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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(7):234-241
收稿日期 ：2015-10-08
基金项目 ：河南省高等学校重点科研项目（15A180006），河南师范大学博士科研启动费支持课题，河南师范大学青年科学基金资助
作者简介 ：姜晓冰，女，讲师，研究方向 ：食品微生物污染与控制 ；E-mail ：jxb841001@163.com
通讯作者 ：于涛，男，讲师，研究方向 ：食品微生物污染与控制 ；E-mail ：yutao7777@hotmail.com
单核细胞增生李斯特菌喹诺酮耐药机制研究
姜晓冰1  于涛2  牛亚冰3  徐雅梦1  石磊4  王海磊1 
（1. 河南师范大学生命科学学院，新乡 453007 ；2. 新乡学院生命科学技术学院，新乡 453000 ；3. 天津科技大学食品工程与生物技术学院，
天津 300457 ；4. 华南理工大学轻工与食品学院，广州 510640）
摘 要 ： 以食源性单核细胞增生李斯特菌（LM）环丙沙星耐药株为研究对象，旨在调查 LM对喹诺酮产生耐药的分子机制。
采用琼脂二倍稀释法测定菌株对环丙沙星的最小抑菌浓度（MIC）；通过 PCR检测喹诺酮耐药决定区（QRDR）基因突变以及质粒
介导喹诺酮耐药（PMQR）基因的分布；实时荧光定量 PCR检测 lde基因在 LM菌株中的相对表达量；利用 SOE-PCR技术构建 lde
基因缺失突变株，调查外排泵 Lde的作用。结果表明，15株 LM耐药菌株 GyrA、GyrB、ParC和 ParE亚基的氨基酸序列与敏感株
100%相似；所有菌株中均未检出 PMQR基因。加入外排泵抑制剂利血平后，菌株 L28和 L47对环丙沙星的 MIC值分别下降为原
来的 1/8和 1/4。lde基因在耐药株和敏感株中均有表达，且表达量相近；在环丙沙星的作用下，lde基因在耐药株中的相对表达量
增加显著，而在敏感株中的表达量基本没有变化；加入利血平后，lde在耐药株中的表达明显受到抑制。缺失 lde基因后，菌株对
环丙沙星由耐药转为敏感；利血平存在下突变株对环丙沙星的 MIC值不受影响。本研究证明外排泵 Lde介导 LM对喹诺酮类药物
耐药。
关键词 ： 单核细胞增生李斯特菌；喹诺酮；耐药；外排泵
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.033
Study on the Quinolone-resistant Mechanisms of Listeria
monocytogenes
JIANG Xiao-bing1 YU Tao2 NIU Ya-bing3 XU Ya-meng1 SHI Lei4 WANG Hai-lei1
（1. College of Life Sciences，Henan Normal University，Xinxiang 453007 ；2. College of Life Science and Technology，Xinxiang University，
Xinxiang 453000 ；3. College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457 ；4.
College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640）
Abstract: Using ciprofloxacin-resistant strains of Listeria monocytogenes（LM）isolated from food as research object，this study aims
to understand the quinolone-resistant mechanisms of LM. The minimum inhibitory concentration（MIC）of ciprofloxacin by the strain was
determined by the agar dilution method. The mutations in the quinolone resistance-determining region（QRDR）and the presence of plasmid-
mediated quinolone resistance（PMQR）genes were investigated using PCR. Expression levels of lde gene under different conditions were
detected by qRT-PCR. To address the role of efflux pump Lde in ciprofloxacin resistance，deletion mutant in lde was constructed using SOE-
PCR. Results showed that the amino acid sequences of GyrA，GyrB，ParC，and ParE in 15 resistant strains showed 100% similarity with the
sequences of sensitive strains，and no PMQR genes were detected in any of the resistant strains. In the presence of reserpine，an efflux pump
inhibitor，the MICs of ciprofloxacin by strain L28 and L47 reduced to the 1/8 and 1/4 of original one. The expression of lde was observed in all
sensitive and resistant strains by similar values. After treatment with ciprofloxacin，the resistant strains showed significant increases in lde，
however，no obvious changes in expression of lde were observed in the sensitive strains. In the presence of reserpine，the expression of lde
significantly inhibited in resistant strains. The mutant lacking the lde gene was susceptible to ciprofloxacin and its MIC of ciprofloxacin did not
change in the presence of reserpine. Our data demonstrated that efflux pump Lde mediated quinolone resistance in L. monocytogenes.
