全 文 ：核 农 学 报 2011，25(3):0609 ～ 0615
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
收稿日期:2010-08-25 接受日期:2010-10-16
基金项目:农业部转基因生物新品种培育重大专项(2008ZX08008-003，2009ZX08008-008B)，中国科学院“西部之光”项目(0860260XBO)，国家
科技支撑计划(2008BADB2B04，2008BADB2B10-7)
作者简介:李鸿岩(1985-)，男，甘肃华池县人，在读硕士，主要从事动物发育生物学研究。E-mail:Lihyedu@ 163. com
通讯作者:张 勇(1970-)，男，陕西西安人，教授，博导，主要从事动物繁殖生物技术研究。E-mail:zhychy@ 163. com
张 红(1959-)，女，北京人，教授，博导，主要从事重离子辐射生物学研究。E-mail:zhangh@ impcas． ac． cn
文章编号:1000-8551(2011)03-0609-07
两种剂量重离子辐照绵羊精子差异蛋白质组学研究
李鸿岩1 赵兴绪2 张 红3 王燕玲3 贺钰烜2 李发弟4 马友记4 张 勇2
(1. 甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃 兰州 730070;2. 甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州 730070;
3. 中国科学院近代物理研究所，甘肃 兰州 730000;4. 甘肃农业大学动物科技学院，甘肃 兰州 730070)
摘 要:为检测和分析 0. 5 和 3. 0Gy 2 种剂量重离子辐照绵羊精子差异表达的蛋白质，用二维凝胶电泳
分离精子蛋白，凝胶用硝酸银染色，PDQuest8. 0 检测分析差异表达蛋白斑点并经高效液相色谱串联离
子阱质谱鉴定，结果显示:2 种剂量凝胶图谱分析后得到 8 个共同差异蛋白斑点，鉴定为 3 种表达上调
的蛋白质(谷氧还蛋白 1、转录因子 AP-2α 蛋白和烯醇酶)。研究表明:绵羊精子经不同剂量重离子辐照
后蛋白质的表达存在差异，对差异表达蛋白质的研究有利于探索绵羊精子在重离子辐照过程中的生理
状态，可为进一步研究重离子辐照绵羊精子蛋白质组学奠定基础。
关键词:绵羊;精子蛋白质;二维凝胶电泳分析;蛋白质组;重离子辐照
COMPARATIVE PROTEOMICS ANALYSIS OF SHEEP SPERM
UNDER TWO DOSES OF HEAVY ION TO IRRADIATION
LI Hong-yan1 ZHAO Xing-xu2 ZHANG Hong3 WANG Yan-ling3 HE Yu-xuan2
LI Fa-di4 MA You-ji4 ZHANG Yong2
(1. College of Life Sciences and Technology，Gasu Agricultural University，Lanzhou，Gansu 730070;
2. College of Veterinary Medicine，Gansu Agricultural University，Lanzhou，Gansu 730070;
3. Institute of Modern Physics，Chinese Academy of Sciences，Lanzhou，Gansu 730000;
4. College of Animal Science，Gansu Agriculture University，Lanzhou，Gansu 730070)
Abstract:The object of this study was to investigate differential proteomic expressions in sheep sperm protein under two
doses (0. 5 and 0. 3 kGy)heavy ion radiation． The current research presented the protein changes using two －
dimensional gel electrophoresis (2 － DE)after staining with silver nitrate，differential expression proteins were detected
by PDQuest 8． 0 software and subjected to ion trap mass spectrometer equipped with a Surveyor HPLC system，and
