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技术与方法

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 5期
RAPD技术及其在植物研究中的应用
胡裕清 1, 2 赵树进 1
( 1广州军区广州总医院,广州 510010; 2华南理工大学生物科学与工程学院,广州 510006)
  摘  要:  RAPD技术利用一个 10碱基序列的引物, 通过 PCR扩增的多态性来检测受试材料基因组间的遗传变异关系。
介绍了 RAPD技术的基本原理及其优缺点,并根据前人的研究成果总结了 RAPD技术在植物研究中的应用情况,最后展望了
该项技术的一些应用前景。
关键词:  RAPD 正交试验设计 遗传图谱 遗传多样性 辅助选择育种
RAPD Technology and Its Application on Plant Research
Hu Yuq ing
1, 2
Zhao Shujin
1
(
1
Guangzhou G eneralH osp ital of Guangzhou M ilitary Command, Guangzhou 510010;
2
School of B ioscience& Bioeng ineering, South China University of T echnology, Guangzhou 510006)
  Abstrac:t  Random amp lified po lym orphic DNA ( RAPD ) technology uses a 10 base sequences prim er through PCR amp lifica tion
to de tect the genetic po lym orph ism of the o rganism ic genom e. The paper introduces the basic princ ip le of the RAPD techno logy, then
d iscusses its advantages and d isadvan tages. W e summarized the app lication of RAPD techno logy in plant acco rd ing to the prev ious re

search ach ievements and d iscuss the prospect o f RAPD techn ique in p lant research finally.
Key words:  RAPD Orthogonal des ign Geneticm ap Genetic d iversity A ssisted se lec tive breeding
收稿日期: 2010
01
04
基金项目:广东省科技厅项目 ( 2007Z3
E5151)
作者简介:胡裕清,男,硕士研究生,研究方向:中药分子鉴定; E
m ai:l hyqcg2007@ hotm ai.l com
通讯作者:赵树进,教授,博士生导师,主要从事中药分子鉴定研究; E
m ai:l gzzs jzhs@ 163. com
1 随机扩增多态性 DNA
11 RAPD的原理
随机扩增多态性 ( random amp lified po lymo rph ic
DNA, RAPD ) 技术 是由 美国学 者 W illiam s和
W elsh
[ 1, 2]两个研究团队在 1990年几乎同时发展起
来的。W illiam s等在发现 RAPD多态性的同时还证
明了 RAPD标记的分离情况符合孟德尔遗传规律,
因而明确了 RAPD作为分子标记用于研究生物遗传
变异的理论基础。
RAPD分子标记建立在 PCR基础之上。通过
使用一系列具有 10个碱基的单链随机引物,对基因
组的全部 DNA进行 PCR扩增以检测其多态性。由
于整个基因组内存在众多的颠倒重复序列, 因此需
要对每一随机引物单独进行 PCR。单一引物结合
