全 文 ：Mar．2008
· 66·
生物加工过程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
第6卷第2期
2008年3月
氨苄青霉素标记的胶体金颗粒的制备及活性研究
白丽荣，毛占伟，王 慧，张娟琨
(天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津300457)
摘要：采用微波加热法制得15rim的胶体金颗粒，并将小分子抗原氨苄青霉素分别以戊二醛和碳化二亚胺为偶
联剂与牛血清蛋白偶联制成全抗原，再通过最佳标记量的确定分别将氨苄青霉素、戊二醛法全抗原、碳化二亚胺法
全抗原同胶体金进行结合，红外检测和杯碟法的抑茵试验表明采用仅有戊二醛作为偶联剂的全抗原能够很好地与
胶体金结合，并保持良好抗原活性。
关键词：胶体金；氨苄青霉素；戊二醛；碳化亚胺；杯碟法
中图分类号：R392．11 文献标识码：A 文章编号：1672—3678(2008)02—0066—05
Preparationnddentificationofcolloidalgoldabeledampicillin
BAILi—rong，MAOZhan—wei，WANGHui，ZHANGJuan—kun
(TianjinKeyLaboratoryofIndustrialM crobiology，CollegeofBi -engineering，TianjinUniversityofScience&Technology，
Tianjin300457，China)
Abstract：Colloidalgo dof15nmwaspreparedbymicrowavemethod．AmpiciUin(AMP)wasfirstCOU—
pledwithcarrierproteinbovines rumalbumin(BSA)viaglutaraldehyde(GA)and1一 thyl-3-(3-dime-
thylaminopropyl)一carbodiimide(EDC)．Thenitwaslabeledwiththecolloidalgo d．Infrared(IR)and
Agardiffusionmethodwereemployedfordeterminingthesynthesizedcompound．Theresultsshowedthat
theAMP，GA，EDCandthecolloidalgoldweresuccessfullylinkedandwithbiologicala tivity．The
AMP—Colloidalgoldc ndevelopasrapidtestsystemandelectrochemicalbiosensor．
Keywords：colloidalgol ；ampieillin；glutaraldehyde；Agardiffusionm thod
氨苄青霉素(AMP)是口一内酰胺类中青霉素类
抗生素的一种，其母核为噻唑并口一内酰胺环。由于
其抗菌谱比青霉素G广，对革兰氏阴性和阳性菌均
有抑制作用，再加上毒性低，价格便宜，在免疫检
验、快速诊断、生物传感器、植物保护等领域有广泛
的应用¨J。由于经济利益驱使和人们对抗生素残
留后的危害认识不足，导致食品和环境中青霉素类
抗生素的残留，从而引起一系列安全隐患怛J。
1857年，法拉第用氯金酸溶液制得胶体金，发
现在其中加入少量电解质后，可使它由红色变成蓝
色，最终凝集为无色，而加入明胶等大分子物质后，
可以阻止这种改变。这一发现奠定了胶体金制备
和应用基础，1971年Faulk等∞1把他用于细胞结构
的透射电镜研究，胶体金制备和应用研究。由于胶
体金具有较高电子密度⋯，对生物活性物有良好吸
附性能，当作为配体的某些生物活性物与胶体金混
合后便被吸附并保持其活性，同时胶体金易于制备
和定量，稳定性好，能渗入超薄切片的细胞内部作
收稿日期：2007-04-25