differential spots of protein were identified． Results showed that eight common different expressed protein spots in two
doses 2D gels were identified to be three up － regulated proteins (glutaredoxin － 1，transcription factor AP － 2 － alpha
and enolase)． It was concluded that there was significant difference at protein level in sheep sperm after heavy ion
radiation and differential proteome expression analysis may be useful to clarify the physiology state of sheep sperm in
heavy ion radiation，which laid a foundation for the further studies on heavy ion radiation of sheep sperm proteomics．
Key words:sheep;sperm protein;two － dimensional polyacrylamide gel electrophoresis analysis;proteome;heavy ion
radiation
906
核 农 学 报 25 卷
哺乳动物精子是一种高度特化的终末端分化细
胞［1］，这种特殊的结构决定了很难从 DNA \RNA 水平
更深一步探索精子功能，对其分子层面的研究只能通
过蛋白质组学方法获取。近年来，蛋白质组学的兴起
为研究人员从蛋白质整体水平了解精子发生等一系列
事件提供了新思路［2，3］，因为虽然成熟分化的精子
DNA 转录和蛋白质表达不明显，但完全分化的精子必
须经过一系列事件才能使其功能发生实质性改变，其
中就包括精子离开附睾后的蛋白质翻译后修饰［4］。
近年来，辐照技术已广泛运用于水稻［5］、玉米［6］
和小麦［7］等植物的诱变育种，在转基因技术方面应用
重离子辐射处理受体材料，使外源 DNA 更易进入受体
细胞，从而提高基因导入率和转化效率［8］。但该技术
在哺乳动物生殖方面的报道较少，因此，从蛋白质组水
平探索辐照后哺乳动物生殖发育过程具有广阔的的研
究及应用前景。双向电泳是蛋白质组学研究的常用技
术之一，其关键在于样品处理及上样量的优化，本文就
不同上样量对绵羊精子蛋白质 2-D 图谱的影响作了较
为详细的分析，对最大和最小剂量重离子辐照后绵羊
精子蛋白质 2-D 图谱做了比较分析，并结合高效液相
色谱串联离子阱质谱对差异表达蛋白斑点进行鉴定，
为进一步研究重离子辐照精子蛋白质组学提供参考。
1 材料与方法
1. 1 试剂与设备
1. 1. 1 主要试剂 17cm 固相非线性 pH 梯度胶条
(Catalog 163-2009)为 Bio-Rad 公司产品;IPG Buffer
pH3 ～ 10、IPG Buffer pH4 ～ 7 为 Amersham Biosciences
公司产品;CHAPS、矿物油、二硫苏糖醇(DTT)、硝酸银
和低熔点琼脂糖为 Amresco 公司产品;三(羟甲基)氨
基甲烷 (Tris)、甘氨酸、四甲基乙二胺(TEMED)、丙烯
酰胺、甲叉双丙烯酰胺、硫脲、碘乙酰胺、尿素、盐酸胍、
β-巯基乙醇、十二烷基硫酸钠(SDS)、溴酚蓝和 Ham ＇s
F-10 培养液为 Sigma 公司产品;蛋白质 Marker 为
fermentas 公司;Trizol 为 Invitrogen 公司;其余药品均为
国产分析纯试剂。
1. 1. 2 主要设备 PROTEAN IEF Cell 系统和 PRO-
TEANⅡxi 系统及 PDQuest 8. 0 图像分析软件(Bio-Rad
公司)，Milli-Q 超纯水系统(Millipore 公司)，Eppendorf
Centrifuge 5417R 高速低温离心机，U2800 紫外可见分
光光度计(HITACHI 公司)，UMAX 扫描仪(台湾)，涡
旋仪(北京六一公司)，单人单面净化工作台(SW-CJ-
1FD，苏州净化设备有限公司)，倒置显微镜(IX-71，
Olympus，日本)。
1. 2 方法
1. 2. 1 精液标本采集 采用假阴道法［9］人工采集 5
头性成熟并健康的得克赛尔公羊精液，混合均匀。每
