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生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 12期
GFP用于单核细胞增生李斯特菌 PrfA
调控毒力基因 actA转录表达的研究
冯莹颖 1 张晓莉 1 张强 1 罗勤 1
蒋苹 2 钱悦 2 冯爱平 2
(1华中师范大学生命科学学院 遗传调控与整合生物学湖北省重点实验室 ,武汉 430079;
2华中科技大学附属协和医院皮肤科 ,武汉 430022)
　　摘 　要 : 　 PrfA是单核细胞增生李斯特菌 (LM )中迄今为止发现的惟一个调控绝大多数毒力基因转录表达的蛋白因
子。为了研究 PrfA转录调控毒力基因表达的分子机制 ,将无启动子的绿色荧光蛋白 ( GFP)基因与毒力基因 actA的启动子
融合 ,连接到穿梭载体 pLSV16质粒上 ,构建成表达融合载体 pLSV162PactA2gfp,然后将其电转化入 LM野生株 P14、PrfA高
表达突变株 P14a和 prfA基因等位缺失突变株 A42中表达。利用荧光显微镜和荧光酶标仪检测上述 3株细菌中绿色荧光
蛋白的不同表达强度 ,从而评价 actA基因依赖于 PrfA的转录活性强弱。结果显示 ,绿色荧光蛋白在 P14a中发出的荧光强
度最高 , P14次之 , A42最弱 ,两两比较均有显著差异 ( P < 0101) ,表明毒力基因 actA的转录水平高低与 PrfA的活性成正相
关 ,其转录表达依赖于 PrfA的调控 ;该试验同时也显示 GFP能方便、有效地用于研究 PrfA调控 LM不同毒力基因的转录表
达水平。
关键词 : 　单核细胞增生李斯特菌 PrfA actA毒力基因 绿色荧光蛋白报告基因 转录调控
Use of GFP to Study the Expression of the Virulence Gene actA
Regulated by PrfA in L isteria m onocytogenes
Feng Yingying1 Zhang Xiaoli1 Zhang Q iang1 Luo Q in1 J iang Ping2 Q ian Yue2 Feng A ip ing2
(1 Hubei Key Laboratory of Genetic Regulation and Integrative B iology, College of L ife Sciences, Central China N orm al University,
W uhan 430079; 2 Departm ent of Derm atology, Union Hospital Tongji M edical College,
Huazhong University of Science and Technology, W uhan 430022)
　　Abs trac t: 　 PrfA is the only regulatory p rotein identified to date to be necessary for the regulation of the exp ression of most of the
virulence genes in L. m onocy togenes. To study the molecular mechanism of the PrfA2dependent virulence genes exp ression, a new ex2
p ression vector pLSV162PactA2gfp was constructed by incorporation of a p romoter of virulence gene actA into up stream of a p romoterless
green fluorescent p rotein gene gfp, and then electroporated into L. m onocy togenes P14 (wild type) , P14a ( PrfA high exp ression mu2
tant) , A42 ( prfA deletion mutant). The exp ression level of actA regulated by PrfA was therefore evaluated with the fluorescence intensity
of GFP p rotein. The results showed that the highest fluorescence intensity was observed in P14a, and the following was in P14, where the
weakest in A42 as well. It suggested that the exp ression of actA was dependent on PrfA regulation. GFP reporter system could facilitate
the research on the regulation of the exp ression of the PrfA2dependent virulence genes in L isteria m onocytogenes.
