全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 3期
氨基化硅胶载体固定化纤维素酶的研究
刘志良 杨敏丽
(宁夏大学能源化工重点实验室,银川 750021)
摘 要: 用硅胶作载体, 戊二醛作交联剂,制备了固定化的纤维素酶。对制备固定化纤维素酶的偶联剂浓度、pH、给酶
量 3个影响因素进行了研究, 通过正交试验优化得出最佳的固定化条件: 交联剂戊二醛浓度为 1% , 固定化 pH值为 5, 固载量
为每克载体 100 m g纤维素酶。
关键词: 固定化纤维素酶 戊二醛 氨基化硅胶
Study on Immobilization of Cellulase with
3Am inopropyl Silica Gel as Carrier
L iu Zhiliang YangM in li
(K ey Laboratory of Energy Sources& Chemical Engineer ing, N ingx ia University, Y inchuan 750021)
Abstrac:t Cellu lasew as immob ilized on silica ge ls w ith g lutara ldehyde as crosslinking agen t. Som e facto rs that a ffect the activ ity
o f imm obilized ce llulase w ere investigated, includ ing the concentration o f g lutaraldehyde, enzym e content g iven and pH. Through orthog
onal tests optim izing, the imm obilized conditions o f cellu lase w ere dete rm ined, the concentraion o f the g lutaraldehyde 1% , optimum pH
va lue o f the immob ilized enzym e 50 fo r ce llulase, the optim um am ount o f enzym e imm ob ilized on ch ito san as 100 m g /g silica.
Key words: Imm ob ilized ce llulose G lutara ldehyde 3am inopropy l silica ge l
收稿日期: 20091123
基金项目:宁夏回族自治区科技攻关项目,宁夏高等学校资助项目
作者简介:刘志良,男,硕士研究生,从事生物能源方面的研究; Em ai:l liuzh iliang213@ 126 com
通讯作者:杨敏丽,博士,教授, Em ai:l ym@l nxu edu cn
纤维素酶是一种重要的酶产品, 广泛用于食品、
酿造、发酵、医药、纺织、生物技术、造纸工业等领域。
目前, 纤维素酶多是以游离酶的形式使用,而很少以
固定化酶的形式应用。但由于酶的价格昂贵、游离
酶难以回收再利用,以致成本提高,因此越来越多的
研究者致力于对纤维素酶固定化的研究。
在固定化纤维素酶制备方面, Yuan等 [ 1]利用丙
烯酰胺与丙烯腈共聚物膜固定化纤维素酶; 陈盛
等 [ 2, 3]用壳聚糖作载体固定化纤维素酶;邱广亮等 [ 4]
制备了一种磁性琼脂糖复合微球,以此为载体固定化
纤维素酶。本研究尝试用氨基功能化硅胶作载体,因
为硅胶具有较高的机械强度、良好的化学和热稳定
性,孔径与形状易于人为控制,来源丰富, 价格低廉,
同时,利用硅胶表面含有丰富的硅醇基,可进行表面
化学键合或改性。用戊二醛作交联剂,采用化学交联
法固定纤维素酶,确定了酶固定的最佳条件。
1 材料与方法
11 供试材料及仪器
硅胶 G来自青岛海洋化工厂。纤维素酶购自
宁夏银川和氏璧生物制剂公司; 戊二醛 ( 50% )购自
天津市瑞金特化学试剂有限公司; 3氨丙基三乙氧