次采精都要用生理盐水反复冲洗假阴道，确保无菌。
采集精液后将集精杯里的精液立即用无菌针管量取体
积，并移入无菌试管，加等量精子稀释液［10］(每 100ml
稀释液中含:Tris 2. 422g，柠檬酸钠 2. 68g，果糖 0. 5g，
青、链霉素各 5 万 IU)混匀，在 37℃水温的保温桶避光
液化 30min，并立即带回实验室。在净化工作台，无菌
操作等分为 4 组，每组精液 2ml，分别为 0. 5Gy 剂量辐
照组、3. 0Gy 剂量辐照组、对照组和探索上样量组。每
组均吸取 5μl 分别滴于细胞计数板上加 100μl 生理盐
水稀释，置于 400 倍倒置显微镜下，以目测法评定精子
成活率［11］:统计细胞计数板上每个小方格直线运动的
精子数，精子成活率 = (直线运动的精子数 /总精子
数)× 100%。
1. 2. 2 精子的重离子辐照处理 重离子束辐照试验
在中国科学院近代物理研究所的重离子研究装置
(Heavy Ion Research Facility in Lanzhou，HIRFL)辐照
终端进行，束流为12 C6 +离子束，能量为 90MeV /u，LET
为 28 keV /μm，吸收剂量率约 0. 5Gy /min，吸收剂量分
别是 0. 5Gy 和 3. 0Gy。用空气电离室监测剂量，剂量
数据获取由计算机控制，所有精子样品辐照都在室温
下进行。辐照完后用 37℃水温的保温桶迅速把样品
带回实验室。
1. 2. 3 精子上游后成活率检测 采用上游法［12］分离
高活力精子:分别将 4 组精液经 400g 离心 15min，弃上
清，沉淀物在培养皿分别重悬浮于 2. 5ml Ham’s F-10
培养液，37℃、5% CO2 条件下培养 90min。而后每组
均吸取 10μl 上清悬浮液滴于细胞计数板上置于 400
倍倒置显微镜下，以目测法评定精子成活率［11］。
1. 2. 4 精子蛋白制备 分别将经 37℃、5% CO2 条件
下培养 90min 的 4 组精子悬浮液 6000g 离心 5min，弃
上清，精子团分别用 0. 25mol /L 蔗糖溶液(含 5mmol /L
Tris)重复洗涤 3 次，每次经 5000g 离心 10min。采用
改进的热 Trizol 法分别制备 4 组精子蛋白［13］:加入
1ml Trizol 裂解 1 千万个精子细胞，反复吹打沉淀至完
全分散;加入 20μl β-巯基乙醇(β-ME)，65℃ 水浴
45min。加入 0. 2ml 氯仿用力振荡 15s，室温孵育 2 ～
3min，12000g、4℃离心 15min;离心后混合物分为 3 层，
蛋白主要分布在下层有机相，小心吸取下层有机相转
移至新管中;加入无水乙醇 0. 3ml，2000g、4℃ 离心
5min 沉淀中间层 DNA。将离心后的上清部分(约
016
3 期 两种剂量重离子辐照绵羊精子差异蛋白质组学研究
0. 8ml)转移至新的离心管中，加入异丙醇 1. 5ml，室温
孵育 10min，2000g、4℃离心 10min 沉淀蛋白，弃上清。
加入 2ml 洗液(0. 3mol /L 盐酸胍 /95%乙醇)反复吹打
洗涤蛋白沉淀，室温孵育 20min，12000g、4℃ 离心
5min，弃上清;重复 3 次;无水乙醇重复洗涤蛋白 3 次;
室温干燥 5 ～ 10min，待无水乙醇挥发干净后溶解上
样。将干燥后的 4 组精子蛋白分别溶于约 100μl 裂解
液(8mol /L 尿素，2mol /L 硫脲，4% CHAPS，65mmol /L
DTT)。采用 Bradford 法［14］定量 4 组精子蛋白，根据定
量结果调整上样量。
1. 3 双向电泳
1. 3. 1 等电聚焦(Isoelectric Focusing，IEF)电泳
将经裂解液溶解好的不同上样量的探索上样量组
精子蛋白样品分别与一定量上样缓冲液(8mol /L 尿
素，2mol /L 硫脲，4% CHAPS，65mmol /L DTT，0. 5%
IPG Buffer，痕量溴酚蓝)均匀混合，总体积为 350μl，
把混合液加入聚焦盘中。从 － 20℃冰箱取出胶条，室
温解冻 10min，胶条朝下按正负极覆盖在样品混合液
之上，盖上矿物物油，防止胶条水化过程中液体的蒸
发。最后将聚焦盘置于 PROTEAN IEF Cell 电泳仪中
进行等电聚焦，程序设置如表 1 所示。
表 1 等电聚焦程序设置
Table 1 Procedure in isoelectric focusing
步骤 step 电压 voltage 模式 mode 时间 hours 作用 performance
水化 rehyration 50V 13h(20℃) 主动水化 active rehyration