Key wo rds: 　L isteria m onocytogenes PrfA V irulence gene actA　Green fluorescent p rotein reporter gene　Transcrip tional regula2
tion
收稿日期 : 2009209210
基金项目 :国家自然科学基金 (30500025, 30600535) ,教育部留学回国人员科研启动基金
作者简介 :冯莹颖 (19852) ,女 ,湖北当阳人 ,在读硕士 ,研究方向为微生物分子生物学 ; E2mail: fengyingying08@ yahoo. com. cn,冯莹颖 ,张晓莉为
并列第一作者
通讯作者 :罗勤 (19712) ,女 ,副教授 ,硕士生导师 ,研究方向 :病原微生物单核细胞增生李斯特菌毒力因子表达调控机制的研究 ; E2mail: qinluo@
mail. ccnu. edu. cn
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 12期
单核细胞增生李斯特菌 (L isteria m onocytogenes,
LM )是人畜共患传染病李斯特菌病的主要病原菌 ,
其危害性早有报道。2002年被 WHO列为仅次于大
肠杆菌 O157,沙门氏菌、志贺氏菌后的第四大重要
的食源性致病菌 [ 1, 2 ]。不仅如此 ,研究发现 LM 具有
显著激发强烈的 CD4 + 、CD8 + T细胞免疫反应和较
弱的体液反应的能力 ,减毒的 LM 突变株因而成为
研制新型抗感染药物和生物治疗肿瘤的理想外源性
抗原表达载体 [ 3, 4 ] ,受到众多科研人员的高度重
视。因此 ,对于 LM 毒力基因表达调控机制的研究
将有助于加深对 LM 致病机理的认识 ,提高食品卫
生安全以及促进其临床应用的实现。目前 ,国内
外已建立起多种分析鉴定体内特异表达的细菌毒
力基因的方法。本研究旨在利用绿色荧光蛋白报
告基因 ,研究单核细胞增生李斯特菌 PrfA调控毒
力基因 actA的转录表达 ,为揭示细菌致病机理提
供了新途径。
1 材料与方法
111 菌种、质粒
E. coli DH5α、LM野生株 P14、prfA 基因等位缺
失突变株 A42、PrfA高表达突变株 P14a、质粒 pKEN2
(携带无启动子的 gfp基因 )以及穿梭载体 pLSV16
均为本实验室保存。
112 试剂
DNA聚合酶、限制性核酸内切酶、PCR反应试
剂、氨苄西林、四环素等均购自宝生物工程公司 ; T4
连接酶购自 NEB公司。BH I( brain heart infusion)培
养基购自 D ifco公司 ; MEM (m inimal essential medi2
um)培养基按照文献 [ 5 ]配制。
113 　LM基因组 DNA的提取、PCR片段和酶切片
段的纯化回收
LM基因组的提取采用上海赛百盛公司细菌基
因组提取试剂盒 ,按照试剂盒的说明进行操作。提
取的基因组作为 PCR反应的模板。 PCR片段和酶
切片段的纯化回收采用 Omega公司凝胶回收试剂
盒 ,按照试剂盒的说明进行操作。
114　表达融合载体 pLSV162PactA2gfp的构建及鉴定
首先用 X baⅠ和 PstⅠ双酶切从 pKEN2中得
到无启动子的 gfp基因 ,并将其插入载体 pLSV16
中 ,形成 pLSV162gfp;同时以 PactA 2F ( 5′2AGCGCT2
TCTAGAAGCAGCGAAAG23′) 和 PactA 2R ( 5′2TC2
CTCTCTAGACGCTAATACAACC23′)为引物 (下划
线为 X ba Ⅰ限制性酶切位点 ) ,以 LM 全基因组
DNA为模板 , PCR扩增得到 actA 基因启动子片段
PactA。经 XbaⅠ酶切后插入到 pLSV162gfp中 ,构建成
穿梭表达融合载体 pLSV162PactA2gfp,转化大肠杆菌
DH5α,提取质粒 DNA,利用引物 GFP2CHECK2R ( 5′2
GTCTTGTAGTTCCCGTCATC23′)和 PactA2CHECK2F
(5′2GGGAAGCAGTTGGGGTTAAC23′) ,菌落 PCR鉴
定所得克隆。初步鉴定的阳性克隆最后经上海基康
公司测序确认。所得表达融合载体 pLSV162PactA2
gfp分别电转化入 3株 LM菌中。载体 pLSV162Pac2
