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Listeria monocytogenes在经高氧化还原电位酸性水处理的鲜食莴苣上预测模型的建立



全 文 :87 
丁 甜 1, 2 ,董庆利 1 ,相启森 3 , 吴德涣 2, *
(1.上海理工大学食品科学与工程研究所 ,上海 200093;
2.国立江原大学食品科学与生物技术学科 ,韩国春川 200701;
3.西北农林科技大学食品科学与工程学院 , 陕西杨凌 712100)
摘 要:采用高氧化还原电位酸性水(EOW)对接种过单核细胞增生李斯特菌的鲜食莴苣进行处理 ,研究残留菌在不
同温度下的保存期限 。建立 Gompertz, Logistic和 Baranyi初级模型 ,描述单增李斯特菌在不同温度下的生长情况 ,对比
结果表明 , Gompertz模型的判定系数 R2 =0.9913,能够更好地拟合李斯特菌在各个温度下的生长状况 ,并得到李斯特
菌生长的 Gompertz模型生长参数(SGR, LT, MPD)。利用平方根模型对其的最大比生长速率的平方根-温度进行拟
合 ,得到莴苣上单核细胞增生李斯特菌生长的二级模型: SGR=0.015T+0.069。使用判定系数 (R2)、均方误差
(MSE)、偏差因子(BF)和准确因子(AF)对模型进行验证 ,结果表明 ,本研究得出的二级模型能够很好地预测单核细
胞增生李斯特菌在相应环境下的生长状况 。
关键词:单核细胞增生李斯特菌 ,高氧化还原电位酸性水 ,莴苣 ,预测模型 ,验证
StudyonpredictivemodelofthegrowthofListeriamonocytogenes
inready-to-eatletucetreatedwithelectrolyzedoxidizingwater
DINGTian1, 2 , DONGQing-li1 , XIANGQi-sen3 , WUDe-huan2, *
(1.InstituteofFoodScienceandEngineering, UniversityofShanghaiforScienceandTechnology, Shanghai200093, China;
2.DepartmentofFoodScienceandBiotechnology, KangwonNationalUniversity, Chuncheon, Gangwon200701 , Korea;
3.CollegeofFoodScienceandEngineering, NorthwestA& FUniversity, Yangling712100 , China)
Abstract:Theobjectiveofthisstudywastoobservetheantimicrobialeffectofelectrolyzedoxidizingwater(EOW)
againstListeriamonocytogenesinready-to-eatlettuce, anddeveloppredictivemodelsofthegrowthkineticof
L.monocytogenesletucetreatedwithEOW.Shelflifetestsweredoneatsevendiferentstoragetemperatures, and
primarymodels(Gompertz, LogisticandBaranyi)weredevelopedinordertofindthebest-fitmodeltodescribe
thegrowthkineticofL.monocytogenes.ThecomparisonresultindicatedthatGompertzmodelcouldfitthegrowth
kineticsofL.monocytogenesbestatdiferenttemperatureswithahighcorelationcoeficientvalue(R2 =0.9913).
Thegrowthparameters(SGR, LT, MPD)wereobtainedusingGompertzmodel.ThenSPSSwasemployedto
developthesecondarymodelexpressingtherelationsbetweensquarerootofSGRandtemperature: SGR=
0.015T+0.069.UsingtheindicessuchasMeanSquareError(MSE), Biasfactor(BF), Accuracyfactor(AF)to
validatethecurrentmodel, theresultsdemonstratedthatthemodeldevelopedwasqualifiedenoughtopredictthe
growthofL.monocytogenesinpracticeinthefuture.
