全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 11期
单核细胞增生李斯特菌毒力基因 inlB /actA
双缺失突变株的构建
王莉 冯飞飞 张强 冯莹颖 邓灵福 张晓莉 罗勤
(华中师范大学生命科学学院遗传调控与整合生物学湖北省重点实验室,武汉 430079 )
摘 要: 单核细胞增生李斯特菌 inlB和 actA毒力基因的编码产物 In lB和 ActA是与其致病性相关的重要毒力因子,与
该菌在细胞间扩散、传播有着直接的关系, 其中肌动蛋白聚集因子 ActA是细菌由细胞浆扩散至相邻细胞所必须的因子, 而内
化素 In lB在对肝细胞的侵袭过程中起着重要作用。本研究中利用同源重组技术在 inlB缺失菌株基础上成功构建了毒力基因
inlB和 actA 双缺失的突变株,获得减毒突变株, 为构建预防人类和动物疾病的疫苗载体奠定了基础。
关键词: 单核细胞增生李斯特菌 基因敲除 inlB基因 actA基因 同源重组
Construction of aMutant Strain ofL isteria monocytogenes
with a Deletion of inlB and actA
W ang L i Feng Fe ifei ZhangQ iang F eng Y ingying Deng L ingfu Zhang X iao li LuoQ in
( H ubeiK ey Laboratory of Genetic Regulation and IntegrativeB iology,
College of L ife Science, CentralChina N ormal University, W uhan 430079)
Abstrac:t Ac tA and In lB, encoded by actA and inlB, a re essentia l v irulence factors of L isteria m onocy togenes ( LM ). The v iru
lence of LM is direc tly related to its ability to spread from ce ll to cellw ithout leav ing the intrace llu la rm ilieu. Among the bacte rial factors
invo lved in ce lltoce ll spread, actinpo lym er izing prote in ActA is requ ired for bacter ia l spread to adjacent cells, w hile the internalin B
( In lB) p lays an important ro le in the process of invasion the live r ce lls. Based on hom o logous recomb ination techno logy, w e constructed
a double genemutant stra in by deleting two v irulence genes, in lB and actA. The m utant stra in could be further studied as a vacc ine
cand idate to prevent lister io sis and used as a vecto r to de liver he tero logous antigens.
Key words: L ister ia monocy togenes A ttenuated m utant inlB gene actA gene H omo logous recom b ina tion
收稿日期: 20100517
基金项目:国家自然科学基金项目 ( 30970111) ,湖北杰出青年基金项目 ( 2009CDA 124 ) , 华中师范大学科研项目 ( CCNU09Y 01001 ), 华中师范
大学研究生自主科研项目 ( 2009028)
作者简介:王莉,女,在读硕士研究生,研究方向:微生物分子生物学; Em ai:l w angly ly2009@ yahoo. cn
通讯作者:罗勤,副教授,博士,研究方向:微生物分子生物学; Em ai:l q in luo@ m ai.l ccnu. edu. cn
单核细胞增生李斯特菌, 简称单增李斯特菌
(L isteria monocy togenes, LM )是常见的食源性致病
菌, 是人畜共患病李斯特菌病的病原 [ 1, 2] , 主要通
过食用被 LM污染的食品而感染, 死亡率达 30%
以上 [ 3]。一方面, LM 对食品的污染与危害, 已引
起世界各国的普遍关注和高度重视; 另一方面, 在
逐步研究过程中发现, LM 具有显著激发强烈的
CD
4 +
/CD
8+
T细胞免疫反应和较弱的体液反应的