S1 除盐 demineralization 250V 线性 slow 1h 除盐 demineralization
S2 除盐 demineralization 1000V 线性 slow 1h 除盐 demineralization
S3 升压 boosting voltage 9000V 线性 slow 5h 升压 boosting voltage
S4 聚焦 electrofocusing 10000V 线性 slow 60000 Vh 聚焦 electrofocusing
S5 保持 retention 500V 快速 rapid 24h 保持 retention
注:Vh 为伏小时，60000 Vh 指在 10000V 电压下聚焦 6h。
Note:Vh represents the volt-hour，and 60 000 Vh means the IPG strips were focused 6h with 10000V voltage．
1. 3. 2 SDS-PAGE 电泳及染色 配置平衡缓冲液
［0. 375mol /L Tris-HCl(pH 8. 8)、6mol /L 尿素、20%甘
油、2% SDS］，等电聚焦结束，胶条先后置于 6ml 平衡
A 液(含 2% DTT 的平衡缓冲液)和 6ml 平衡 B 液(含
2. 5%碘乙酰胺的平衡缓冲液)中在水平摇床上各平
衡 15min，然后转移胶条至 12% SDS-PAGE 胶上端，确
保在 IPG 胶条与板胶之间无气泡产生，用滤纸加入蛋
白质 Marker，然后用 0. 5%低熔点琼脂糖封顶，进行第
二向垂直电泳。
1. 3. 3 凝胶染色和图像分析 凝胶采用硝酸银染
色［15］。考染后的凝胶图谱用 PDQuest8. 0 分析软件进
行背景消减、斑点检测、匹配，获取斑点位置坐标等分
析。
2 结果与分析
2. 1 精子上游镜检结果
精子经上游法分离后的镜鉴检结果如图 1。
精子经上游分离前，镜下观察成活率为 43% ～
52%。经上游分离后，镜下观察成活率可达到 78%。可
见绵羊精子经上游分离后其成活率有了大幅度提高。
2. 2 不同上样量电泳结果的比较
比较上样量分别为 0. 1、0. 2 和 0. 3mg (pH3 ～ 10)
图 1 精子上游镜检结果(× 400)
Fig． 1 The observed result of upriver
sperm preparation(× 400)
时的电泳结果 (图 2-A、B、C)显示:以 0. 1 和 0. 2mg 上
样时，蛋白质斑点总数分别为 205 ～ 213 个、324 ～ 336
个，图谱背景干净、高丰度蛋白质点清晰;以 0. 3mg 上
样时，蛋白质斑点总数为 416 ～ 436 个，但低丰度蛋白
质显影不佳;以 0. 1、0. 2 和 0. 3mg 上样时，蛋白质点在
靠近 pH3(最左边的酸性端)和 pH10(最右边的碱性
端)的区域分布较少;上样量为 0. 4mg(pH4 ～ 7)的电
泳结果(图 2 － D)显示:蛋白质斑点总数为 492 ～ 522
个，蛋白质斑点产生了融合，无法进行比较分析，可能
是由于上样量过大所致。上样量为 0. 35mg(pH4 ～ 7)
的电泳结果(图 2 － E)显示:蛋白质斑点总数为 449 ～
475 个，丰度低的蛋白质被显影，蛋白质分子量基本分
布在 2 5 ～ 6 6 . 2 kDa。因此，本试验合适的上样量
116
核 农 学 报 25 卷
图 2 精子蛋白不同上样量电泳结果
Fig． 2 The results of 2-D map for different loading quantities of sperm protein
A:上样量为 0. 1mg(pH3 ～ 10);B:上样量为 0. 2mg(pH3 ～ 10);C:上样量为 0. 3mg(pH3 ～ 10);
D:上样量为 0. 4mg(pH4 ～ 7);E:上样量为 0. 35mg(pH4 ～ 7)
A:0. 1mg loading quantity(pH3 ～ 10);B:0. 2mg loading quantity(pH3 ～ 10);C:0. 3mg
loading quantity (pH3 ～ 10);D:0. 4mg loading quantity (pH4 ～ 7);E:0. 35mg loading quantity(pH4 ～ 7)
图 3 2 种剂量重离子辐照精子蛋白 2-D 图谱
Fig． 3 The results of 2-D map for two doses of heavy ion radiated sperm protein
F:对照;G:0. 5Gy;H:3. 0Gy
F:CK;G:0. 5Gy;H:3Gy