Key words: Listeria monocytogenes ；quinolone ；antimicrobial resistance ；efflux pump
2016,32(7) 235姜晓冰等：单核细胞增生李斯特菌喹诺酮耐药机制研究
单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，
LM）是一种典型无芽孢细胞内寄生的革兰氏阳性菌，
是人畜共患传染病李斯特菌病（Listeriosis）的主要
病原菌，常引起脑膜炎、败血症和单核细胞增多等
症状。LM 能在多种恶劣环境条件下生存和繁殖，导
致食品在加工和运输过程中易受其污染，被世界卫
生组织列为仅次于大肠杆菌 O157∶H7、沙门氏菌、
志贺氏菌后的第四大重要的食源性致病菌［1］。
喹诺酮类是由萘啶酸发展起来的全合成抗菌药
物，具有独特的作用机制、优秀的药物动力学性能
和抗菌活性等特性，在临床和兽医上得到了广泛的
应用。一直以来，喹诺酮类药物并没有被用于临床
治疗李斯特菌病，但是由于此类药物在临床上的频
繁使用，间接的促进了耐喹诺酮类 LM 的出现［2］。
巢国祥等［3］对江苏省 8 类食品中 LM 的调查结果
显示，菌株对诺氟沙星和环丙沙星的耐药率分别为
25.6% 和 9.3%。Yan 等［4］对 2005-2007 年河北省食
源性 LM 耐药性监测发现 17.8% 的菌株对环丙沙星
表现出耐药性，耐药率仅次于头孢噻肟。
目前细菌对喹诺酮类的耐药机制主要有 3 种 ：
一 是 编 码 DNA 促 旋 酶（gyrA 和 gyrB 编 码 ） 和 拓
扑异构酶 IV（parC 和 parE 编码）基因的喹诺酮耐
药 决 定 区（Quinolone resistance-determining region，
QRDR）发生突变，导致氨基酸置换使药物不能与
靶酶结合［5］。QRDR 突变是细菌对喹诺酮类药物产
生耐药的最主要原因［6］。Lampidis 等［7］的研究表明，
gyrA 基因 QRDR 的 Ser84 → Thr 和 Asp/Glu88 → Phe
突变可能导致 LM 对萘啶酸耐药。二是主动外排系
统 表 达 增 强［8］。Godreuil 等［2］ 研 究 发 现 LM 菌 株
中主要易化子超家族（Major facilitator superfamily，
MFS）外排泵 Lde 与 LM 对喹诺酮耐药密切相关。三
是质粒介导的喹诺酮耐药（Plasmid-mediated quino-
lone resistance，PMQR）［9］。PMQR 基因在肠杆菌科
和弧菌科等革兰氏阴性菌中分布广泛，并且能够通
过基因水平转移在不同种属细菌间快速传播［10］。
耐喹诺酮类 LM 菌株不断检出，但是目前关于
LM 对喹诺酮耐药机制的研究却很少。因此，本研究
以分离自食品的 15 株环丙沙星耐药株为研究对象，
通过检测 QRDR 基因突变、PMQR 基因的分布以及
外排泵 Lde 在 LM 喹诺酮耐药中的作用，系统性调
查 LM 对喹诺酮类药物产生耐药的分子机制，旨在
为预防和控制 LM 耐药菌株的出现奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株及质粒 食源性单核细胞增生李斯特菌
由本实验室保存 ；大肠杆菌 DH5α 购自北京博迈德
基因技术有限公司 ；穿梭质粒 pKSV7 由中科院微生
物研究所刘钢教授和浙江大学方维焕教授惠赠。
1.1.2 培养基及主要试剂 培养基购自北京陆桥生
物技术有限公司 ；环丙沙星、氨苄西林和利血平购
自 Sigma 公司 ；Taq DNA 聚合酶、dNTPs、pMD18-T
载体、限制性内切酶 Xba I 和 Pst I 均购自大连宝生