基金项目：天津市科委资助项目(07JCYBJC08600)
作者简介：白丽荣(1983一)，女，内蒙古鄂尔多斯人。硕士研究生，研究方向：纳米生物传感器。
联系人：张娟琨，女，教授，E—mail：zhangik@tust．edu．Cil
万方数据
2008年3月 白丽荣等：氨苄青霉素标记的胶体金颗粒的制备及活性研究 ·67·
为标记物，从20世纪80年代起其研究报道呈上升
势态。胶体金标记技术已经成为继酶标记、放射免
疫标记、荧光标记3大标记技术后，免疫标记技术的
又一大进步‘4l。
最近，俄罗斯科学家研究表明，胶体金能够促
使机体对抗生素等小分子类抗原产生强烈免疫应
答，使小鼠免疫系统的吞噬特性增强，产生大量抗
体【5J。目前国内外已经有约20余种商品化胶体金
试剂盒出售，如最常见的早孕检测试纸、淋病检测
盒等，除毒品和兴奋剂以外，其他小分子化合物的
残留检测方面的研究和应用却很少见报道，更未见
有应用胶体金标记法来快速检测氨苄青霉素残留
的报道怕J。为此，本文以微波法制得胶体金，并用
戊二醛和EDC两种方法制得氨苄青霉素的全抗原，
根据正负电荷作用，硫键结合和表面疏水力结合状
况，制得氨苄青霉素的胶体金结合物，并对其活性
进行了检验。为免疫法快速检测氨苄青霉素残留
和电化学生物传感器监测系统的建立以及高效价
抗体的产生奠定了坚实的基础。
1材料与方法
1．1材料
1．1．1试剂氯金酸(HAuCl。)、柠檬酸三钠，分析
纯，天津市英博生化试剂有限公司；氨苄青霉素
(AMP)、牛血清白蛋白(BSA)，北京鼎国生物技术有
限公司；戊二醛(GA)，分析纯，天津瑞金特化学品有
限公司；碳二亚胺盐酸盐(EDC)，分析纯，上海San—
land国际化学品有限公司；0．01mol／LpH7．4的PBS
缓冲液、0．1mol／LpH4．7的MES缓冲液为自配；无
菌LB培养基，自配；其他试剂均为国产分析纯。
1．1．2仪器JB4A恒温磁力搅拌器，上海理达仪
器厂；WD800T微波炉，格兰仕电器有限公司；
UVPC-2401紫外可见光分光光度计，日本岛津；
VECTOR22傅立叶红外分光光度计，德国布鲁克；高
速冷冻离一tL,机，日本日立；FDU2200冷冻干燥机，日
本RIDUKAKIKAI；恒温培养箱，上海智城分析仪器
有限公司。
1．1．3试验菌株试验菌株为大肠杆菌BL21
1．2方法
1．2．1胶体金的制备及粒径检验
按照文献[7]，先将0．1×10一mg／mLHAuCl。
溶液100mL放入微波炉中，高档沸腾2min，迅速一
次加入4．0×10’2mL1 mg,／mL柠檬酸钠水溶液，放
人微波炉中在中档保持3min，后呈现透明的橙红
色，即为15nm的胶体金。待液体凉后，用分光光度
计测定其吸收曲线，避光4℃保存。
1．2．2氨苄青霉素全抗原的制备及检验
GA法10nag氨苄青霉素溶于4mL二甲基甲
酰胺中，然后加到8mL溶有100mg蛋白质的PBS
溶液中，而后在上述混合液中逐滴加入75汕质量
分数25％的戊二醛。在室温下用磁力搅拌器轻柔
搅拌3h后，将反应物取出，PBS透析72h，每12h
换一次透析液。
EDC法10mg牛血清白蛋白溶于1mL去离
子水，振荡，使之充分溶解，10mg氨苄青霉素溶于
2．5mLMES缓冲液中，将此两溶液混合振荡均匀。
取50mg碳化二亚胺完全溶解于5mL去离子水中，
加入前面混合液中混匀，避光，静置，室温反应4h，
5000r／min离心10min，将上清液用PBS透析72h，
每12h换一次透析液。两种产品均小瓶分装，标记
后一20℃保存。
溶液中偶联物的绝对含量通常以蛋白质的相
对浓度来表示，按照Bradford染色法旧J，绘出BSA
含量的标准曲线，对应曲线回归出两种方法全抗原
中蛋白质的浓度。用紫外．可见光分光光度计扫描
浓度均为1mg／mL的氨苄青霉素、BSA和全抗原溶
液，对两种方法的偶联比进行估测。
1．2．3胶体金一AMP结合物的制备及检验
采用Mey氏稳定化实验确定最小蛋白用量归J，
其操作过程为：在酶标孔中分别加入pH6．0胶体金