216
3 期 两种剂量重离子辐照绵羊精子差异蛋白质组学研究
为 0. 35mg(pH4 ～ 7)。
2. 3 2 种剂量重离子辐照绵羊精子蛋白质的电泳图
谱结果
2 个剂量的辐照组和对照的上样量均为 0. 35mg
(pH4 ～ 7)，经 PDQuest 8. 0 图像分析软件分析，3 个组
2-D 胶平均可检测到 430 ～ 480 个蛋白质点。分析图
谱结果显示:对照组与 0. 5Gy 剂量组匹配率为 65%，
与 3. 0Gy 剂量组匹配率为 60%;0. 5 与 3. 0Gy 剂量组
匹配率为 63%。差异标准是以 PDQuest 8. 0 软件分析
为基础，软件系统自动检测匹配以蛋白表达谱上“斑
点染色强度和面积 3 倍量的变化”为标准进行差异分
析，检测差异表达的蛋白斑点。软件分析结合人工确
定，对照组与 0. 5Gy 辐照组差异蛋白质点共有 9 个，其
中 0. 5Gy 辐照组新表达的蛋白质点有 3 个，缺失的有
1 个，表达上调的有 3 个，表达下调的有 2 个;对照组
与 3. 0Gy 辐照组差异蛋白质点共有 11 个，其中 3. 0Gy
辐照组新表达的蛋白质点有 3 个，缺失的有 1 个，表达
上调的有 5 个，表达下调的有 2 个;0. 5 和 3. 0Gy 共同
差异表达的蛋白质点有 8 个。部分差异点见图 4。
图 4 2 种剂量重离子辐照精子部分差异表达蛋白点
Fig． 4 Some different protien spots after two doses heavy ion radiated sperm protein
a:辐照后新表达的蛋白质点;b:辐照后缺失的蛋白质点;c:辐照后表达上调的蛋白质点;d:辐照后表达下调的蛋白
质点;Ⅰ:对照组 2-D 胶上的目标蛋白质点;Ⅱ:0. 5Gy 剂量 2-D 胶上相应位置的目标蛋白质点;Ⅲ:3. 0Gy 剂量 2-D
胶上相应位置的目标蛋白质点。
a:New expression protein spots after heavy ion radiation;b:Absent protein spots after heavy ion radiation;c:Up ragulated
protein spots after heavy ion radiation;d:Down ragulated protein spots after heavy ion radiation;Ⅰ:Target protien spots in
2-D gel of control sperm;Ⅱ:The protein spots in corresponding positional in 2-D gel of 0. 5Gy dose;Ⅲ:The protein spots
in corresponding positional in 2-D gel of 3. 0Gy dose．
2. 4 差异蛋白分析和鉴定
将 0. 5 和 3. 0Gy 共同差异表达的 8 个蛋白质斑点
运用高效液相色谱串联离子阱质谱(LC-MS /MS)进行
分析，用整合在质谱仪上 Bioworks 软件中的检索软件
SEQUEST 搜索 NCBInr 蛋白质数据库，有 4 个蛋白质
点(点 3、6、7、8)可搜索到相应的结果(表 2)，这 4 个
316
核 农 学 报 25 卷
点对应着 3 种蛋白，即点 3 鉴定为谷氧还蛋白 1，点 6、
点 8 鉴定为转录因子 AP-2α 蛋白，点 7 鉴定为烯醇酶，
这 3 种蛋白质在重离子辐照后的绵羊精子中均表达上
调。
表 2 LC-MS /MS 鉴定绵羊精子重离子辐照后差异表达的蛋白点
Table 2 Identification of differential expression proteins after heavy ion radiation by LC-MS /MS
蛋白点
protein
spot
蛋白质名称
protein name
登录号
accession
等电点 /
分子量
pI /Mw
氨基酸序列
sequence
3
谷氧还蛋白 1
glutaredoxin-1
［Ovis aries］
187937000 7. 65 /11783. 72
MAQAFVNSKIQPGKVVVFIKPTCPYCRKTQELLSQLPFKQGLLEFVDITAASNT
SEIQDYLEQLTGARTVPRVFIGQECIGGCTDLVNMH ERGELLTRLK QIGALQ
6、8
转录因子 AP-2α 蛋白
transcription factor
AP-2-alpha
［Ovis aries］
57619230 9. 22 /53927. 00