物工程有限公司 ；细菌 RNA 提取试剂盒、cDNA 第
一链合成试剂盒、RealMasterMix（SYBR Green）、细
菌基因组 DNA 提取试剂盒、质粒小提试剂盒购自北
京天根生化科技有限公司 ；T4 连接酶购自北京博迈
德基因技术有限公司。
1.1.3 仪器与设备 DH360 型电热恒温培养箱，北
京科伟永兴仪器有限公司；THZ-82 气浴恒温振荡器，
金坛天竟实验仪器厂 ；TGL-16B 型离心机，上海安
亭科学仪器厂 ；ETC811 型基因扩增仪，北京东胜创
新生物科技有限公司 ；DYY-8C 型电泳仪，北京市
六一仪器厂 ；UNIVERSAL HOOD II 凝胶成像分析系
统、Chromo 4 实时荧光定量 PCR 仪，美国 Bio-Rad
公司 ；Eporator 电转化仪，德国 Eppendorf 公司。
1.2 方法
1.2.1 药物敏感性实验 采用琼脂二倍稀释法测定
LM 菌株对环丙沙星的最小抑菌浓度（MIC），结果
按照美国临床实验室标准协会（CLSI）的标准［11］
进行判读。
1.2.2 PCR 扩增 QRDR 及 PMQR 基因 按照细菌基
因组 DNA 提取试剂盒的步骤提取 LM 菌株的基因组
DNA 作为扩增模板。PCR 扩增 gyrA、gyrB、parC 和
parE 基因所用引物及反应条件参照文献（表 1）。扩
增产物经测序后，采用 DNAman 软件进行序列拼接、
核正和氨基酸序列的推导，并采用 BLAST 软件将
测序结果与 GenBank 数据库进行同源性分析，以确
定 QRDR 靶基因突变情况。PMQR 相关基因（qnrA、
qnrB 和 qnrS）的引物设计及 PCR 反应条件，见表 1。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.7236
1.2.3 外排抑制实验 加入外排泵抑制剂利血平（终
浓度为 20 μg/mL，该浓度对细菌外排泵的抑制作用
明显同时又不影响细菌的正常生长［2，15，16］）后再检
测 LM 对环丙沙星的药物敏感性，观察 MIC 值的变化。
加入利血平后 MIC 值下降 4 倍或 4 倍以上的菌株视
为外排泵阳性菌株，初步判定这些菌株对环丙沙星
的耐药与外排泵有关。采用琼脂二倍稀释法检测加
入利血平前后 LM 突变株对环丙沙星的 MIC 值。
1.2.4 细菌总 RNA 提取 将 LM 菌株接种于 BHI 平
板上 37℃培养 18 h，挑取生长良好的单个菌落至 2
mL BHI 液体培养基中，37℃过夜培养。吸取该培养
液 0.2 mL 至 2 mL BHI 培养液中，37℃培养至对数期。
每个菌株分为 3 个试验组，第 1 组为不加任何抗生
素（作为对照组），第 2 组为加入环丙沙星（浓度为
0.4×MIC 值）后再培养 4 h，第 3 组是在第 2 组的
培养物中加入利血平（20 μg/mL）后再培养 4 h。细
菌总 RNA 的提取按照细菌 RNA 提取试剂盒的使用
说明进行，测定 RNA 的浓度和纯度后用于后续试验。
1.2.5 实时荧光定量 PCR 利用 cDNA 第一链合成
试剂盒将 mRNA 合成第一链 cDNA，-20℃保存备用。
根据 GenBank 的基因序列设计靶基因 lde 和参照基
因 16S rRNA 的引物，由上海英骏生物技术有限公司
合成（表 1）。以反转录反应中得到的第一链 cDNA
作 为 PCR 反 应 模 板， 使 用 RealMasterMix（SYBR
Green）试剂盒进行实时荧光定量 PCR 的扩增。反
应条件为 ：95℃预变性 3 min ；95℃变性 30 s，50℃
退火 30 s，72℃延伸 20 s，39 个循环。采用 ΔΔCT