100止，而后加入不同量的待标记物，混均匀后各加
入20止质量分数10％NaCl溶液，10min后肉眼观
察反应结果。取包被的临界值的1．3倍作为标记物
的最佳使用量。将上述确定的两种最佳全抗原用量
和胶体金溶液，在磁力搅拌器下混合数分钟后，加入
一定量的PEG20000溶液，使其最终质量浓度为
0．5g／L；即为胶体金一AMP全抗原结合物。标记后的
胶体金-AMP全抗原结合物先以1200r／min，4oC离
心20min，弃去凝聚的沉淀，而后16000r／rain，4℃离
心1h。重复离心两次，用PBS液悬浮洗涤，而后将沉
淀悬浮为原体积的1／10，4℃保存。
氨苄青霉素与胶体金的直接结合，采用上述相
同的方法。将结合物在去离子水中透析24h后，置
于变色硅胶中浓缩至原体积的1／10，4oC保存。两
种方法全抗原与胶体金的结合物和AMP与胶体金
万方数据
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的直接结合物进行冷冻干燥，用红外分光光度计检
测结合的具体情况。
1．2．4抗原活性检验
参考杯碟法操作¨0|，制成双层平板，在牛津杯
孔中分别加入100斗L的AMP，GA法全抗原，EDC
法全抗原，AMP一胶体金直接结合物，GA法全抗原一
胶体金结合物，EDC法全抗原．胶体金结合物，37℃
培养24h后观察抑菌环情况。
2结果与分析
2．1 15nm胶体金的紫外鉴定
胶体金的粒径不同会呈现相应的颜色，15nm
胶体金会呈现红色，颗粒粒径(10—70nm)与最大
吸收峰之间呈线性相关，基本符合如下直线回归方
程：Y=0．4271X+514．56【11。。最大吸收峰主峰宽度
越小，颗粒越均匀；主峰宽度越大，颗粒越不均匀。
用紫外．可见光对样品进行扫描，曲线见图l。
图1胶体金溶液200～600lun的紫外一可见光吸光曲线
Fig．1UV-visabsorptionspectraofcolloidal
goldatwavelength200-600nm
用此微波还原法制得的胶体金在520．5nm处有
最大吸收峰，回归方程知道粒径均值为13．9nm，且此
峰相当凸出，峰宽较小，判断以此方法得到的胶体金
颗粒粒径基本上都在15nm左右，符合试验要求。
2．2AMP．BSA全抗原偶联比的估测
以考马斯亮蓝溶液作为空白，不同浓度的BSA
在595nm下的标准曲线如下图2。
将两种方法所得的全抗原取与标准曲线对照
染色，对应标准曲线函数计算出相应的浓度，再将
其稀释为0．1g／L，测定200～400nm的吸收峰情
况，见图3。
根据偶联比计算公式计算得两种方法的偶联
图2 BSA用考马斯亮蓝染色后595nin下吸光度标准曲线
Fig．2Acalibrationcurveftheabsorbancemaximum
forcoomassiebrilliantblueG-250at595nm
whenbindingtoBSA
280nln处；1一lg／L的AMP溶液；2—O．1g／L的EDC法
全抗原；3—0．1g／L的GC法全抗原；4一l∥L的BSA
图3各样品200-400nm范围内的吸光度曲线
Fig．3Absorptionligh协ofeverysampleat200-400nm
比，戊二醛法为9：1，EDC法为15：1，这与文献[12]
基本上保持一致。
2．3 AMP全抗原和AMP对15nm胶体金最佳标记
量的确定
在Mey氏稳定化实验中，GA法全抗原的胶体
金变色临界值为2．5止，EDC法全抗原的临界值为
3止，氨苄青霉素的直接偶联临界值是在经过2h
室温反应的情况下为50斗L左右。因此确定3种情
况标记胶体金的最佳量为：GA法全抗原30“L／mL
胶体金，EDC法全抗原40斗L／mL胶体金，AMP
500斗L／mL胶体金。
2．4 AMP一胶体金结合物结合情况的分析
采用固体KBr压片，以BSA、AMP、胶体金晶体
的红外光谱作为对照，检测上面3种方法偶联AMP
