不同转录激活因子的 DB 和 AD 形成的
杂合蛋白则具有正常的激活转录的功能［5］。其通
过检测报告基因的表达产物就可以判断两种蛋白是
否发生相互作用［6，7］。
为了明确 asr 基因的作用机制以及该作用的信
号传导通路，本研究拟选择酵母双杂交系统钓取 asr
基因的表达产物在体内与其相互作用的蛋白质，为
进一步探讨 asr 作用的分子机理及功能提供新的
线索。
1 材料与方法
1． 1 材料
酵母双杂交系统选用 MATCHMAKER GAI4
Two Hybrid System 3 双杂交系统，包括质粒 pG-
BKT7、pGADT7、酵母菌株 AH109、Y187，酵母培养
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 9 期
基 YPDA、SD(含各种 DO supplement)、购自 Clon-
tech 公司;大肠杆菌(E． coli )DH5α 由本实验室
保存，测序公司为华大基因公司;限制性内切酶
EcoR I、Sal I、T4DNA连接酶、MassRuler
TMDNA Lad-
der、蛋白质分子量标准均为 MBI 公司产品;BCA
Protein Assay Reagent Kit 为 PIERCE 公司产品，其
余试剂均为国产或进口分装。RNA 提取试剂盒购
自 QIAGEN公司。PCR 引物参照 asr 基因全序列
设计(表 1) ，序列中引入 EcoR I 和 Sal I 酶切
位点。
表 1 asr基因引物设计
引物名称 引物序列(5 － 3) 基因大小(bp)
Forward CGGAATTCCGTCGCAAACCACTGTTTC
Reverse CGGTCGACACCAAGCATCCCACACTCA
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1． 2 方法
1． 2． 1 asr 基因的扩增回收 通过 pMD18-T-ASR
上 asr基因的开放阅读框设计引物，并且在引物两
端加 EcoR I，Sal I内切酶反应体系如下:模板 2 μL，
Taq酶 0. 5 μL，dNTP 4 μL，P1 1 μL，P2 1 μL，Sterile
H2O 38. 5 μL，10 × PCR buffer 5 μL。扩增程序:
94℃ 4 min;94℃ 30 s，56℃ 1 min，72℃ 45 s，35 个
循环;72℃延伸 6 min。扩增产物电泳鉴定后以 PCR
产物回收试剂盒(QIAGEN 公司)纯化回收，操作程
序参照试剂盒说明书。
1． 2． 2 重组载体的构建 提取质粒 pGBKT7，加入
EcoR I和 Sal I 37℃进行双酶切，纯化后与同样酶切
过的 asr基因混合，在 T4连接酶作用下连接。然后
转化大肠杆菌 DH5α，取转化后的菌液 200 μL 均匀
涂布于含卡那霉素 50 μg /mL LB 平板上，37℃过夜
培养。
1． 2． 3 重组质粒的筛选与鉴定 从转化后生长的
平板上挑取白色单菌落，于含卡那霉素的液体 LB
培养基中培养后提取质粒 DNA，通过酶切分析、PCR
扩增鉴定以及测序筛选鉴定。
1． 2． 4 转化酵母菌 AH109 制备酵母感受态细
胞:挑取酵母菌 AH109 克隆，30℃接种于 YPDA 液
体培养基培养成熟后在室温下离心取沉淀，去离子
水重悬洗涤离心取沉淀后用 TE /LiAc 溶液重悬，即
为酵母感受态细胞。转化酵母感受态细胞(按操作
说明书) :在灭菌的 1. 5 mL离心管中加入 2 μL pG-
BKT7 质粒、5 μL变性的鲱鱼精载体 DNA、50 μL 感
受态酵母菌，混匀后加入 0. 5 mL PEG /LiAc，30℃培
养 30 min，加入 DMSO 20 μL，42℃温育 15 min，高
速离心 15 s，弃上清，用 1 mL 0. 9% NaCl悬浮细胞。
取 100 μL 1 ∶ 10、1 ∶ 100、1 ∶ 1 000 的稀释液分别在
100 mm SD /-Trp培养皿上涂板，30℃倒置培养 3 －
6 d。
1． 2． 5 诱饵质粒的自激活检测和毒性检测 将
pGBKT7-53 和 pGADT7-T 质粒共转染 AH109 作为
阳性对照;将 pGBKT7-Lam 和 pGADT7-T 质粒共转
化 AH109 作为阴性对照，将转化有质粒 pGBKT7-
ASR 的菌液分别铺在 SD /-Trp /X-α-gal，SD /-His /-
Trp /X-α-gal，SD /-Ade /-Trp /X-α-gal，SD /-Trp /-Leu
培养基平板上，30℃培养 3 － 5 d 后观察平板的生长
情况，检测诱饵蛋白有无自激活作用。挑取 1 个
pGBKT7-ASR 转化的 AH109 克隆于 SD /-Trp /Kan
(50 μg /mL)培养基 10 mL 中，30℃振荡培养 12 － 20