法进行目的基因表达量的分析。
1.2.6 lde 基因缺失株的构建与分子鉴定
1.2.6.1 引物设计 根据 GenBank 登录的 lde 基因及
上下游同源臂序列，通过 DNAMAN 软件进行同源性
分析，选择保守区域用 Primer 5.0 软件设计扩增上
下游同源臂的特异性引物 ：上游同源臂的扩增引物
为 LP1 和 LP2，全长 525 bp ；下游同源臂的扩增引
表 1 PCR 扩增所用引物
基因 引物名称 序列（5-3’） 退火温度 /℃ 产物大小 /bp 参考文献
gyrA gyrA-F AGTGTAATTGTTGCCCG 48 269 ［2］
gyrA-R ATATCGCCATCAACCGA
gyrB gyrB-F AAGCGCGCGCGTGAAGT 50 308 ［2］
gyrB-R CGAGATTTAGAAACGTC
parC parC-F GAACGTGCGCTTCCAGA 51 449 ［2］
parC-R GTTGCATAACCAGCGGA
parE parE-F GGAAAATTAACGCCAGC 47 278 ［2］
parE-R TCGGTCATGATAACTAC
qnrA qnrA-F TCAGCAAGAGGATTTCTCA 48 627 ［12］
qnrA-R GGCAGCACTATTACTCCCA
qnrB qnrB-F ATGACGCCATTACTGTATAA 53 562 ［13］
qnrB-R GATCGCAATGTGTGAAGTTT
qnrS qnrS-F ACCTTCACCGCTTGCACATT 57 571 ［14］
qnrS-R CCAGTGCTTCGAGAATCAGT
lde RTlde1 GCGATGATTTTGATGGGA 53 168 本研究
RTlde2 AACCGCTGCCGTTGATAG
16S rRNA RT16S1 GGGAGGCAGCAGTAGGGA 50 140 本研究
RT16S2 CCGTCAAGGGACAAGCAG
LP1 GCTCTAGACGAATAACCCCACCACAA 50 525 本研究
LP2 TATGTTGTCTGGGTGGGGGATGAAGCGGAGCAAGAT
LP3 ATCTTGCTCCGCTTCATCCCCCACCCAGACAACATA 50 712 本研究
LP4 AACTGCAGTTCACGGGATTCCAACAG
LP5 ATCTTGCTCCGCTTCATC 50 1852 本研究
LP6 GCACATTAGCCAATACCC
2016,32(7) 237姜晓冰等：单核细胞增生李斯特菌喹诺酮耐药机制研究
物为 LP3 和 LP4，全长 712 bp ；重叠延伸 PCR 的引
物为 LP1 和 LP4，全长 1 237 bp ；检测引物 LP5 和
LP6，全长 1 852 bp。在 LP1 和 LP4 引物的 5 端分
别加酶切位点 Xba I 和 Pst I 及保护碱基，引物由上
海英骏生物技术有限公司合成（表 1）。
1.2.6.2 lde 基因的缺失 以 LM 基因组 DNA 为模
板， 分 别 用 LP1、LP2 和 LP3、LP4 两 对 引 物 扩 增
lde 基因的上下游同源臂，PCR 反应条件为 ：94℃预
变性 5 min ；94℃变性 40 s，50℃退火 40 s，72℃延
伸 40 s，30 个循环 ；72℃延伸 7 min。1% 琼脂糖凝
胶电泳后 PCR 产物纯化回收。然后通过 SOE-PCR
技术融合上下游同源臂，采用 25 μL 反应体系 ：纯
化的上下游同源臂各 3 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，
