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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 2期
牛乳碱性蛋白二维凝胶电泳条件的优化
李珊珊 王加启 杨永新 魏宏阳 卜登攀 张乐颖
(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 动物营养学国家重点实验室,北京 100193 )
  摘  要:  为了在二维凝胶电泳 ( 2
DE)中有效分离牛乳中的碱性蛋白,本试验在等电聚焦上样缓冲液中加入异丙醇和甘
油, 采用杯上样方式,比较了三丁基磷 ( TBP)和二硫苏糖醇 ( DTT )两种还原剂对碱性区域蛋白的分离效果。结果发现, 等电聚
焦上样缓冲液以 TBP为还原剂的碱性蛋白分离图谱水平条纹少, 优于以 DTT为还原剂图谱。表明等电聚焦上样缓冲液以
TBP为还原剂,采用杯上样的方法可以改善牛乳中碱性蛋白的分离效果。
关键词:  牛乳碱性蛋白 二维凝胶电泳 串联质谱
Optim ization of Two
dimensionalGel Electrophoresis
for Separating Basic Protein in BovineM ilk
L i Shanshan W ang Jiaqi YangYongx in W eiH ongyang Bu Dengpan Zhang Ley ing
( StateK ey Laboratory of A nimalNu trition, Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, B eijing 100193)
  Abstrac:t  Tw o
dim ensiona l gel e lectrophoresis( 2
DE) w as used to separate the high reso lution of basic pro tein from bov inem ilk.
In th is study, dithiothre ito l( DTT ) was rep laced by tr ibuty l phosphine( TBP ) as the reduc ing agent in the sam ple so lution for the first
d i

m ensiona l isoe lec tric focusing. The sam ple was cup
loaded at the anode. The resu lts show ed tha t, the comb ined use o f TBP and anod ic
cup
load ing improves protein so lub ility dur ing isoe lectr ic focusing, wh ich resu lts in h igher reso lution. The findings m ay provide va luab le
inform ation fo r the separation of basic prote in.
Key words:  Basic prote in in bov inem ilk 2
DE M ass spectrom etry
收稿日期: 2009
11
05
基金项目:国际科技合作项目 ( 2009DFB30530 ) ,国家自然科学基金项目 ( 30871837 )
作者简介:李珊珊,女,硕士研究生,研究方向:反刍动物营养和牛奶质量改良; E
m ai:l leeshansh ansh an@ 163. com
通讯作者:王加启,男,研究员,博士生导师,从事反刍动物营养和牛奶质量改良研究; E
m ai:l w ang
jia
q@i 263. net
2
DE是一种高通量、高分辨率的分离蛋白的方
法 [ 1] ,蛋白质组学方法和技术的发展,使得 2
DE得
到广泛应用。但是,在等电聚焦过程中,对碱性蛋白
运用传统的 2
DE方法分离具有一定难度 [ 2]。因
此,通过优化 2
DE条件, 提高碱性蛋白质的分离效
果,对蛋白质样品中碱性蛋白的认识具有重要意义。
近来,许多研究者发现等电聚焦过程中,上样缓
冲液常用的还原剂对碱性蛋白质分离有很大影响。
这可能是由于还原剂 DTT在 pH8- 9时, pK值呈弱
酸性, 影响了碱性蛋白的分离效率 [ 2]。为此, 有研
究发现在等电聚焦的阴极端加过量的 DTT[ 3, 4] , 水
平条纹有所减少,改善了碱性区域蛋白的分离效果。
之后, 发现采用非离子还原剂 TBP代替含硫醇还原
剂 [ 1, 7] ,可以提高分辨率, 减少蛋白水平条纹的出现。
此外,在上样缓冲液中加入适量异丙醇和甘油可以
阻止水向阳极移动形成的反相电渗流 [ 4- 6]。为此,
本试验在先前研究的基础上, 以含有异丙醇和甘油
的上样缓冲液, 采用杯上样的方式, 比较了用 DTT
和 TBP作为还原剂对二维凝胶中蛋白质分离的效
果, 为优化碱性区域蛋白的分离进行探索。
1 材料和方法
11 样品采集
采样奶牛选自北京市大兴区某养殖基地, TMR
方式饲喂,奶牛日饲喂 2次,挤奶 3次,自由饮水。采
集奶样。奶样于 4 3 000 ! g离心 15 m in分离乳
蛋白, - 20 保存。
12 方法
121 蛋白样品制备  溶解乳蛋白, 取 1 mL置入
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 2期
截留分子量为 10 kD的 V ivasp in 15R超滤浓缩离心
管 ( Sartor ius,德国 )于 4 2 000 ! g离心 20 m in以
除去小分子蛋白和盐份,收集蛋白。 - 70 保存。
122 第一向等电聚焦 用水化上样缓冲液 a、b
(溶液 a: 8 mo l/L 尿素, 4% CHAPS缓冲溶液,
65 mmo l/L DTT, 05% IPG buffer, 0001%溴酚蓝,
10%异丙醇, 5% 甘油; 溶液 b: 8 mo l/L尿素, 4%
CHAPS, 65mmol /L TBP, 05% IPG bu ffer, 0001%
溴酚蓝, 10%异丙醇, 5%甘油 )各 380
L, 将 17 cm
pH7- 10 IPG胶条水化 12 h。然后将 IPG胶条转
移到杯上样聚焦槽中。在两端加上电极, 将加样
杯置于 IPG胶条的阳极端。将 03mg乳蛋白样品
分别与水化上样缓冲液 A、B混合, 于 10 000 ! g
离心 10 m in吸取上清向加样杯中加样。滴加矿物
油后置于电泳仪 ( B io
R ad)中进行等电聚焦。
123 第二向 SDS
PAGE电泳 第一向等电聚焦
结束后,胶条依次用含有 20% DTT和 25%碘乙
酰胺平衡缓冲液还原和烷基化蛋白。然后, 用
12%的 SDS
PAGE凝胶 ( B io
Rad)电泳, 循环水浴
温度为 20 ,设置程序为起始功率 1W、30 m in,然
后加大功率至 12W,待溴酚蓝指示剂到底部时停
止电泳。银染, Um ax扫描仪 ( Pow erLook 2100XL)
采集图像。
124 蛋白酶解  从凝胶中选择蛋白点, 切割分
离为 1- 2mm的胶粒, 移至 15 mL洁净的离心管
中。分别用 200
L去离子水、200
L 50%乙氰和
200
L 50%乙氰 - 50% 50 mmo l/L碳酸氢铵溶液
冲洗 30 m in, 重复 1次, 脱色过夜。100
L 纯乙氰
脱水、干燥; 加 10
L 20 ng /
L胰蛋白酶, 37 酶解
过夜; 提取酶解液, 加 10
L 50%乙氰 /2%甲酸,超
声 30m in,上清合并到酶解液;重复 1次。
125 串联质谱鉴定 混合肽采用液相色谱串联
离子阱质谱系统 ( LCQ Deca Xp p lus, Thermo F inn i