tA2gfp的构建如图 1所示。
图 1 载体 pL SV162PactA2gfp构建示意图
115　绿色荧光蛋白的表达与荧光强度的检测
将待检 LM 菌置于 BH I液体培养基中培养至
OD600达 014,取 2 m l菌液 , 8 000 r/m in短暂离心 ,弃
上清 ,菌体用 0115 mol/L PBS ( pH712 )重悬 ,再离
心 ;然后加入 2 m l MEM 培养基重悬菌体 ,置于
37℃、5% CO2环境中孵育 30 m in后 ,离心并用 PBS
溶液洗两次。用无菌牙签尖端沾取少量菌体在载
玻片上有规律的点击 ,盖上盖玻片 ,荧光显微镜
Leica DM4000B ( 480 nm )观察 GFP的表达。同时
取 PBS悬液 200μl,用全自动荧光酶标仪 FLx5000
在激发波长 485 nm和发射波长 530 nm下检测荧
光强度 ,试验重复 3 次取其平均值 ,并应用 ori2
041
2009年第 12期 　冯莹颖等 : GFP用于单核细胞增生李斯特菌 PrfA调控毒力基因 actA转录表达的研究
gin510统计分析软件对试验数据进行差异显著性
分析。
2　结果
211　actA启动子的 PCR扩增结果
用设计的 PactA 2F /R为引物 ,以提取的 LM 全
基因组 DNA为模板 , PCR扩增获得 actA 启动子片
段。PCR产物经 115%的琼脂糖凝胶电泳检测 ,可
见一条清晰的约 270 bp的电泳条带 ,与预期片段大
小相符 ,见图 2。
图 2　ac tA启动子的 PCR扩增结果
212　无启动子的 gfp基因的酶切回收
从本室保存的携带有无启动子 gfp 基因的
pKEN2载体 DNA中 ,利用 X baⅠ、PstⅠ双酶切获得
全长为 750 bp的 gfp基因片段。酶切片段产物经
110%的琼脂糖凝胶电泳检测后 (图 3) ,采用试剂盒
从凝胶中回收并纯化 gfp基因片段。
图 3　gfp基因片段的双酶切回收结果
213　GFP表达融合载体的筛选鉴定
首先 ,将体外构建的 GFP表达融合载体 pLSV162
PactA2gfp转化到大肠杆菌 DH5α中 ,然后提取转化
子 DNA ,利用设计的引物 : GFP2CHECK2R 和 Pac2
tA 2CHECK2F筛选 PactA以正确方向插入到无启动
子 gfp基因上游的阳性克隆。如图 4所示 ,阳性克
隆的 PCR产物经 1%的琼脂糖凝胶电泳检测 ,得
到的条带与预期的 552 bp片段大小基本相符。最
后 ,将 PCR筛选得到的阳性克隆 DNA送到上海基
康公司测序 ,以确认无启动的 gfp基因与 actA启动
子基因已经融合并正确克隆至表达载体 pLSV16
上 , GFP表达融合载体 pLSV162PactA2gfp构建成功。
图 4　GFP表达融合载体 pL SV162PactA2gfp的
PCR筛选鉴
214 　GFP表达的检测
21411　荧光显微镜观察 GFP的表达 在荧光显微
镜蓝光激发 (485 nm)下 , GFP荧光蛋白在 P14、P14a
及 A42中的表达有较为明显的差异。从图 5可以
看出 GFP在 PrfA高表达突变株 P14a中所激发的荧
光最强 ,在野生株 P14中荧光强度有所降低 ,而在
prfA基因等位缺失突变株 A42中的荧光非常微弱 ,
几乎观测不到。
21412　荧光酶标仪检测 GFP表达的荧光强度 　利
用荧光酶标仪 ,在设定激发波长 485 nm、发射波长
530 nm、强度为 20的条件下 ,检测 GFP在 LM 3种
菌株中的荧光强度。结果显示 , GFP在 PrfA蛋白高
表达突变株 P14a中荧光值最高 ,在野生株 P14中有
所降低 ,而在 prfA 基因等位缺失突变株 A42中最
低 ;且 GFP在突变株 P14a与野生株 P14中所显示
的荧光强度有显著差异 ,野生株 P14与等位缺失突
变株 A42比较也有显著性差异 ( P < 0101)。3次试
验的平均值如图 6所示。
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 12期
图 5　GFP在 3种 LM 菌中表达的荧光显微镜观察结果
图 6　GFP在 3种 LM 菌中表达的荧光酶标仪检测结果
综合以上两组试验 ,结果均显示 GFP在 PrfA蛋
白高表达突变株 P14a中的荧光强度最高 ,在 prfA基