在基因组 DNA分子内存在的或短或长的被间隔的
颠倒重复序列上, 经 PCR扩增后, 就会产生若干单
引物 PCR扩增产物, 若遗传特性发生变化, 形成了
该引物的特异图谱。所以在使用一系列引物后, 就
几乎可以将整个基因组的差异显示出来。最后经聚
丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后, 通过 EB染色
或放射自显影就可检测出被扩增的 DNA 的多
态性 [ 3]。
12 RAPD的优缺点
RAPD标记从被发现以来一直广泛应用至今,
说明这项技术有其特定的优点。综合起来, 其主要
有以下几方面的优点: 无需专门设计 RAPD标记扩
增时的引物,随机设计的 10碱基序列可以运用于大
多数的物种中, 且 PCR引物没有种属限制, 具有广
泛和通用性的特点;操作技术简单,不涉及分子杂交
和放射自显影等技术; 对模板 DNA的质量要求不
高, 引物价格便宜、成本较低; 不受环境,发育, 数量
性状和生物生长周期的影响, 能客观的提示供试材
2010年第 5期 胡裕清等: RAPD技术及其在植物研究中的应用
料的 DNA差异; RAPD产物经克隆和序列分析后可
作 RFLP和原位杂交的探针, 也可转变为 SCAR(序
列特征化扩增区域 )等。然而, 在实际运用这项技
术时也会遇到很多困难,这是这项技术的一些缺点。
例如, 由于引物序列较短,退火温度较低, 在匹配的
过程当中未必会成立;而且这项技术为显性遗传,并
不能鉴别杂合子和纯合子。此外, 这项技术还不是
很稳定,重复性差,不过可以通过优化实验条件加以
改进。因此,在利用 RAPD标记进行分析时需要建
立一套稳定的反应体系和扩增程序。反应体系一旦
确定无需再次变动, 试验所用的试剂也尽量与浓度
一致。
2 RAPD技术体系的优化
由于 RAPD稳定性和可重复性较差,在某种程
度上限制了这一技术的应用。因此, 在做 RAPD试
验之前都要先做反应体系优化考察。RAPD体系的
传统优化一般采用多次单因素设计方法, 例如陈析
丰等 [ 4]通过单因素试验, 优化得到山茶花的 RAPD
反应体系,并对在优化过程中各因素的作用加以讨
论。此外,陈大霞等 [ 5 ]也通过单因素试验得到优化
的黄连中药材的 RAPD反应体系, 并探讨了 RAPD
技术用于中药黄连分子标记研究的可行性。然而,
单因素设计试验不仅试验次数多、工作量大以及浪
费试剂,而且各因素之间的动态交互作用影响,不容
易快速得到优化反应体系,即使得到某一优化体系,
有时也会出现不稳定的现象。而正交设计是用正交
表安排试验,用统计学原理来研究各因子试验的一
种设计方法。它所安排的试验具有整齐可比和均衡
分散的特点,可以全面了解试验的情况和各因子之
间相互影响的规律。所以正交设计试验从多因素试
验结果中得出优良的反应体系,同时又避免了传统
的繁琐且没有统计学意义的优化过程。张建军
等 [ 6]通过五因素四水平正交试验设计的 L16 ( 45 ) ,
优化了萝卜基因组 DNA RAPD
PCR反应体系。通
过条带数目和清晰度的直观观察, 并经过重复性试
验确认 13号试验体系重复性好,且带型清晰。滕兆
岩等 [ 7]利用正交设计法对影响 PCR扩增效果的一
些因素诸如 Taq DNA聚合酶的用量、Mg2+ 浓度、
dNTP以及引物浓度等指标进行筛选和优化。然后,
通过引物对该优化结果进行验证, 最终得到适合星
星草 RAPD
PCR的反应体系。
然而,对于一些遗传距离很近的物种, RAPD标
记由于本身技术的不稳定, 就很难扩增出一些种内
的特异性片段。所以,有些学者就使用双引物进行
RAPD扩增,这样可以有效增加多态性位点,从而获
得更丰富的 DNA指纹信息。李丽等 [ 8]也通过对番
茄京丹 1号和毛粉 802的 F1代杂交种纯度进行鉴定
的试验研究证明了双引物的扩增反应对鉴定双亲亲
缘关系极近的杂交种纯度较单引物扩增反应更有
效。李湘阳等 [ 9]对同一细胞中的第 4号具随体染色
体及剩余 20条非随体染色体,进行 DOP
PCR扩增,
分别以随体染色体及非随体染色体的 DOP
PCR产
物为模板,用成对随机引物进行 RAPD分析,并获得