MPPRLASVKIPYDWGRKGPFRFWRIFCQSRAVGWFLAAACGRAGRFRTQP
AEWPTPDAVFSPLGLALFQDRHDGASNGTARLPQLGTVGQSPYTSAPPLSHT
PNADFQPPYFPPPYQPIYPQSQDPYSHVNDPYSLNPLHAQPQPQHPGW PGQ
RQSQESGLLHTHRGLPHQLSGLDPRRDYRRHEDLLHGPHGLGSGLGDLPIH
SLPHAIEDVPHVEDPGINIPDQTVIKKGPVSLSKSNSNAVSSIPINKDNLFGGVV
NPNEVFCSVPGRLSLLSSTSKYKVTVAEVQRRLSPPECLNASLLGGVLRRAKS
KNGGRSLREKLDKIGLNLPAGRRKAANV TLLTSLVEGEAVHLARDFGYVCET
EFPAKAVAEFLNRQHSDPNEQVTRKNMLLATKQICKEFTDLLAQDRSPLGNSR
PNPILEPGIQSCLTHFNLISHGFGSPAVCAAVTALQNYLTEALKAMDKMYLSNN
PNSHTDNSAKSSDKEEKHR K
7
烯醇酶
enolase
［Ovis aries］
7331113 5. 28 /11959. 56
HAGNKLAMQEFMILPVGASSFREAMRIGAEVYHHLKGVIKAKYGKDATNVG
DEGGFAPNILENNEALELLKTAIQAAGYPDKVVIGMDVA ASEFYRNGKY
DLDFKSPDDP
3 讨论
3. 1 试验方法对精子蛋白图谱的影响分析
不把辐照致死的精细胞最大限度去除，会直接影
响 2-D 图谱差异分析的准确性和可信度。精子裂解前
用上游法分离去除精液中被重离子辐照致死的精细
胞，最大限度地保留高活力精子很重要。虽然 Bio-Rad
公司提供的 17cm 胶条银染上样量为 0. 1 ～ 0. 3mg，但
样品来源不同蛋白质丰度差异很大，因此必须从样品
实际出发逐步探讨合适的上样量。本试验比较了绵羊
精子蛋白不同上样量的 2-D 图谱，以上样量为 0. 35mg
最佳(pH4 ～ 7)，上样量过高(0. 4mg)可导致相邻斑点
间融合，边界不清，上样量过低(0. 1 ～ 0. 3mg)则使蛋
白质斑点减少，丰度低的蛋白质斑点消失。
选择合适的重离子剂量对辐照精子的蛋白质组学
研究也很重要，已有研究证实，电离辐射对哺乳细胞
mRNA 转录水平的影响要大于翻译水平，而且高剂量
辐照会破坏环腺苷酸受体蛋白起始复合物抑制蛋白质
合成，因为大多数哺乳动物 mRNA 转录都是环腺苷酸
蛋白受体依赖性的，mRNA 通过环腺苷酸蛋白受体起
始复合物靠近核糖体［16］。王菊芳［17］等研究了辐照剂
量率对中国仓鼠卵巢 CHO-K 细胞存活的影响，发现当
剂量率为 0. 4Gy /min 时，细胞存活率接近 90%的吸收
剂量为 0. 5Gy，细胞存活率接近 50% 的吸收剂量为
3. 5Gy。由于本试验剂量率约 0. 5Gy /min，所以根据已
有研究结合精子特殊结构将最小和最大辐照剂量分别
定为 0. 5 和 3. 0Gy。
3. 2 重离子辐照后精子中差异表达的蛋白质
3. 2. 1 谷氧还蛋白 谷氧还蛋白(Glutaredoxin，Grx)
是一种多效性细胞因子，具有多种生物学功能，参与氧
化应激和抗细胞凋亡等［18］，它和 NADPH、谷胱甘肽
(Glutathione，GSH)、谷胱甘肽还原酶 (Glutathione
reductase，GR)构成谷氧还蛋白系统(Glutaredoxin
system)。该系统通过 Grx 中半胱氨酸残基上-SH 与-
S-S-之间的可逆转换，调节某些功能性蛋白分子上的-
SH 或-S-S-发生氧化 /还原所引起的蛋白分子的构型改
变，从而影响蛋白分子的活性、稳定性与正确折叠等功
能［19］。Jae［20］等通过研究 Grx 在翻译水平的不同表达
量，证实高表达的 Grx 能过保持线粒体复合体 1 在细
胞氧化应激下的正常功能，为 Grx 能够保护细胞免受
氧化损伤的假设提供了证据。Rajappa［21］等研究表
明，在葡萄糖缺乏的情况下，高表达的 Grx 通过调节
ASK1-SEK1-JNK1 信号转导通路，保护细胞免受 ASK1-
SEK1-JNK1 信号依赖性氧化胁迫。Grx 在重离子辐照
绵羊精子中表达上调，可能是由于绵羊精子免受重离
子辐照的自我保护所致。
3. 2. 2 转录因子 AP-2α 蛋白 转录因子 AP-2α 蛋白
是人类滋养层细胞分化、角质层生长和分化的关键调节
因子［22］，也是小鼠胚胎发育的关键调节因子，人类乳腺
癌的发生与异常表达的转录因子 AP-2α 蛋白有关，
Cheng［23］等研究证实高表达的转录因子 AP-2α 蛋白能