基硅烷购自上海晶纯试剂有限公司; 其他试剂均为
分析纯或生化试剂,市售。UV2450紫外可见分光
光度计购自日本岛津; 78 - 1型恒温磁力搅拌器购
自国华电器有限公司。
12 以氨基化硅胶为载体固定化纤维素酶的制备
5 g所选硅胶按 1 20(w /v )的比例加入到 20%
HC l溶液中,置于 120! 油浴中加热回流 6 h。反应完
毕,抽滤,蒸馏水洗涤至中性,真空干燥。准确称取处
理过的干燥硅胶,按 1 6(w /v )的比例加入四氢呋喃,
2010年第 3期 刘志良等 :氨基化硅胶载体固定化纤维素酶的研究
1 2(w /v )的比例加入 3氨丙基三乙氧基硅烷,搅拌,
在 60! 油浴中加热回流 12 h。先用四氢呋喃洗涤,再
用蒸馏水洗涤,最后用丙酮多次洗涤后,抽滤,真空干
燥,得到 3氨丙基硅胶作为功能化载体 [ 5]。
准确称取 1 g 3氨丙基硅胶, 加入到不同浓度
的戊二醛溶液中,室温下搅拌反应 4 h。抽滤, 充分
洗涤, 放入烘箱 ( 60! )中干燥。取活化的硅胶加一
定量酶液 ( 1 g /L ), 室温下搅拌反应 10 h。反应结
束,抽滤,用缓冲溶液洗涤多次,真空干燥后,即得固
定化酶。
13 酶活力的测定
游离酶酶活力的测定采用羧甲基纤维素钠测定
法 ( CMC) , 在试管中加入一定量 1%的 CMC, 再加
入酶液, 50! 作用 60 m in, 加入葡萄糖显色剂
( DNS) , 510 nm处测吸光度值。酶活单位,定义为 1
g酶粉于 50! , pH48条件下,每分钟水解生成 1 g
葡萄糖的酶量为 1个活力单位 ( U /g) [ 6 ]。固定化酶
的活力测定其方法同游离酶,只是在酶反应时保持
搅拌状态,使混合均匀。
2 结果与分析
21 固定化纤维素酶的单因素试验
211 戊二醛浓度对固定化酶活的影响 从图 1
可以看出,固定化酶活力随戊二醛浓度增加而增大,
戊二醛浓度达到 2%时, 酶活力最大。戊二醛浓度
较高或较低酶活均较低, 这主要是因为戊二醛有一
定毒性,浓度过高会使纤维素酶部分失活,同时过多
的戊二醛会造成空间位阻, 妨碍固定化酶与底物相
结合, 使固定化酶的活力降低; 若戊二醛质量分数太
低,又会使一部分纤维素酶不能固定在载体上,引起
活力的下降。
图 1 戊二醛浓度对固定化酶活力的影响
212 pH对固定化酶活力的影响 从图 2可以看
出, 固定化酶活随 pH 值增大而增加, pH 值 4时酶
活达最大。 pH值对酶活产生影响的原因是酶蛋白
分子上带有大量酸性、碱性氨基酸残基, pH值的变
化直接影响这些残基侧链基团的解离状态, 可能直
接影响底物的结合和进一步的催化反应 [ 7]。
图 2 pH对固定化酶活力的影响
213 给酶量对固定化酶活力的影响 从图 3可以
看出,随给酶量的增加,酶活力相应增大,但当给酶量
增加到 100mg /g时,酶活力不再增大。这可能是由
于交联后的载体,其活性基团是一定的,在其结合位点
未被饱和之前,固定化酶活力随给酶量增加而增大,当
结合位点被饱和后,增加给酶量却不增加酶活力 [ 8]。
图 3 给酶量对固定化酶活力的影响
22 固定化纤维素酶的正交试验
通过对纤维素酶固定化条件的单因素试验, 得
出影响纤维素酶固定化的主要因素有: 戊二醛浓度、
pH值、给酶量, 为了得出最佳固定化条件,对以上 3
个因素进行正交试验。结果见表 1。
用 F 值检验表明,戊二醛浓度及 pH影响均具
有显著性,酶用量影响不具有显著性 (表 2)。因此
确定纤维素酶最佳固定化工艺条件: A1B2C2即戊
二醛浓度为 1%, 酶用量为 100mg /g, pH 5。
197
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 3期
表 1 氨基化硅胶载体固定纤维素酶条件优化
序号 戊二醛浓度
(% )
酶用量
( m g/g)
pH
吸光
度值
1 1( 1 ) 1 ( 80) 1( 4) 2124
2 1 2( 100) 2( 5) 3483
3 1 3( 120) 3( 6) 2316
4 2( 2 ) 1 2 1902
5 2 2 3 1488