h，检测 A600，若 A600 ＜ 0. 8，DNA-BD 可能有毒性;若
A600≥0. 8，说明没有毒性。
1． 2． 6 诱饵质粒蛋白表达 挑取 1 个含 pGBKT7-
ASR的酵母菌 AH109 克隆，1 个含 pGBKT7 空载体
的酵母菌 AH109 克隆，1 个未转质粒 AH109 克隆，
分别将其接种于 5 mL SD /-Trp 液体培养基中，于
30℃以 250 r /min 振荡培养 16 － 18 h。将上述新鲜
培养液接种于 50 mL YPDA培养基中，振荡培养 4 －
8 h至 OD600 = 0. 4 － 0. 6。4℃，1 000 × g，5 min收菌，
液氮冻融 3 次，加入酵母裂解液［尿素 8 mol /L，十二
烷基硫酸钠 50 g /L，Tris-HCl(pH6. 8)40 mmol /L，
EDTA 0. 1 mmol /L，溴汾蓝 0. 4 g /L］，70℃水浴 10
min，涡旋 1 min，离心，取上清，100℃煮 10 min。上
样前离心，取 25 μL 上样，进行 SDS-PAGE，蛋白转
移至硝酸纤维素膜上，用 50 g /L 的脱脂奶粉封闭后
加 asr抗体(购自艾比玛特公司)及羊抗兔二抗(购
自华美公司) ，显色。
1． 2． 7 拟南芥 RNA的提取和 cDNA的合成与纯化
1． 2． 7． 1 RNA的提取 取转化 asr 基因的拟南芥
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2011 年第 9 期 许奕等:asr基因酵母双杂交系统的构建及筛选鉴定
20 d小苗为材料，按照 QIAGEN RNA试剂盒说明书
提取。
1． 2． 7． 2 cDNA 的合成与纯化 ①第一链 cDNA
的合成:将 RNA样品加入 CD Ⅲ Primer和蒸馏水，
混匀后 72℃孵育、冰浴后混匀，再分别加入 5 ×
First-Strand Buffer 2. 0 μL、DTT 1. 0 μL、dNTP Mix
1. 0 μL、M-MLV Reverse Transcriptase 1. 0 μL混匀，
42℃孵育 10 min后加入 1. 0 μL SMARTⅢ Oligonu-
cleotide，再 42℃孵育 1 h，75℃10 min终止第一链
反应，恢复到室温加入 RNA 酶抑止剂，37℃孵育
20 min后备用。②双链 DNA 合成与纯化:PCR 管
中分别加入单链 cDNA、双蒸水、缓冲液、dNTP、5
引物、3引物、GC-Melt Solution 和多聚酶后充分
混匀，然后以下面条件进行扩增:95℃ 30 s;
95℃ 10 s，65℃ 10 min，19 个循环;68℃ 5 min，
完成后放入 － 20℃备用。取其中 5 μL 做 DNA 电
泳鉴定。利用 CHROMA SPINTMTE-400 柱纯化
ds cDNA，取 5 μL PCR 产物进行 1%琼脂糖凝胶
电泳检测。
2 结果
2． 1 诱饵质粒的构建
利用含 EcoR I、Sal I 酶切位点的引物，在含有
asr基因的 pMD18-T 载体上能扩出与预期相符的
608 bp的片段(图 1) ，将该片段与 pGBKT7 连接，重
组质粒经 PCR 鉴定正确，酶切片段大小相符(图
2) ，并对阳性克隆进行测序，结果表明诱饵质粒构
建正确。
M． DNA分子量标准;1，2． asr基因
图 1 asr基因 PCR扩增产物电泳检测
M． DNA分子量标准;1，2．重组质粒 pGBKT7-ASR
图 2 重组质粒 pGBKT7-ASR的酶切图谱
2． 2 诱饵质粒的自激活及毒性检测
转化重组 pGBKT7-ASR 的 AH109 酵母菌在
SD /-Trp /-Ade /-X-α-gal、SD /-Trp /-His /-X-α-gal 培
养板上均无菌落生长，SD /-Trp /-X-α-gal 培养板上
为白色菌落(图 3) ，由此证明诱饵质粒无自激活作
用。空质粒转化菌 OD600值为 1. 023，pGBKT7-ASR
转化菌 OD600值为 1. 109，说明诱饵蛋白无毒性
作用。
1． SD /-Trp /-Ade /-X-α-gal;2． SD /-Trp /-His /-X-α-gal;
3． SD /-Trp /-X-α-gal
图 3 诱饵质粒自激活检测
2． 3 诱饵质粒在酵母菌中的表达
Western blotting证实 pGBKT7-ASR 转化酵母菌
中表达 asr融合蛋白，而只转化 pGBKT7 空载体和未
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 9 期
转化载体的菌株并无表达蛋白(图 4) ，构建的诱饵
质粒可应用于酵母双杂交系统。
1． pGBKT7-ASR;2． pGBKT7;3． AH109
图 4 诱铒质粒表达
2． 4 拟南芥 RNA 的提取及 ds cDNA 的扩增