因等位缺失突变株 A42中的荧光强度最弱 ,表明
actA基因的转录水平高低与 PrfA的活性高低正相
关 ,该基因的表达依赖于 PrfA的调控。
3　结果和讨论
311 试验结果与方法解析
面对复杂的宿主环境 ,细菌通过调节不同毒力
基因的表达来实施其感染过程 ,而 LM致病性与多
种毒力基因编码的毒力因子有关。其中 ,与 LM胞
内感染生活周期有关的 6个主要毒力基因 ( prfA, pl2
cA, h ly, m pl, actA, plcB )聚集成簇 ,称为李斯特菌毒
力岛 (L IPⅠ)。 PrfA ( positive regulatory factor A )蛋
白是由 LM毒力岛中的 prfA 基因编码 ,是 LM 中迄
今为止发现的唯一能调节绝大多数毒力基因转录表
达的蛋白 ,能特异性识别并结合到靶启动子转录起
始点上游约 40 bp处的一段 14 bp 长的对称序列
( TTAACANNTGTTAA, N代表 TCGA中任一碱基 ) ,
即所谓的 PrfA2box,从而诱发依赖于 PrfA的毒力基
因转录 [ 6 ]。毒力因子 ActA蛋白由毒力岛中的 actA
基因编码 ,能诱导宿主细胞肌动蛋白纤丝聚合在细
菌末端 ,与细菌在宿主细胞内的极向运动和细胞间
的扩散密切相关 ,是 LM重要的毒力因子之一。actA
基因启动子上具有 PrfA的识别位点 TTAACAAATT2
AG[ 7 ]。为了探讨 PrfA对毒力基因 actA的表达调控
作用 , ‘本研究将 actA 基因启动子置于无启动子的
绿色荧光蛋白 gfp基因之前 ,构建了一个表达融合
载体 pLSV162PactA 2gfp ,然后分别电转化入单核细
胞增生李斯特菌野生株 P14、PrfA蛋白高表达突变
株 P14a和 prfA基因等位缺失突变株 A42中 ,并借
助荧光显微镜和荧光酶标仪检测 GFP在上述 3株
细菌中的表达强度 ,从而监测 actA 基因依赖于
PrfA的转录活性强弱。试验结果显示绿色荧光蛋
白在 P14a中的荧光强度最高 ,在 A42中的荧光强
度最弱 ,表明 actA 基因的转录水平高低与 PrfA的
活性高低成正相关 ,该基因的表达依赖于 PrfA的
调控。同时 ,本研究也表明了利用融合的绿色荧
光蛋白报告基因可以较为便利地研究 PrfA 调控
LM毒力基因表达的水平 ,为阐明 LM 致病机理奠
定基础。另外 ,所构建的表达融合载体 pLSV162
PactA 2gfp在 gfp基因的 5′端有一个 X baⅠ酶切位 ,
因此可以方便地进行 LM 不同毒力基因启动子的
替换 ,便于研究 LM 不同毒力基因依赖于 PrfA 调
控表达的水平。
312 试验条件的改进
MEM 培养基 ( m inimum essential medium ) 是
Harry Eagle于上个世纪 50年代开发 ,是最常用的细
胞培养基之一 ,早期应用于正常哺乳动物成纤维细
胞和特定 HeLa细胞亚系的培养。本研究使用的
MEM培养基成分比例与用于细胞培养的 MEM相比
稍有改变 [ 5 ] ,与丰富培养基 BH I的营养成分有着很
大的区别。试验表明 ,在丰富培养基 BH I中除了
h ly、plcA以外 ,受 PrfA蛋白调控的细菌毒力基因的
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2009年第 12期 　冯莹颖等 : GFP用于单核细胞增生李斯特菌 PrfA调控毒力基因 actA转录表达的研究
表达水平较低 ,但如果转移到 MEM 培养基中 , prfA
基因和大多数 PrfA蛋白调控的毒力基因的转录水
平就可以得到诱导 [ 8 ]。因此 ,本试验在对 GFP进行
荧光强度检测前 ,把携带有融合载体 pLSV162PactA2
gfp的 3种菌株从液体培养基 BH I中转移到 MEM
中孵育 30 m in, GFP在 PrfA蛋白高表达突变株 P14a
和 prfA基因等位缺失突变株 A42中的表达与在野
生株 P14中的表达相比均有显著差异 (图 5,图 6) ,
使得毒力基因 actA依赖于 PrfA蛋白转录调控的程
度能直接表现在 GFP的荧光强度上 ,从而较好地体
现了在 PrfA蛋白的不同表达水平下 , actA启动子依
赖于 PrfA的不同转录水平。
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