了属于随体染色体特异性片段。在试验中还发现用
单个随机引物进行 PCR扩增时,试验结果的重复性
较差,而用双引物却能得到较稳定的试验结果。
3 RAPD在植物研究中的应用
31 遗传图谱的建立
RAPD标记可用于构建遗传图谱。RAPD是一
种显性标记,符合孟德尔遗传定律,不能区分杂合型
和纯合型,因此在遗传分析及遗传图谱的构建等一
些方面受到限制。但是也有相应的解决办法, 将
RAPD条带作为单剂量标记, 单剂量标记 ( sing le

dose RAPD markers)是从两物种和其杂交产生 F1代
的分子标记中选择的。选择构建图谱用的标记有两
个原则:一是它们必须在一个亲本中存在而在另一
个亲本中不存在;其次是它们在后代中必须以 1 1
分离。这种方法相当于一个杂合体和一个隐性纯合
体的测交,称为双向假测交。在多倍体植物中,不论
基因组是如何组成的 (异源多倍体或同源多倍体 ),
也不论材料的多倍性水平如何, 单剂量的标记都相
当于简单的等位基因 (同源多倍体 )或相当于二倍
体基因座上的杂合等位基因 (异源多倍体 )。因此,
根据这些单剂量标记的连锁情况可以构建分子图
谱。RAPD条带作为单剂量标记使那些基因组 DNA
含量大,生长周期长的乔木和多倍体植物的遗传图
谱研究走出了几乎停滞的状态。G rattapagalia[ 10]利
用这种策略首先构建了巨桉和尾叶桉的分子连锁图
谱。 Beedanagari[ 11]利用这种策略构建了美国山核
桃数的分子连锁图谱。姜廷波等 [ 12]通过以 80个来
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生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 5期
自欧洲白桦 (B etula pendula Roth)与中国白桦 (B etu

la p latyphylla Suk )的 F1个体为作图群体。利用
RAPD标记,按照拟测交的作图策略, 分别构建了欧
洲白桦和中国白桦的分子标记连锁图谱。
32 系统分类学及种质资源遗传关系的研究
长期以来,分类的依据主要采用形态指标,而形
态指标易受环境影响发生变异,进而影响分类的准
确性, 对于一些形态指标相近或形态质量性状很少
的品种 (类型 )则难以区分。随机扩增多态性 DNA
( RAPD)分析已被证明为植物遗传多样性研究和系
统学研究的一个有用而简单的工具, 已被广泛应用
于种间、品种间、亚种或居群或不同基因组间的分
类、遗传和进化关系等方面的研究,比传统方法能更
全面地反应其遗传多样性, 为分类提供分子水平的
客观依据。总之, 在传统的分类基础上, 利用现代
DNA分析技术,将为植物的系统学研究提供更可靠
的依据,也是传统分类学的一种有力补充。
Sudhee等 [ 13]通过 RAPD和 AFLP比较研究了
麻风树属种间的遗传分歧和系统发育关系。发现
RAPD和 AFLP的遗传标记可用于识别麻风树属种
间杂种和应用于分子标记辅助选择和遗传资源的管
理。Muravenko等 [ 14]通过染色体带型, 荧光原位杂
交和 RAPD分析对亚麻属 8个种的进行比较基因组
分析, 通过 C /DAPI带型可以识别所有种核型中的
同源染色体。对于核型很相似的 L. grand if lorum ( 2n
= 16)与 L. decumbens可以通过细胞学与分子标记
技术相结合加于区别。此外, 通过 5S rDNA和 26S
rDNA在亚麻属不同种染色体上的定位研究, 并结
合 RAPD分析可以将亚麻属 8个种之间的遗传关系
和背景很清晰的显示出来。付春华等 [ 15]利用流式
细胞仪和随机扩增多态 DNA ( RAPD)方法对获得的
3例柑橘体细胞杂种进行鉴定, 结果也表明了, 两者
相结合可快速有效地鉴定体细胞杂种。李莉等 [ 16]
通过利用 RAPD技术分析了原产我国的枣属 14个
种、枣的 11个品种及 1个外类群的 DNA多态性。
作者在 026阈值处将供试材料分为 6类,不支持前
人根据单一性状对枣属属下组、系类群的划分;枣和