Keywords:L.monocytogenes;electrolyzedoxidizingwater;lettuce;predictivemodel;validation
中图分类号:TS201.3    文献标识码:A    文 章 编 号:1002-0306(2010)03-0087-05
收稿日期:2009-04-08 *通讯联系人
作者简介:丁甜(1985-),男 ,博士研究生 , 研究方向:食品微生物风险
评估。
基金项目:国家自然科学基金 (30800864)。
  单核细胞增生李斯特菌(单增李斯特菌 , Listeria
monocytogenes, Lm)是一种分布广泛的食源性病原
菌 ,人感染后能引发脑膜炎 、发热性败血性胃肠炎等
临床症状 ,感染后发病死亡率约为 25%[ 1-2] 。单增李
斯特菌广泛存在于自然界土壤 、水 、植物和反刍动
物 、人的粪便中 , 主要是通过污染乳制品 、畜禽产品 、
生熟肉 、蔬菜引起人类致病 , 由于该菌在 4℃的环境
中仍可生长繁殖 [ 3] , 所以它是冷藏食品威胁人类健
康的主要病原菌之一 。近几年来 , 因食品污染单增
李斯特菌而引起的食物中毒暴发事件日见增多 , 已
引起国际社会的广泛关注 [ 4-5 ] 。因此 , 2000年 WHO
DOI :10.13386/j.issn1002-0306.2010.03.037
88 
食品安全工作计划将单增李斯特菌列为必检的食源
性致病菌之一。预测食品微生物学(PredictiveFood
Microbiology)是运用微生物学 、数学 、统计学和应用
计算机学建立起来的新兴学科 [ 6-7 ] 。它的主要研究
内容是利用数学模型定量描述和预测微生物在特定
食品特性(pH、水分活度等)和加工流通环境因子
(温度 、包装气体等)条件下生长和存活的模型 [7 ] 。
预测食品微生物学在食品安全的预测和管理中有很
大的应用价值 ,可以用来预测食品的货架寿命和微
生物学安全 ,同时是管理食品安全的重要工具 , 它为
微 生 物 风 险 评 估 (QuantitativeMicrobialRisk
Assessment, QMRA)和 HACCP(Hazard Analysis
CriticalControlPoint)提供了科学依据 [ 9-10] 。高氧化
还原电 位酸性水 (ElectrolyzedOxidizingWater,
EOW),是用强电解水生成装置电解食盐水而成的具
有高电位强氧化性和 pH在 2.0~ 3.5的酸性水 [ 11] 。高
氧化还原电位酸性水具有无毒 、不污染环境 、杀菌效
果好等特点 ,在医疗卫生 、农作物 、家畜和食品等诸
多领域具有很好的应用前景 [ 12-15 ] 。本文研究高氧化
还原电位酸性水(EOW)处理对莴苣样品中单增李斯
特菌的杀菌效果 ,并建立了单核细胞增生李斯特菌
在莴苣上的生长预测模型 ,经验证 ,所得模型能够很
好地表达单核细胞增生李斯特菌的生长状况 ,具有
一定的应用价值 ,并能对将来生活和实验中李斯特
菌的生长做出可靠的科学预测 。
1 材料与方法
1.1 实验材料
高氧化还原电位酸性水  由电解水生成装置
A2-1000(220V, 30A, KoreanE&SFistInc, Seoul,
Korea)电解 0.1%氯化钠溶液得到。当电流设置到
12A时 ,电位酸性水和电位碱性水同时分别从阳极
和阴极管中流出 ,当观察到有稳定的水流从管中持
续流出时 , 15min后 ,从阳极管收集实验所需的高氧
化还原电位酸性水 (氯浓度 50μg/mL;pH<2.7;
ORP:1150 ~ 1180mV);莴苣  购于当地的超市
(GS.Market, Chunchon, Korea),然后立即保存在 4℃
的保鲜冰箱中;实验菌株 L.monocytogenesScotA、
L.monocytogenesATCC19116和 L.monocytogenesATCC
19118;中和剂 含 0.5%硫代硫酸钠的胰蛋白胨生理
盐水溶液。
1.2 实验方法
1.2.1 菌液准备  分别取 10μL原种菌液接种到
10mLTSBYE(TSB, Difco, Sparks, MD, U.S.A.)培养
基中 ,置于 35℃的恒温培养箱里培养 24h,使菌体细
胞浓度大约为 109cfu/mL。然后在 10min, 5000×g,
4℃的离心条件下重复离心 2次 ,得到的菌体用浓度
为 0.1%的蛋白胨缓冲溶液(Buferedpeptonewater,