能力,减毒的 LM 突变株因而可以成为研制新型抗
感染药物和生物治疗肿瘤的理想外源性抗原表达
载体 [ 4, 5]。
LM的致病原理主要是毒力因子的协作参与,
其中,内化素 B ( InlB )在对肝细胞的侵袭过程中起
着重要的作用, InlB的受体介导细菌穿越肝细胞、成
纤维细胞、上皮细胞等 [ 6- 8]。肌动蛋白聚集因子
( A ctA )参于 LM的细胞黏附和侵袭 [ 9 ] ,其促使肌动
蛋白聚集驱动 LM穿过胞浆进入相邻细胞使得该菌
能逃避宿主先天性免疫和获得性免疫应答作用 [ 10]。
同时,细胞壁水解酶 ( p60)、酰胺酶 ( Am i)、自溶素
( Auto)等毒力因子均协同参与细菌的黏附与
2010年第 11期 王莉等:单核细胞增生李斯特菌毒力基因 inlB /actA双缺失突变株的构建
侵袭 [ 11- 14]。
本研究通过同源重组的方式, 在 LM缺失了 in
lB毒力基因 ( in lB LM )基础上再进行 actA基因的
缺失, 旨在获得能作为疫苗载体表达外源性抗原的
LMinlB /actA减毒突变株。
1 材料和方法
11 材料
111 菌株与质粒 LM 野生菌株 EGD、pLSV101
(温度敏感性穿梭载体,含有红霉素抗生素标记 )为
实验室保存, 缺失株 LM inlB由德国维尔茨堡大学
生物中心微生物系W erner Goebe l教授惠赠。
112 培养基 BH I培养基 ( B rainTM B ra in H eart
Infusion)购买自 B&D公司。
113 主要试剂 E coR I、Kpn I、BamH I均为
TaKaRa公司产品, Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA
LadderM arker为广东东盛生物科技有限公司产品;
琼脂糖为 AndyB io公司产品; T 4 DNA连接酶为 NEB
公司产品; P lasm id M in iK it I、Q IA qu ick ge l ex trac
t ion kit为 Omega公司产品; U ltraPure P lus SV M in i
prepDNA Purificat ion System、P fu酶为上海 SBS公司
产品。其它所有化学试剂均为进口或国产分析纯
试剂。
114 引物 试验所用引物为表 1所示。
12 方法
121 LM inlB菌株 in lB基因缺失验证 分别用
表 1 本研究所需引物
引物 序列 ( 5- 3)
P1: actAc1F GGGAATTCAGCGACAGATAGCGAAG
P2: actAc1R TATCGGTACCCAATCCTGGATGACG
P3: actAd1R AAGGATCCCCCCTAAAGAGAACACGC
P4: actAd1F AAGGGTACCACCAAAGCTAGCAGAAC
P5: actAcheck2F CGAACAAAGCAGACCTAATAGC
P6: actAcheck2R TTCTTCAATGCCAGCAGAACG
P7: actAcheck1F CGCAGCGGAAATTAAAAAAAGAAGG
P8: actAcheck1R CGCATTTCTTGAGTGTTTTCCTGTTC
P9: in lBch eck1F GAAAGAAAAGCACAACCCAAGAAGG
P10: in lBcheck1R CCTGCTAATGCTCTTAAATCGCTTATG
P11: LSV3 AGTACCATTACTTATGAGCAAG
P12: Un i TGTAAAACGACGGCCAGTG
引物 P9、P10 (表 1 )对 LM野生菌株 EGD, 缺失株
LM in lB进行 in lB片段扩增, 然后经 1% 琼脂糖凝
胶电泳检测。
122 温敏穿梭质粒 pLSV 101actA ( c+ d)的构建
分别用引物 P1、P2及 P3、P4扩增 actA基因上游
c片段和下游 d片段。用 BamH和 E coR双酶切 actA
( c)、actA ( d)和 pLSV101后, T4 DNA连接酶将目的片
段与穿梭载体相连接,然后转化 DH5。挑取单菌落
扩大培养后,提质粒 DNA, 进行 BamH和 E coR双酶
切和 PCR (引物 LSV3和 Uni)鉴定。鉴定为阳性的
克隆由上海英骏生物工程公司测序。将测序正确的
阳性克隆命名为 pLSV101actA ( c+ d)。
123 LMinlB /actA减毒突变株的构建 用电转
化方法将重组穿梭质粒 pLSV101actA ( c+ d)导入
缺失株 LM in lB。通过温度和红霉素抗性压力进行
同源重组, 实现 LMinlB 菌株 actA基因的缺失。
actA基因缺失的构建过程如图 1所示。将阳性菌株
命名为 LM in lB /actA。
图 1 删除 actA基因的原理
2 结果
21 缺失株 LM in lB菌株 inlB基因缺失验证结果
利用引物 P9、P10对 LMin lB的进行 inlB基因
片段扩增,以 EGD为阳性对照。结果如图 2所示,