酸枣、蜀枣和山枣宜分别作同一个种处理,同时提出
枣种下宜划分为两个亚种,并给出了新等级的学名;
支持将枣种下传统划分的变种并入原变种。这项研
究也说明了 RAPD技术作为一种分子鉴定的有力工
具, 已经成为了传统形态学, 细胞学和同功酶分析鉴
定物种的有力补充和纠正手段。
RAPD标记技术在鉴别外源染色体片段和鉴定
易位系方面有着广泛的应用。在标记外源染色体的
同时,还可以对其所携带的特定性状基因进行标记,
从而可以确定植物不同种和品种间的遗传关系。
张增艳等 [ 17]通过对中间偃麦草麦、小麦和小
麦 -中间偃麦草 2A i
2附加系 Z1、Z2、Z6, 代换系
ZD28等进行 RAPD分析, 得到了克隆的中间偃麦草
T iSCO5和 T iSCM 4特异片段, 分别是 St基因组特异
性的寡拷贝序列及多拷贝重复序列,为 St基因组遗
传研究的新探针。郭长虹等 [ 18 ]以普通小麦 !中国
春∀、3个 !中国春 ∀具杀配子染色体的二体异附加
系及作为 3个杀配子基因种源的 3种山羊草为材
料,用 46个随机引物对基因组 DNA进行扩增,以筛
选杀配子染色体特有的 RAPD标记, 并检测普通小
麦与 3种山羊草之间的 RAPD多态性。结果成功地
筛选到这个标记, 从而在分子水平揭示了山羊草属
与普通小麦之间存在着较近的亲缘关系。由于
RAPD反应所扩增出的 DNA片段多为重复顺序, 而
不同染色体和不同染色体组之间 DNA的差异可以
由这些重复序列反映出来, 因此, RAPD技术在鉴定
和标记外源染色体及研究近缘种属问的遗传关系上
发挥着重要作用。
33 辅助选择育种
植物育种的关键环节是选择分离出所需的目标
性状,传统的育种方法只是通过表型去推测,对优良
个体是否真正的优良基因型,是无法准确知道的,并
且传统育种方法持续时间长且易受外界环境干扰。
而分子标记则可通过对其遗传背景进行准确考察,
并通过标记辅助选择 (MAS)获得带有不同优良基
因的个体,极大的提高了目标性状选择的效率。
RAPD标记技术无需知道 DNA片段序列的信
息, 就可以通过随机引物进行扩增,进而得到基因组
的多态性,并通过基因定位可以将一些重要的功能
基因定位并分离出来。基因定位的主要原理是根据
M ichelmo re
[ 19]提出的分离群体分组分析法 (简称
BSA ), 是将分离群体中的个体依据目标性状 (如耐
湿, 抗病 )分成 2组,在一组中将各个个体 DNA等量
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2010年第 5期 胡裕清等: RAPD技术及其在植物研究中的应用
混合,形成两个 DNA混合池。由于分组时仅对目标
性状进行选择,因此两个基因池之间理论上就应主
要在目标基因区段存在的差异。
Bo ltow icz等 [ 20]通过使用 RAPD标记,形态学和
细胞学分析鉴定了 Solanum bulbocastanum和马铃薯
的体细胞杂种中马铃薯晚疫病抗病基因连锁群,并
确定了 blb( + ) tbrH
8105体细胞杂种的 11个连锁
图谱。同时讨论推测了杂种细胞中第二连锁群 (染
色体 2)抗病基因在杂种细胞基因组重组时可能发
生丢失或是重排。张江丽等 [ 21]通过对亲本、耐感池
和群体的 RAPD分析, 鉴定出 S1249690位点与耐湿
性呈极显著相关,并初步定位于小麦的 5A染色体
上,说明小麦第 5同源群上很可能存在与耐湿性有
关的基因,小麦耐湿性的分子标记对小麦耐湿性的
标记辅助选择有重要的促进作用。
4 应用展望
RAPD标记技术发展至今, 由于其简便快速,多
态性高,成本低等特点,已经在植物研究中获得了广
泛的应用。主要有遗传多样性和亲缘关系的研究,
植物分子标记辅助选择育种,种质资源鉴定,遗传图
谱的构建,系统进化发育, 基因标记及其基因组比较
等方面。作为一项实用性比较强的分子标记技术,
RAPD标记技术的发展也将继续在植物遗传多样性
和亲缘关系研究, 品种鉴别, 辅助育种等方面发挥
作用。
参 考 文 献
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