10 mmol/L dNTPs 1 μL，水 15.3 μL，Taq DNA 聚合酶
0.2 μL。反应条件 ：94℃预变性 5 min ；94℃变性 40
s，50℃退火 40 s，72℃延伸 50 s，8 个循环。再加
入引物 LP1 和 LP4 各 1.5 μL 及 0.2 μL 的 Taq DNA 聚
合酶扩增融合片段的全长，反应条件 ：94℃预变性
5 min ；94℃变性 40 s，50℃退火 40 s，72℃延伸 90
s，30 个循环 ；72℃延伸 7 min。扩增产物经 1% 琼
脂糖凝胶电泳后切胶回收，将回收产物与 pMD18-T
载体连接，采用 10 μL 反应体系 ：pMD18-T 载体 1
μL，目的片段△ lde 4 μL，Solution I 5 μL，4℃连接
过夜 ；构建缺失质粒 pMD18-T-Δlde，并转化至大肠
杆菌 DH5α 感受态细胞中，经含氨苄西林的 LB 培养
基筛选，挑取单个菌落接种于含氨苄西林的 LB 液
体培养基中 37℃过夜培养，用 LP5 和 LP6 引物对菌
液 PCR 进行鉴定，将阳性转化株送至北京博迈德基
因技术有限公司进行测序。
1.2.6.3 重 组 穿 梭 质 粒 pKSV7-Δlde 的 构 建 将 测
序正确的 pMD18-T-Δlde 质粒与 pKSV7 用限制性内
切酶 Xba I 和 Pst I 同步双酶切，采用 20 μL 反应体
系 ：Xba I 和 Pst I 各 1 μL，10×M buffer 2 μL，质粒
7 μL，水 9 μL。37℃水浴锅中放置 4 h。将酶切后的
产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段，
用 T4 连接酶连接回收片段，采用 10 μL 反应体系 ：
pKSV7 双酶切产物 3 μL，酶切后的 lde 基因缺失片
段 5 μL，T4 连接酶 1 μL，10× buffer 1 μL，16℃连
接过夜［17］；构建重组穿梭质粒 pKSV7-Δlde，并转
化至大肠杆菌 DH5α 感受态细胞中，通过菌液 PCR
和双酶切验证。
1.2.6.4 电 转 化 及 L28-Δlde 突 变 株 的 筛 选 与 鉴
定 采用青霉素 G 法制备 LM 感受态细胞［17］。取
10 μL 重组穿梭质粒 pKSV7-Δlde 与 100 μL LM 感受
态细胞混匀，冰浴 10 min 后 2.5 kV 电击 5 ms，立
刻加入 900 μL BHI 液体培养基于 30℃培养 2 h。将
菌液均匀涂布于含氯霉素（15 μg/mL）的 BHI 平板
上，30℃培养 48 h。挑取单个菌落接种至含氯霉素
（15 μg/mL） 的 BHI 液 体 培 养 基 中 30℃ 培 养 24 h，
用 LP5 和 LP6 引物对进行菌液 PCR 筛选鉴定阳性
克隆。将鉴定得到的阳性克隆接种至含氯霉素（15
μg/mL）的 BHI 液体培养基中 42℃传代培养 15 代左
右，再将重组菌接种至不含氯霉素的 BHI 液体培养
基中 42℃传代培养 15 代左右，通过菌液 PCR 检测
缺失条带稳定存在，最终得到 LM-Δlde 突变株。
2 结果
2.1 药物敏感性试验结果
LM 菌株对环丙沙星的药物敏感性结果，见表 2。
3 株敏感菌株对环丙沙星的 MIC 值为 0.5-1 μg/mL ；
15 株耐药菌株对环丙沙星的 MIC 值为 4-16 μg/mL。
表 2 加入利血平前后 LM 菌株对环丙沙星的 MIC 值
菌株 血清型 PFGE 型
MIC/（μg·mL-1）
环丙沙星 环丙沙星 + 利血平
L8 ND ND 0.5 0.5
L81 ND ND 1 1
L69 ND ND 1 0.5