416
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2011，25(3):0609 ～ 0615
够抑制小鼠乳腺的增大和形态发生。转录因子 AP-2α
蛋白在重离子辐照绵羊精子中表达上调，可能是绵羊精
子抑制在重离子辐照过程中过早凋亡所引起。
3. 2. 3 烯醇化酶 烯醇化酶是参与糖酵解途径的酶
之一［24］，催化 2-磷酸甘油酸脱水生成磷酸烯醇工丙酮
酸，在细胞缺氧情况下，烯醇酶表达上调能够保护细胞
免受缺氧代谢损伤，在能量代谢过程中发挥作用，在关
于乳腺癌、肝内胆管癌、小细胞肺癌的蛋白质组研究中
发现肿瘤细胞中此酶表达上调，具有一定临床意义，可
作为肺癌、黑色素瘤等早期诊断与预后评价的标记
物［25］。烯醇化酶在重离子辐照绵羊精子中表达上调，
可能是由于绵羊精子在重离子辐照过程中通过维持高
能量代谢以保护精子免受辐照损伤所引起。
这 3 种蛋白质在重离子辐照绵羊精子过程中的功
能，有待在今后的试验中进一步结合其他技术进行深
入研究和探讨。
4 结论
热的 Trizol 法制备精子蛋白结合 0. 35mg(pH4 ～
7)的上样量能够建立绵羊精子全蛋白质图谱。绵羊
精子经不同剂量重离子辐照后蛋白质的表达存在差
异，对差异表达蛋白质的研究有利于探索绵羊精子在
重离子辐照过程中的生理状态，筛选与哺乳动物辐照
生殖有关的蛋白质生物学标志。
参考文献:
［1］ Ramalho-Santos J， Amaral A， Sousa A P， et al． Probing the
Structure and Function of Mammalian Sperm using Optical and
Fluorescence Microscopy［J］． Modern Research and Educational
Topics in Microscopy，2007，394 － 402
［2］ Mason C E， Seringhaus M R， Sattler de Sousa e Brito C．
Personalized genomic medicine with a patchwork，partially owned
genome［J］． Yale J Biol Med，2007，80(4):145 － 151
［3］ Peddinti D，Nanduri B，Kaya A，et al． Comprehensive proteomic
analysis of bovine spermatozoa of varying fertility rates and
identification of biomarkers associated with fertility［J］． BMC
Systems Biology，2008，2(19):1 － 14
［4］ Lefièvre1 L，Chen Y J，Conner1 S J，et al． Human Spermatozoa
Contain Multiple Targets for Protein S-Nitrosylation:An Alternative
Mechanism of the Modulation of Sperm Function by Nitric Oxide
［J］． Proteomics，2007，7(17):3066 － 3084
［5］ 王忠华，陈小坚，包旭升，陈玉玲，顾勒琴 ． 辐照处理对 Bt 水稻苗
期生理生化特性的影响［J］． 核农学报，2011，25(1):0174 －
0178
［6］ 罗红兵，赵 葵，周文新，倪媚楠，屠乃美，孔福全 ． 重离子辐射诱
导玉米雄性不育突变系的遗传研究［J］． 核农学报，2008，22
(3):296 － 299
［7］ 押辉远，谷运红，王卫东，秦广雍 ． 辐照提高小麦反转录转座子
Wis2-1A 的转录并影响其邻近基因表达［J］． 核农学报，2008，22
(5):595 － 599
［8］ 唐掌雄，刘志芳，邵俊明，龚胤昕，等 ． 离子辐射育种研究进展
［J］． 核农学报，2005，19(4):312 － 316
［9］ 赵兴绪 ． 兽医产科学(第三版)［M］． 中国农业出版社，2002:
185
［10］ Triwulanningsih E， Situmorang P， Sugiarti T， et al． Effect of
glutathione addition to the sperm diluent medium on quality of bovine
chilled semen［J］． Indonesian Journal of Agriculture，2010，3，60 －
65