由于 LMinlB中的 in lB基因缺失了一部分片段, 导
致 P10引物没有结合位点, 所以应无扩增产物, EDG
阳性对照 PCR扩增后得到与预期大小 ( 600 bp)一
致的产物。结果表明,本试验所用到的菌株的确为
inlB基因缺失菌株。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 11期
M. DNA m arker; 1. LM in lB; 2. LM EGD; 3. H
2
O
图 2 PCR验证 in lB基因缺失结果
22 重组穿梭质粒 pLSV 101actA ( c+ d )的构建
结果
将构建的穿梭载体 pLSV 101actA ( c + d )用
BamH I和 E coR I酶切和 PCR验证。由图 3A的酶
切结果可知,嵌合基因 actA ( c+ d) ( 848 bp)拼接片
段已成功插入穿梭载体 pLSV101中; 图 3B显示,
利用引物 Uni和 LSV3进行 PCR反应, 得到与预期
大小 ( 1 100 bp)相同的 PCR产物, 表明 actA ( c+ d)
以正确方向插入穿梭载体 pLSV 101中。进一步的
DNA测序结果也表明插入序列正确无误。
M. DNA m arker; 14. pLSV101actA( c+ d )
图 3 pLSV101actA( c+ d)重组质粒酶切 ( A )及
PCR鉴定 (B )结果
23 LMinlB /actA的构建结果
用电转化方法将重组穿梭质粒 pLSV101actA
( c+ d)转入 LM inlB感受态细胞中, 通过温度和
红霉素抗性压力实现同源重组。使用 actA基因内
侧的特异引物 (含有 c或 d所在片段序列 ) actA
check1F /1R对转化子进行菌落 PCR筛选, 预期阳
性转化子没有扩增产物, 而野生型基因的扩增片段
大小为 900 bp。图 4A中,泳道 3、5和 6对应的转
化子没有扩增产物, 可使用 actA基因外围引物 ac
tAcheck2F /2R进一步鉴定。预期阳性转化子的扩
增产物为 410 bp,而野生型基因的扩增片段大小为
1 520 bp。图 4B中能扩增出 actA片段的转化子 4,
7和野生型菌株一样, 亦能扩增出约 1 520 bp的条
带, 表明这些转化子中的 actA基因未缺失; 而图 4B
中对应的转化子 3、5和 6的扩增产物为约 410 bp,
显示这些转化子基因有缺失。转化子 1和 2号在
410 bp和 1520 bp均有条带, 暗示这两个转化子基
因缺失的位置发生了异常改变。结合图 4的结果,
表明 3、5和 6转化子为我们所需的 actA基因缺失
的阳性转化子,命名为 LMin lB /actA。
M. DNA m arker; W. EGD,阳性对照; 1- 7. 转化子
图 4 用 ac tA特异引物 actAcheck1F /1R(A)或 ac
tAcheck2F /2R( B)对部分转化子的鉴定结果
3 讨论
科研工作者已开展了与减毒相关的研究并获得
了大量缺失突变株,为研制对李斯特菌病安全有效
的预防疫苗和作为运送异源抗原的载体作出相应的
贡献。目前对 LM进行减毒的方法有两种: 一是通
过转座子插入法、质粒转化法和同源重组法,删除与
LM侵袭性相关的毒力因子 (如 H ly、PlcB和 ActA );
二是构建营养缺陷型突变株方法 [ 4, 5]。通过以上方
法已获得了大量具有潜在应用价值的突变株, 包括
LMactA、LMhly、LMplcB、LMp lcA 和 LMp lcA /
p lcB
[ 15, 16 ]等。LMhly虽然毒力显著降低, 但同时也
丧失溶血活性以及以 MHC I类分子方式呈递抗原
的能力; 而 LMactA、LMp lcB和 LMp lcA等突变株
毒力降低不明显 [ 17]。总体看减毒程度与缺失的毒
力基因的功能关系密切。如何在毒力显著降低的前
提下仍能较好的激发免疫应答的能力是评价突变株
价值的重要因素。经过思考设计, 鉴于肌动蛋白聚
合酶 A是 LM致病的关键毒力因子, 而 In lB只针对
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2010年第 11期 王莉等:单核细胞增生李斯特菌毒力基因 inlB /actA双缺失突变株的构建
肝细胞侵袭的专一性特点,本研究挑选 actA与 inlB
这两个毒力基因来构建双缺失减毒株, 以期达到既
在毒力效价方面的显著降低又能保持其呈递抗原载
体能力的目的。
采用同源重组的方法将同源片段定点整合到基
因组中,既易获得突变株, 也可提高基因缺失菌株的
稳定性。同源重组是利用质粒 DNA与基因组 DNA
中所要敲除基因之间的同源序列进行重组, 达到敲
除基因的目的,在特定基因研究中具有其它研究方
法无法比拟的优势。
为了从分子水平检查重组菌是否已将缺失突变
引入 LM,先用设计在缺失部位的引物进行鉴定,由
于这一对引物正好是与删除的部位进行互补, 因此
缺失突变株不能扩增出片段。考虑到 PCR的假阳
性问题,因此需对不能扩增出 actA全长的菌株进一