和胶体金的结合情况，见图4。
从图4可以看出，AMP在1780cm。1处有B．内
酰胺环的特征吸收峰，AMP一胶体金结合物此处不出
万方数据
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峰，而在GC法全抗原一胶体金结合物和EDC法全抗
原一胶体金结合物此处均有比较明显的吸收峰，说明
4000 3ooO 2000 1000 0
波数，cm。
(a)AMP、BSA和胶体金的红外谱图
4000 3000 2000 lo()0 O
波数／cm-1
用全抗原的方法偶联胶体金能够将AMP和胶体金
颗粒比较牢固的结合到一起。
4000 3000 2000 1000 0
波数／cm-
(b)AMP-胶体金直接结合物的红外谱图
4000 3000 2000 1000 0
波赞／．／cm—i
(c)GC法全抗原与胶体金结合物的红外谱图 (d)EDC法全抗原与胶体金结合物的红外谱图
图4 4种方法与胶体金结合物的红外谱图
Fig．4AInfraredabsorptionspectrumsofantigen-colloidalgo dcombination
2．5 AMP一胶体金结合物抗原活性的分析
利用抗生素对细菌的抑制作用产生的抑菌环
来验证偶联物中抗生素的活性和偶联状况，见
图5。
1—AMP；2一EDc法全抗原；3一Gc法全抗原；4一Gc全抗原与胶体金结合物；5一EDC全抗原与胶体金结合物；
6一AMP一胶体金直接结合物
图5全抗原及结合物抑菌效果图
Fig．5Antibacterialeffectofcompleteantigenandcombination
万方数据
· 70· 生物加工过程 第6卷第2期
从图5可以清晰地看出GA法和EDC法两种
方法制备的全抗原保留明显的抗生素活性，对大肠
杆菌生长有明显的抑制作用。采用GA法制备的全
抗原与胶体金的结合物有较强的抗原活性，而EDC
法制备的全抗原与胶体金的结合物仅能表现出不
明显的抑菌效果，AMP和胶体金的直接结合物基本
上看不出任何生物抑菌效果。
3讨论
两种偶联方法制备的全抗原均有较好的活性，
但当将小分子半抗原、两种全抗原与胶体金颗粒相
结合时，红外检测表明两种全抗原能够与胶体金结
合，抑菌试验却表明只有GA法制得的全抗原和胶
体金结合物能保持较好的抗原活性，分析原因如下：
(1)GA作为偶联剂是在氨苄青霉素的氨基端
和蛋白质的氨基端通过GA的两个醛基形成了席夫
碱结构而偶联，但EDC作为偶联剂则部分是通过噻
唑环上的羧基和蛋白质的氨基端反应而偶联¨3|，此
时抗原决定簇因为蛋白质的位阻效应可能会不能
全部呈现出来。
(2)EDC使用的最佳pH4．7可能会导致部分
特征官能团开环变化，引起抗生素降解。
(3)标记物与胶体金的结合反应中，主要通过
蛋白质的硫键，表面疏水作用，氢键和正负电荷吸
引而结合在一起的，这几种结合力强度依次降
低¨4|，单纯依靠电荷吸引而制得的AMP一胶体金直
接结合物在操作中是很不稳定的，很难结合成功。
4结论
试验结果表明用GA作为偶联剂制备的AMP
全抗原与胶体金的结合物能表现出较好的结合强
度，抗原活性。但应用胶体金结合的全抗原产生高
效价的抗体，以及层析系统中各抗体，标记物定量
的确认和具体实践中的运用还需进一步研究。
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美科学家将鸡肉变成生物柴油
美国阿肯色大学的化学工程师研制出一项利用超临界甲醇将鸡肉脂肪和妥尔油脂肪酸转化成生物柴
油的新工艺。这个过程无需使用催化剂，并且生物柴油产出率非常高，其中鸡肉脂肪的产出率是89％，妥尔
油脂肪酸的产出率是94％。妥尔油脂肪酸是木材浆化过程中的主要副产品。这两项工艺成就意味着燃料
生产的重大突破，有关研究人员和石油公司已开始考虑用这种生物柴油替代石油。
(张春鹏)
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