［11］ 高建明 ．动物繁殖学［M］． 中央广播电视大学出版社，2003:119
－ 131
［12］ Jameel T． Sperm swim-up:a simple and effective technique of semen
processing for intrauterine insemination［J］． J Pak Med Assoc，
2008，58:71 － 74
［13］ 陈 龙，朱化彬，沙里金，韩伟东，王栋，王宗礼，郝海生，杜卫华，
程金华等 ． 牛精子蛋白质组学技术平台的建立及冻融前后精子
差异蛋白初步分析［J］． 中国生物工程杂志，2008，28 (7) :37
－ 42
［14］ Bradford M M A． Rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye
binding［J］． Anal Biochem，1976，72:248 － 254
［15］ Chevallet M，Luche S，Rabilloud T． Silver staining of proteins in
polyacrylamide gels［J］． Nat Protoc． 2006，1(4):1852 － 1858
［16］ Braunstein S，Badura M，Xi Q R，et al． Regulation of Protein
Synthesis by Ionizing Radiation［J］． Molecular and cellular biology，
2009，29(21):5645 － 5656
［17］ 王菊芳，Weyrather W K． 辐照剂量率对细胞存活的影响［J］． 肿
瘤，2004，24(1):6 － 17
［18］ Landino L M，Moynihan K L，Todd J V，et al． Modulation of the
redox state of tubulin by the glutathione / glutaredoxin reductase
system［J］． Biochem Biophys Res Commun，2004，314(2):555 － 60
［19］ LI M，Feng Y G，Gao Y， et al． Glutaredoxin system and its
regulation tothe cytosolic thiol-redox status［J］． Acta biophysica
sinica，2007，23(5):343 － 350
［20］ Jae J S，Juong G R，Mohan S，et al． Glutaredoxin as a sensor of
oxidative stress mediated by H2 O2［J］． The Journal of Biological
Chemistry，2002，277:46566 － 46575
［21］ Rajappa S，Kenchappa，Vijayalkshmi R． Glutaredoxin is essential
for maintenance of brain mitochondrial complex I:studies with MPTP
［J］． The FASEB Journa，2003，17(6):717 － 719
［22］ Zhang J，Brewer S，Huang J，et al． Overexpression of transcription
factor AP-2alpha suppresses mammary gland growth and
morphogenesis［J］． Dev Biol，2003，256(1):127 － 45
［23］ Cheng Y H， Bruce J A， Shaikh H， et al． Critical role for
transcription factor AP-2 in human trophoblast differentiation［J］．
Physiological Genomics，2004，18:99 － 107
［24］ Liu K J，Shi N Y． The role of enolase in tissue invasion and
metastasis of pathogens and tumor cells［J］． J． Cancer Mol，2007，3
(2):45 － 48
［25］ 李征宇，赵 霞，杨金亮，魏于金 ． 顺铂作用卵巢癌细胞株的蛋白
质组学研究［J］． 中国科学，2005，35(3):254 － 261
(责任编辑 邱爱枝)
516