提取的 RNA 制品 A260为 0. 367，显示 A280为
0. 203，A260 /A280为 1. 81。琼脂糖凝胶电泳(图 5)显
示，RNA 富含的两条特异带，分别为 28S rRNA 和
18S rRNA 带，28S 与 18S 带浓度比值约为 2，表示
RNA制品未降解，可做后续试验。
以 2. 0 μL mRNA 反转录合成第一链，然后经
19 次 LD-PCR 合成双链 cDNA，合成的双链 cDNA
电泳呈弥散状，大小分布在 100 － 2 000 bp 范围内
(图 6)。经过用 CHROMA SPINTM TE-400 Column
纯化双链 cDNA，经检测 400 bp 以下的片段基本被
去除，如图 7 所示。
图 5 RNA PCR扩增结果
M． DNA分子量标准 1． CT;2． ds cDNA
图 6 双链 cDNA电泳结果
M． DNA分子量标准;1． ds cDNA
图 7 双链 cDNA纯化产物
3 讨论
asr基因是近年来从植物中发现的一类转录因
子。自从 Iusem 等［8］利用差异筛选分离了番茄 asr1
后，在一些单子叶植物、双子叶植物中都克隆到 asr
基因［2］，包括番茄(Lycopersicon esculentum)［1］、马铃
薯(Solanum tuberosum)［9］、玉米(Zea mays L．)［10］、
水稻(Oryza sativa L．)［11］和葡萄(Vitis vinifera L．)
等，而拟南芥中没有该类基因［12］。冯仁军等［13］首
次获得香蕉果实采后早期上调表达的一个 asr 基
因，通过分析表明该基因编码的蛋白可能作为转录
因子，在植物的糖代谢、生长发育、果实成熟以及非
生物胁迫过程中起作用。所以，进一步研究该基因
与植物抗逆方面的作用机制，探讨其分子机理，对
asr的功能深入研究具有重要的意义。
目前检测蛋白质之间相互作用的方法分为体外
和体内两种，体外检测方法［3］通常有免疫共沉淀和
交联等生物技术，而采用酵母双杂交系统属于体内
试验，该系统是研究蛋白质间相互作用的一种较有
效的遗传学方法，其具有简便、快速及不经蛋白质纯
化即可直接获得编码基因的特点［14，15］。采用已知
功能的蛋白基因筛选 cDNA 文库，以研究蛋白质之
间相互作用的传递途径，寻找与靶蛋白相互作用的
新蛋白，发现新基因的功能，以及细胞的信号传导通
路、细胞凋亡等作用是双杂交系统最广泛和最有价
值的应用之一［16，17］。
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同时该系统也存在缺陷，如在进行文库筛选时
假阳性常会干扰试验的准确性。为更好地解决这个
问题，一方面需要在系统中设立尽可能全面的对照，
反复筛选检测;另一方面要保证与 DNA-pGBKT7 融
合表达的诱饵蛋白本身没有自激活作用，即不能单
独激活报告基因的转录表达［18，19］。
目前，在实验室中使用的 Clontech 公司的第三
代 Gal4 酵母双杂交系统，采用酵母菌株 AH109，其
提供更为严格的报告基因筛选方法，具有降低假阳
性的特点［20］。
在进行酵母双杂交试验过程中，cDNA 文库的
构建也很重要。总的说来，cDNA 文库构建大致经
分离总 RNA、纯化 mRNA、反转录成 cDNA，然后与
两端带有限制性酶切位点的人工接头相连接，并将
其插入到载体中，得到 cDNA 文库。RNA 的纯度和
完整性决定着 cDNA文库的构建质量即序列信息的
完整性。
Clontech 公司提供的 SMART［21］技术在构建
cDNA文库时，不需对总 RNA中的 mRNA 进行分离
纯化，以直接用微量的总 RNA 作为反转录的模板，
从而可避免 mRNA 在分离纯化时的多步骤而造成
mRNA的降解，可以有效保证 cDNA的完整性［22］。
另外，在 cDNA的合成过程中，控制 LD-PCR 的
循环次数对于 cDNA的合成大小以及基因在文库中
拷贝数分布很重要［23］。适当的循环次数可以防止
低拷贝数的基因丢失，也可以防止高拷贝数的基因
过分放大，试验中应严格按照 RNA 起始量，合理安
排 PCR循环数［24］。
本试验所提取的 RNA经电泳检测，出现 28S 和
18S两条清晰的条带，其中 28S 和 18S 的亮度比接
近 2∶ 1，表明可用于文库构建。经过纯化后的 cDNA
片段经电泳检测，其分布范围在 400 － 2 000 bp 之
间，基本上符合植物 PolyA + RNA 的分布规律，表明
反应条件适合。
本试验成功构建了 asr 的诱饵载体，并构建了
拟南芥 cDNA文库，为下一步酵母双杂交筛选与 asr
基因互作的蛋白奠定基础。
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(责任编辑 李楠)
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