Difco, USA)冲洗 ,得到浓度为 109cfu/mL的李斯特菌
混合溶液。将上述菌体细胞悬液稀释到 107cfu/mL,保
存在 4℃的恒温箱中备用 。
1.2.2 培养基制备 称取 57.5g牛津培养基(Oxford
mediumbase),溶于 1000mL纯净水中 ,连续缓慢加
热至沸腾 ,使其充分混合均匀 , 1min后 ,在 121℃下
灭菌 10min。当冷却至 45 ~ 50℃时 , 加入 10mL
rehydratedoxfordantimicrobicsupplement, 混合均匀
后 ,制备平板 。
1.2.3 样品的制备 把莴苣外层脱色 、萎蔫的部分
去掉 ,只取新鲜的叶子并用消毒的手术刀切成 3cm×
3cm的小片 ,每次称取 10g置于无菌的均质袋(Nasco
Whirl-Pak, Janesvile, WI)中 ,做好标记后保存在 4℃
保鲜冰箱中备用(24h以内)。将浓度为 107cfu/mL的
菌悬浮液接种到莴苣样品上 ,使样品的初始菌数大
致为 105cfu/g。
1.2.4 实验操作 将接种后的莴苣样品在常温下用
高氧化还原电位酸性水(EOW)浸泡 3min,转移到新
的均质袋中 ,然后加入 90mL经高压灭菌的蛋白胨溶
液 ,进行 2min的破碎处理 ,使莴苣叶破碎完全 ,形成
悬浮溶液 。对处理过的莴苣叶进行菌数测定 ,同时
判定高氧化还原电位酸性水的杀菌能力 。本实验选
定 4、10、15、20、25、30、35℃不同的培养温度 ,根据不
同的温度选定不同的测试时间段 ,每隔一定时间分
别取出一定量样品进行菌数测定 ,取合适稀释度 ,用
平板计数法得出活菌数 。
1.2.5 初级模型的建立  利用 GraphPadPrism
(version4, GraphPadSoftware, Inc., SanDiego, CA,
U.S.A.)和 DMFit(Version 2.1., InstituteofFood
Research, NorwichResearchParkNorwichNR4 7UA,
UnitedKingdom.)统计软件进行初级模型的拟合 ,并
利用 实验 得 到 的原 始 数据 建 立 Gompertz[ 16 ] ,
Logistic[ 17 ]和 Barayi[ 18]三种初级模型。对三种模型得
出的 R2 进行比较 ,选取最能符合实验数据的模型 ,
得出其不同温度下的生长曲线 ,得到相应的初级模
型参数。
Gompertz模型:
y=Aexp[ -exp{μe/A(λ-t)+1}] 式(1)
Logistic模型:
y= A
1+exp[ (4μ/A)(λ-t)+2] 式(2)
Baranyi模型:
y=y0 +μA(t)-ln(1+exp[ μA(t)] +1exp(ymax-y0))式(3)
A(t)=t+1vln[ exp(-vt)
+exp(-μλ)-exp(-vt-μλ)]
式中:y表示最终菌落数(logCFU/g);ymax表示
生长过程中的最大菌落数(logCFU/g);y0表示最初
菌落数 (logCFU /g);μ表示最大比生长速率
(logCFU/h);λ表示延滞期(h);v是底物的增长速
率;A, a, b是模型的参数 。
1.2.6 二级模型的建立 二级模型的拟合使用 SPSS
16.0packageprogram(Statisticalpackageforthesocial
science, Chicago, IL, USA)统计软件 ,研究温度(T)
对最大比生长速率(SGR)的影响 ,得到平方根模型。
1.2.7 模型的验证 在模型的验证阶段 ,判定系数
(R2)、均方误差(MeanSquareEror, MSE)、偏差因
子(Biasfactor, BF)和准确因子(Accuracyfactor, AF)
将被用来作为衡量模型的标准。 BF是偏差因子 , 表
89 
表 1 Gompertz, Logistic和 Baranyi模型在不同温度下的判定系数值(R2)
模型 温度(℃)
4 10 15 20 25 30 35
Gompertz模型 0.9858 0.9924 0.9899 0.9953 0.9905 0.9971 0.9878
Logistic模型 0.9834 0.9927 0.9880 0.9946 0.9932 ND 0.9853
Baranyi模型 0.9149 0.9859 0.9763 0.9880 0.9883 ND 0.9682
注:ND表示无结果显示。
表 2 由 Gompertz模型所得出的李斯特菌在不同温度下的生长参数