L56 1/2a P1 4 2
L36 1/2a P1 4 2
L18 1/2a P1 4 2
L31 1/2a P5 4 4
L80 1/2a P6 4 4
L79 1/2c P7 4 2
L33 1/2c P7 4 2
L49 4b P3 8 8
L68 4b P4 8 4
L52 1/2c P7 8 4
L48 1/2c P7 8 4
L47 1/2c P7 8 2
L28 1/2a P2 16 2
L45 1/2a P1 16 8
L89 1/2a P5 16 8
注 ：ND 表示未检测
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.7238
加入外排泵抑制剂利血平后，3 株敏感菌株对
环丙沙星的 MIC 值不变 ；15 株耐药菌株中，3 株对
环丙沙星的 MIC 值没有变化，10 株对环丙沙星的
MIC 值降为原来的 1/2，1 株降为原来的 1/4，1 株降
为原来的 1/8。
2.2 QRDR基因突变检测结果
经过 DNA 序列比对，11 株环丙沙星耐药菌株
的 gyrA、gyrB 和 parE 基因序列与 GenBank 数据库
中的相应序列 100% 相似，没有发生碱基变化。11
株 环 丙 沙 星 耐 药 菌 株 中 有 2 株（L28 和 L45） 的
parC 基因序列在第 351 位发生碱基变化（T → A），
但是该碱基突变并未引起氨基酸序列变化。
2.3 PMQR基因检测结果
18 株 LM 菌株中未检出 PMQR 基因（图 1）。
L28 和 L47 中的相对表达量明显下降（P<0.01），分
别为 1.04 倍和 0.72 倍，表明 lde 基因的表达受到利
血平的抑制 ；lde 基因在 L31 和 L45 中的相对表达量
没有明显变化（P ＞ 0.05）。
表 3 lde 基因在 LM 菌株中的相对表达量
菌株 对照组 环丙沙星 环丙沙星 + 利血平
L28 1.47±0.74 4.17±0.79 1.04±0.45
L47 1.02±0.50 3.93±1.11 0.72±0.41
L31 1.22±0.56 1.05±0.85 1.18±0.96
L45 1.67±0.78 1.88±1.12 1.70±0.85
L69 1 1.04±0.75 ND
注 ：ND 表示未检测
2.5 lde基因缺失株的构建与分子鉴定
2.5.1 SOE-PCR 扩 增 结 果 以 L28 的 基 因 组 DNA
为模板，分别用 LP1、LP2 和 LP3、LP4 两对引物扩
增 lde 基因的上、下游同源臂，扩增产物经 1% 琼脂
糖凝胶电泳后得到与预期相符的目的条带（图 2）。
通过 SOE-PCR 将上游同源臂和下游同源臂连接在一
bp
750
500
M 1 2 3 4 5 6
M ：DNA 分子质量标准 ；1 ：qnrA 阳性对照 ；3 ：qnrB 阳性对照 ；5 ：qnrS 阳
性对照 ；2、4 和 6 ：阴性对照
图 1 PMQR 基因扩增结果
2.4 实时荧光定量PCR检测lde基因的相对表达量
通过实时荧光定量 PCR 技术检测 lde 基因在 LM
菌株中的表达量，结果见表 3。L28 和 L47 代表外排
泵阳性菌株 ；L31 和 L45 代表环丙沙星 MIC 值没有
受到利血平影响的菌株 ；L69 代表环丙沙星敏感菌
株。结果显示，lde 基因在耐药株和敏感株中均有表
达，且表达量相近。在环丙沙星的作用下，lde 基因
在 L28 和 L47 中的相对表达量显著增加（P<0.05），
分别为 4.17 倍和 3.93 倍，表明该基因的表达可能受
到环丙沙星的诱导 ；lde 基因在 L31、L45 和 L69 中