gan)分析。上样前, 高效液相色谱 ( Surveyor, Ther

mo)色谱柱 B ioB asic
18用流动相 A (M illQH2O +
01%甲酸 )平衡, 流动相 B (乙氰 + 01% 甲酸 )
120m in线性梯度洗脱。样品上样量为 20
L, 流速
120
L /m in。所得数据用 SEQUEST软件搜索 NCBI
非冗余蛋白质数据库。
2 结果与分析
21 牛乳蛋白质分离
将牛乳蛋白质 2
DE凝胶进行银染, 发现等电
聚焦过程中相对于 DTT作为还原剂, TBP作为牛乳
蛋白质还原剂的分辨率较好。在 pH7- 10范围内,
图 1
A在等电聚焦过程采用 DTT分离牛乳碱性蛋
白, 使得各蛋白点没有得到较好的分离,出现了许多
水平条纹。用 TBP代替 DTT (图 1
B )减少了水平条
纹的出现,蛋白点较清晰。
A.用水化上样缓冲液 a的牛乳蛋白凝胶图谱;
B.用水化上样缓冲液 b的牛乳蛋白凝胶图谱
图 1 牛乳蛋白凝胶电泳图谱
22 蛋白点的质谱鉴定
选择图 1B中标示的蛋白点切割分离、胶内酶
切消化、提取混合肽液, 高效液相色谱串联离子阱质
200
2010年第 2期 李珊珊等 :牛乳碱性蛋白二维凝胶电泳条件的优化
谱分析肽质量,用检索软件 SEQUEST搜索 NCB I非
冗余蛋白质数据库, 但是未得出这些蛋白点的有效
信息。
3 讨论
在蛋白质组学的研究中, 2
DE技术由于具有较
高分辨率、重复性和制备性能, 且能比较直观地分析
蛋白质表达水平, 目前仍得到广泛应用 [ 8]。但是,
碱性蛋白在一维等电聚焦电泳过程中较难分离。于
是,本试验优化了 2
DE的电泳条件, 以杯上样的方
式上样,采用 TBP代替 DTT作为水化上样缓冲液中
的还原剂,分离牛乳中的碱性蛋白。
传统 2
DE一维等电聚焦电泳过程中采用 DTT
作为蛋白样品的还原剂。试验发现,用 DTT作为还
原剂的牛乳中碱性蛋白形成了水平条纹, 碱性蛋白
的分辨率较低。这可能是因为 DTT在碱性 pH时为
弱酸性,并且其本身带有负电荷。在等电聚焦时,常
常向阳极移动, 这使得阴极端的 DTT减少, 而在之
前已经打开的二硫键又重新配对, 样品的溶解度降
低,进而重新沉淀下来, 形成了水平条纹 [ 6, 9]。然
而,用 TBP代替 DTT后,水平条纹显著减少,并且提
高了分辨率。可能是因为 TBP还原效果比 DTT强,
可以增加蛋白质的溶解性, 以及帮助蛋白质从第一
向电泳转移到第二向 [ 10, 11]。TBP不带电, 不需要像
DTT那样像正极移动。与 DTT相比, TBP不与丙烯
酰胺、4
乙烯吡啶等烷基试剂相互作用 [ 7 ]。并且在
碱性范围内, 采用杯上样可以减少蛋白沉淀的产
生 [ 2] ,也更进一步地增加了蛋白的分辨率。但是试
验并未鉴定出分离的部分蛋白点, 可能是由于蛋白
含量太少,不足以进行蛋白的质谱鉴定。也可能是
由于此质谱方法不适合用于这些蛋白的鉴定。因
此,这些碱性蛋白的鉴定需要进一步的研究。
本试验采用杯上样方式,用 TBP代替 DTT作为
水化上样缓冲液中的还原剂,优化了分离牛乳中碱
性蛋白的 2
DE电泳条件。TBP的主要优点就是不
带电荷,在等电聚焦过程中不进行迁移,可以使蛋白
样品保持在还原条件下进行。这样就增加了蛋白样
品的溶解性,并且在最终的 2
DE凝胶中得到更多
的蛋白点, 减少了水平条纹的出现。因此, 在 2
DE
中以杯上样方式上样,加入异丙醇和甘油, 采用 TBP
作为还原剂,可改善蛋白质的分离效果。
参 考 文 献
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