模型参数 温度(℃)
4 10 15 20 25 30 35
最大比生长速率 SGR(logcfu/g· h) 0.021 0.041 0.076 0.162 0.175 0.277 0.322
生长延迟期 LT(h) 65.31 54.9 21.68 10.15 8.908 5.379 4.88
最大菌体密度 MPD(logcfu/g) 4.01 4.03 4.25 4.52 4.58 4.58 4.59
示实测值是大于预测值(biasfactor>1)或者小于预
测值(biasfactor<1);AF是精确因子 , 表示预测值
和实测值的偏离度。公式如下:
均方误差(MSE)=΢(μ观测值-μ预测值)2 /n 式(4)
 偏差因子(BF)=10[ ΢log(μ观测值 /μ预测值)/n] 式(5)
准确因子(AF)=10[ ΢ log(μ预测值 /μ观测值) /n] 式(6)
2 结果与讨论
2.1 初级模型的建立
接种后的莴苣叶李斯特菌浓度大约为 5.0logcfu/g,
经过 EOW处理后 ,其浓度大致为 2.9 logcfu/g,说明
EOW对李斯特菌的灭活数为 2.1 logcfu/g,具有很强
的杀菌能力 。该结果与 Guentzel[ 18 ]在 2008年发表的
研究成果相似 ,他们发现相同浓度的 EOW在相似条
件下对李斯特菌的灭活数为 2.3 logcfu/g。
将建立的 Gompertz, Logistic和 Baranyi三种模型
进行比较 ,如表 1所示 。通过不同模型在各个温度
下的判定系数 R2进行纵向比较 ,可以看出 Gompertz
模型所得 R2 值较另外两个模型更接近 1, 并且
Logistic模型和 Baranyi模型在 30℃时并不能表达李
斯特菌的生长曲线 ,所以选择 Gompertz模型为本研
究的初级模型。
实验结果表明 ,不同温度下李斯特菌的生长曲
线和 Gompertz模型的吻合情况良好 , Gompertz模型
的平均判定系数 R2 高达 0.9913,使用 Prism软件对
原始数据进行统计分析 ,结果如图 1所示。在 4℃和
10℃的培养条件下 ,李斯特菌生长非常缓慢 ,在培养
的前 50h,李斯特菌数目基本维持在初始水平 ,几乎
没有出现生长态势。随着温度的升高 ,李斯特菌的
生长速度也加快 , 尤其是在 30℃和 35℃, 只需要
15h,李斯特菌就能生长到稳定的水平。初级模型的
拟合得到的模型参数如表 2所示 ,我们也可以清楚
地看到随着温度的升高 ,最大比生长速率(SGR)和
最大菌体密度(MPD)随之增加 ,相反 ,李斯特菌的生
长延迟期(LT)缩短。
2.2 二级模型的建立
根据表 2中得到的不同温度下的最大比生长速
率(SGR),利用 SPSS统计软件进行线性回归分析 ,
从而得到关于温度和 SGR平方根的二级模型(如图
2所示)。由图 2所示 ,图中 SGR的点分布在 linear
周围很近的地方 ,说明温度和李斯特菌的最大比生
图 1 Gompertz模型所描述的李斯特菌
在不同温度下的生长曲线
长速率的平方根有很好的线性关系;R2 =0.981,表明
二级模型的预测准确度高达 98.1%,校正决定系数
R2Adj=0.977,说明仅有 2.3%的总变差不能解释当前
的模型 [19] 。
图 2 二级模型的拟合
平方根模型 [ 20-21]是用来描述环境因子影响的主
要模型 ,其描述温度影响的简单表达式为:
k=b(T-T0) 式(7)
90 
其中 , k是生长速率(Therateofgrowth), b是回
归系数(Regressionconstant), T是温度(℃), T0是微
生物生长理论最低温度 。由上述实验数据得到李斯
特菌在莴苣上生长模型的二级模型为: SGR=
0.015T+0.069。
2.3 二级模型的验证
对模型的验证是一个非常重要的步骤 ,只有通
过了验证 ,所建立的模型才会有价值。在本研究中 ,
R2、MSE、BF和 AF用来作为衡量模型的工具 ,其中
BF和 AF被认为是验证模型的非常有价值的工
具 [ 21-24 ] 。用所得的二级模型计算出相应温度下的预
测值 ,与实验值进行比较 。如图 3所示 , R2 值达到
0.9769 ,预测值与实验值相关性很高 。
图 3 单增李斯特菌预测值和实验值的相关性分析
Adair[ 23]等报道 , MSE的值越小 ,说明模型表达
实验数据表达得越充分 。如表 3所示 , MSE的值为
0.0003 ,说明预测值和实验观察值非常相似 ,均方误