的相对表达量没有明显变化（P ＞ 0.05），分别为 1.05
倍、1.88 倍和 1.04 倍。加入利血平后，lde 基因在
bp
750
500
M 1 2 3 4 5 6
bp
2000
1000
M 1 2 3 4 5
A
B
（A）M ：DNA 分子质量标准 ；1 和 2 ：上游同源臂 ；5 和 6 ：下游同源臂 ；3 和
4 ：阴性对照 ；（B）M ：DNA 分子质量标准 ；1-4 ：重叠延伸 PCR 扩增产物 ；
5 ：阴性对照
图 2 SOE-PCR 扩增结果
2016,32(7) 239姜晓冰等：单核细胞增生李斯特菌喹诺酮耐药机制研究
起，经 1% 琼脂糖凝胶电泳得到长为 1 237 bp 的片段，
与预期结果一致（图 2）。目的片段切胶回收后经测
序比对发现缺失一段长为 1 357 bp 的序列，表明 lde
基因已成功缺失。
2.5.2 重组穿梭质粒 pKSV7-Δlde 的构建及鉴定结
果 将测序正确的 pMD18-T-Δlde 质粒与 pKSV7 经
Xba I、Pst I 同步双酶切后，经琼脂糖凝胶电泳得到
与预期值相符的目的条带（图 3）。回收目的片段，
连接转化至大肠杆菌 DH5α 中，菌液 PCR 得到预期
大小的目的条带。双酶切鉴定得到 6 900 bp 和 1 237
bp 两个条带，表明重组穿梭质粒 pKSV7-Δlde 构建
成功。
42℃传代培养 15 代左右后得到双交换缺失株，失去
氯霉素抗性，菌液 PCR 扩增只有一条 495 bp 的片
段（图 3）。测序结果表明已成功缺失 lde 基因，获
得 L28-Δlde 突变株。无氯霉素 37℃传代培养 20 代
的过程中，每一代菌株均只能扩增出一条 495 bp 的
片段，表明 L28-Δlde 具有遗传稳定性。
2.6 L28-Δlde对环丙沙星的MIC值
LM 野 生 株 L28 对 环 丙 沙 星 的 MIC 值 为 16
μg/mL。突变株 L28-Δlde 对环丙沙星的 MIC 值为 1
μg/mL ；加入利血平后，L28-Δlde 对环丙沙星的 MIC
值没有发生变化，仍为 1 μg/mL。
3 讨论
本研究的试验菌株为 15 株食源性 LM 环丙沙星
耐药菌株，通过研究这些菌株中 QRDR 基因突变、
PMQR 基因的分布以及外排泵的作用，旨在阐明 LM
对喹诺酮产生耐药的分子机制。靶基因 DNA 促旋酶
和拓扑异构酶 IV 的突变是细菌对喹诺酮类药物最重
要的耐药机制。已有报道显示 gyrA 基因的 QRDR 突
变可能与 LM 对萘啶酸耐药有关［7］。本研究中 15 株
LM 耐药菌株 GyrA、GyrB、ParC 和 ParE 亚基的氨基
酸序列与敏感株 100% 相似，表明在这些菌株中不
存在靶酶基因突变。此外，PCR 检测结果显示在 LM
耐药菌株中未检出 PMQR 基因。结合以上两点可初
步推断，LM 对喹诺酮耐药可能由外排泵介导。
外排泵是细菌的一种自我保护机制，在细菌体
内广泛存在，能够除去细菌细胞和胞膜中的有害物
质［18］。一些外排泵可以把抗生素、消毒剂、重金属
等作为底物排出菌体外使细菌产生耐药性。外排泵
的失活能够导致细菌对药物从耐药转为敏感 ；相反，
由于外排泵表达调控蛋白的改变或是基因启动子活
性增强能够引起外排泵基因转录水平提高，导致外
排泵表达量增加，继而产生耐药［19］。转运蛋白数据
库（http://www.membranetransport.org/）的信息显示，
LM EGDe 中可能存在超过 200 个外排系统。目前研
究者已发现 Lde 外排泵可能与 LM 对喹诺酮耐药有
关［2，20］。由 lde 基因编码的多重耐药外排泵 Lde 属
于细菌外排系统中常见的 MFS 型，是一种自足型多