6 2 3 1 2039
7 3( 3 ) 1 1 1471
8 3 2 3 1198
9 3 3 2 1586
K1 7923 5497 5634
K2 5429 6169 6971
K3 4255 5941 5002
R 1222 0224 0656
表 2 氨基化硅胶载体固定化
工艺条件方差分析表
来源方差 离差平方和 自由度 F P
戊二醛浓度 2339 2 3004 < 001
pH 0673 2 8654 < 005
误差效应 0077
注: F
005 ( 2, 4 ) = 694; F 001 ( 2, 4 ) = 1800
3 结论
本试验以氨基功能化硅胶作载体, 戊二醛作交
联剂固定化纤维素酶,对固定化条件进行了探讨,得
出最佳固定化条件: 戊二醛浓度为 1% , 给酶量为
100 mg /g, pH5。固定化纤维素酶有其广阔的应用
前景,而固定化载体和固定化方法的选择直接影响
了固定化纤维素酶的实际应用, 尤其在工业化规模
的应用中固定化酶的操作稳定性, 重复使用性等方
面还需要研究。
参 考 文 献
[ 1] Yuan XY, et a.l Imm ob ilizat ion of cellu lose using acrylam ide grafted
acrylon itrile copolym er m em b ranes. Journal of M emb rane S cien ce,
1999, 155: 101106.
[ 2] 陈盛,黄智跃,刘艳如.壳聚糖固定化纤维素酶的研究.生物化学
与生物物理进展, 1996, 23 ( 3) : 250254.
[ 3] 陈盛,黄宜美.纤维素酶在甲壳胺上的固定化.福建师范大学学
报 (自然科学版 ) , 1996, 12( 2) : 6266.
[ 4] 邱广亮,李咏兰.磁性琼脂糖复合微球固定化纤维素酶的研究.
精细化工, 2000, 17 ( 2) : 115117.
[ 5] 刘海燕,李宁,李敬慈等.氨基化硅胶载体固定化 淀粉酶的研
究.食品科学, 2009, 30 ( 1) : 169172.
[ 6] 伍红.纤维素酶固定化研究.西南师范大学学报 (自然科学版 ),
2008, 33( 2 ): 8386.
[ 7] 刘颖,高晗,范婷婷.壳聚糖 戊二醛交联吸附法固定 葡萄糖苷
酶的研究.食品科学, 2008, 29 ( 5) : 318318.
[ 8] 朱启忠.壳聚糖固定化半纤维素酶的研究.生物化学与生物物理
进展, 2000, 27( 3 ): 274276.
科学出版社新书
油茶高效实用栽培技术
国家油茶科学中心 编著
9787030265616 58. 00 2010年 2月出版
内容简介:本书全面系统地介绍了关于我国油茶种植业的各项科技成果,提出了一套完整的速生、丰产、高产的技术措施。全书共分为三
章。第一章介绍了全国现有的省级以上油茶良种的经济性状、适生区域等相关信息,提出了油茶种植种苗选择的基本原则,为广大油茶种植者
选择种植良种提供了参考依据,解决了种植什么品种的问题。第二章介绍了油茶芽苗砧嫁接、扦插等
油茶良种苗木繁育措施,解决了如何繁育良种苗木的问题。第三章介绍了造林、幼林管理、成林管理的相关技术,包括选择造林地、苗木定
植、抚育管理、整形修剪、病虫害防治等多个方面,解决了如何营造丰产林、如何管理丰产林的问题。本书内容丰富、实践性强,必将成为当前农
民手中的油茶种植宝典,对油茶生产具有重要的指导意义和参考价值。
本书可供油茶种植农户、林业局及林业站基层生产人员参考。
欢迎各界人士邮购科学出版社各类图书 (免邮费 )
邮购地址:北京东黄城根北街 16号 科学出版社科学出版中心 生命科学分社
邮编: 100717 联系人:李韶文 ( 010- 64 000849) 周文宇 ( 010- 64031535)
网上订购: www. dangdang. com www. joy. com www. am azon. cn www. b eifab ook. com
更多精彩图书请登陆网站 h ttp: / /www. lifescience. com. cn,欢迎致电索要书目
198