差很小 ,说明该模型能够很好地拟合实验数据 。
表 3 二级模型的 MSE、AF和 BF值
参数 MSE BF AF
数值 0.0003 1.0398 1.1068
  偏差因子(BF)是衡量模型的一个非常重要的参
数 , Ross[25]认为 ,对于微生物生长模型的验证 ,如果
BF值在 0.9~1.05的范围之内 ,认为该模型能够很好
地预测微生物生长速度和生长状况;如果 BF值在
0.7~ 0.9或者 1.06~1.15范围之内 ,则该模型是可以被
接受的;如果 BF值大于 1.15或者小于 0.7,则说明该
模型是失败的。由表 3可知 ,本实验所得 BF值为
1.0398 ,在 0.9~ 1.05的范围之内 ,说明建立的模型能
够很好的预测微生物生长速度和生长状况。当 AF
=1的时候 ,说明模型有很高的精确性 ,数值越大或
越小 ,说明该模型的准确性越低 。如表 3所示 , AF=
1.1068 ,意味着平均起来将有 10.68%的预测值与实
验值不符 ,这是一个比较理想 ,可以接受的结果 。
Dalgaard和 J rgensen[ 26 ]所建立的关于李斯特菌在各
种各样的海产品中的生长模型 ,计算得出的 AF值在
1.4~ 4.0之间;Ross[ 25 ]所建立的葡萄球菌的生长模型 ,
在验证当中得出了 1.53的 AF值;而 Neumeyer[ 27]关
于假单胞菌的模型验证中的 AF值为 1.3。相比较之
下 ,由于平方根模型本身能够很好地描述环境因子
对微生物生长的影响 ,准确因子的值为 1.1068,表明
本实验所建立的模型具有相当高的准确性 。
3 结论
3.1 利用高氧化还原电位酸性水(EOW)处理接种
单增李斯特菌的莴苣样品 ,得到 EOW对李斯特菌的
灭活数为 2.1logcfu/g,说明高氧化还原电位酸性水
(EOW)具有很强的杀菌能力。
3.2 建立了 Gompertz, Logistic和 Baranyi三种初级
模型描述单增李斯特菌在不同温度下的生长情况。
对比结果表明 , Gompertz模型的判定系数 R2 =
0.9913,能够更好地拟合李斯特菌在各个温度下的生
长状况。得到得到李斯特菌在莴苣上存生长模型的
二级模型为: SGR=0.015T+0.069。对模型进行验
证 ,结果表明 ,该二级模型能够很好地预测单核细胞
增生李斯特菌在相应环境下的生长状况 。预测食品
微生物学的优点在于利用存在的数据去预测未来发
展趋势 , 对实际生产和流通过程进行监控 , 具有重
要的意义 , 也是未来的安全和质量控制的发展方向
之一 。综上所述 ,通过该研究所得出的关于李斯特
菌的生长预测模型具有一定的价值 ,能够为将来生
活和实验中李斯特菌的生长情况提供科学的预测 。
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94 
下 VpBJ1.1997的实验数据进行拟合 , 结果表明 ,
Logistic模型比 Gompertz模型及线性模型能更好地
拟合副溶血性弧菌的生长 ,在 α=0.01水平上模型极
显著。拟合结果表明 ,培养温度-pH组合为 39-9.0
时 , Vp比生长速率最大 ,组合为 35-5.5时 , Vp比生
长速率最小 。
3.2 利用平方根模型对 Vp进行最大比生长速率与
温度-pH之间关系的拟合 ,得到 Vp生长的二级双因
素模 型。 预测 得知 , Vp的 最低 生长 温 度为
11.7769℃,最低生长 pH为 7.3773。 F检验表明模型
在 α=0.01显著 ,培养基数据 Bf和 Af验证值在可接
受范围内 ,回归系数分析表明回归系数显著 ,说明此
模型能较好描述 Vp比生长速率与温度-pH之间的
对应关系。
3.3 均匀设计由数学家方开泰和王元 1978年创立 ,
与传统 “正交设计 ”相比 ,均匀设计将实验点在高维
空间内充分均匀分散 ,使数据具有更好的代表性 ,为
揭示规律创造必要条件 。均匀设计在多水平实验研
究中有重要意义 ,在实验点均匀分散的同时可大大
减少工作量 ,缩短实验周期 ,在医药 、化工 、食品及生
物工程等领域都有应用 。本文尝试将均匀设计方法
引入到微生物生长预测模型的建立过程中 ,并得到
较好的实验效果。但在微生物生长动力学研究中 ,
大量数据的积累十分重要 ,均匀设计虽在水平数不
变的条件下可减少实验次数 ,其精准性应进一步进
行验证比对 。
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