药外排转运蛋白，可利用质子偶联交换产生的质子
驱动力外排多种化学结构不同的底物，从而降低细
bp
5000
3000
1500
1000
M 1 2 3 4A
bp
2000
1500
750
500
M 1 2 3 4 5 6 7C
bp
5000
1500
1000
M 1B
（A）M ：DNA 分子质量标准 ；1 ：pMD18-T-Δlde 双酶切产物 ；3 ：pKSV7 双
酶切产物 ；4 ：pKSV7 质粒。（B）M，DNA 分子质量标准 ；1 ：pKSV7-Δlde
双酶切产物。（C）M ：DNA 分子质量标准 ；2 ：Δlde 阳性对照 ；3 和 4 ：lde
阳性对照 ；5 ：阴性对照 ；6 和 7 ：阳性克隆
图 3 重组穿梭质粒的构建及阳性转化子的筛选
2.5.3 阳性转化子的筛选及遗传稳定性鉴定 电转
后，用 LP5 和 LP6 引物进行菌液 PCR 检测，筛选得
到阳性转化子。阳性转化子在含氯霉素的 BHI 培养
基中 42℃传代培养 15 代左右得到单交换菌株，依
然具有氯霉素抗性 ；在不含氯霉素的 BH 培养基中
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.7240
胞内相应物质的浓度。Lde 蛋白由 402 个氨基酸分
子组成，其结构包含 12 个跨膜区域和一个信号肽，
与枯草芽孢杆菌的 Bmr，金黄色葡萄球菌的 NorA，
肺炎链球菌的 PmrA 和粪肠球菌的 EmeA 分别具有
25%、24%、29% 和 44% 的相似性。
利血平是一种具有降血压活性的小分子生物碱，
对 MFS 类外排泵有较好的抑制作用。外排泵抑制试
验表明，加入利血平后大多数 LM 耐药菌株对环丙
沙星的 MIC 值降低，其中 L28 和 L47 对环丙沙星的
MIC 值分别下降为原来的 1/8 和 1/4，表明在这两株
菌中外排泵是介导菌株对环丙沙星耐药的主要原因。
在利血平的作用下，其余 13 株耐药菌株对环丙沙星
的 MIC 值下降不明显甚至没有发生变化，可能是由
于在这些菌株中外排泵对环丙沙星耐药贡献不大或
者没有贡献，也可能是外排泵的活性没有受到利血
平的抑制。实时荧光定量 PCR 检测 lde 基因在 LM
菌株中的相对表达量，结果表明，该基因在耐药株
和敏感株中均有表达，且表达量相近 ；在环丙沙星
的作用下，lde 基因在耐药株中的相对表达量增加显
著，而在敏感株中的表达量基本没有变化 ；随后加
入利血平，可观察到 lde 基因在耐药株中的表达明
显受到抑制。根据这些结果可初步推断外排泵 Lde
可能参与 LM 对环丙沙星耐药。为了进一步证实我
们的推断，明确外排泵 Lde 在 LM 对喹诺酮耐药中
的作用，本研究利用 SOE-PCR 技术构建 lde 基因缺
失突变株。药敏结果显示，突变株对环丙沙星表现
敏感 ；利血平存在下突变株对环丙沙星的 MIC 值不
受影响。由此可进一步证明外排泵 Lde 介导 LM 对
喹诺酮类药物耐药。
4 结论
本研究以分离自食品的 15 株环丙沙星耐药株
为研究对象，系统性调查 LM 对喹诺酮类药物产生
耐药的分子机制。结果表明，LM 耐药菌株的 GyrA、
GyrB、ParC 和 ParE 亚基没有发生氨基酸突变 ；在
这些菌株中也没有检出 PMQR 基因。外排泵抑制试
验表明，LM 对环丙沙星耐药可能与外排泵有关。实
时荧光定量 PCR 结果表明外排泵 Lde 可能参与 LM
对环丙沙星耐药。通过构建 lde 基因缺失突变株，并
检测突变株对环丙沙星的 MIC 值，证明外排泵 Lde
介导 LM 对喹诺酮类药物耐药。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）