步分析。用被删除基因外侧的引物扩增, 究其片段
大小是否与野生型对比发生变化,若片段长度变小,
则明确发生了此基因的缺失突变现象。
本试验构建的双缺失 in lB /actA减毒株的毒
性试验结果显示,减毒株导致细胞间不能有效传播
并且直接或间接减少对非吞噬细胞肝细胞的感染。
通过对肝酶的检测, 双缺失 inlB /actA 的 LM未引
起任何肝毒性, 并且不能引起中枢神经系统的感
染 [ 18]。减毒突变株的获得为构建预防人类和动物
疫病的疫苗载体提供了新思路,随着研究的不断深
入,重组李斯特菌必将得到不断改进和提高,为生物
学治疗提供更为广阔的前景。
参 考 文 献
[ 1] 丁建英,韩剑众. 食品中单增李斯特菌的存在现状及检测方法
研究进展. 食品研究与开发, 2008, 29 ( 12) : 171174.
[ 2] 牛华星,肖永霞, 尹旭升,杨志昆. 单核细胞增多性李斯特菌的
毒力因子及检测研究进展. 畜牧与饲料科学, 2009, 30( 1 ): 67.
[ 3] H erlerM, BubertA, GoetzM, et a.l Positive select ion ofmutat ions lead
ing to loss or reduction of tran scriptional activity of prfA, the central reg
u lator of L isteria m onocytog enes viru len ce. The Jou rnal of Bacterio,l
2001, 183(19): 55625570.
[ 4] SkoberneM, YewdallA, Bah jatKS, et a.l KBMA L isteriam onocytogenes
is an effective vector for DCmed iated induction of antitum or mi mun ity.
The JournalC l in ical Invest igat ion, 2008, 118 ( 12) : 39904001.
[ 5] Wood LM, Gu irnalda PD, M at thew M. C ancer imm unotherapy using
L isteria m onocytogenes and listerialv iru lence factors. Imm unolRes,
2008, 42( 13) : 233245.
[ 6] S chubertW, U rbanke C, Z iehm T, et a.l Stru cture of internalin, am a
jor invas ion protein ofL isteriam onocytogenes in com plex w ith its hu
m an receptor Ecadherin. C el,l 2002, 111 ( 6) : 825836.
[ 7] Sh en Y, Nau jok asM, ParkM, Ireton K. In lBdep endent in ternal iza
t ion of Listeriaism ed iated by theM et receptor tyros ine k inase. C el,l
2000, 103( 3 ): 501510.
[ 8] H am onM, B ierne H, Cossart P. L i steria monocytog en es: a mu ltifacet
edm od e.l Nature Review sM icrob iology, 2006, 4( 6) : 423434.
[ 9 ] B ruhn K, C raftWN, M il ler JF. L isteria as a vaccine vector. M icrobes
In fect, 2007, 9: 12261235.
[ 10] M ilohan ic E, G laser P, Coppe JY, et a.l Transcrip tom e an alysis of
L isteria m onocytogenes iden tif ies th ree groups of genes d if feren tly
regu lated by PrfA. M olecu larM icrob io logy, 2003, 47: 16131625.
[ 11] Dussu rget O, PizarroCerda J, Cossart P. M olecu lar determ inan ts of
L isteria m onocytogenes viru lence. Annu al Rev iew ofM icrob iology,
2004, 58: 587610.
[ 12] M ilohan ic E, Jonquires R, C ossart P, et a.l The au tolysin Am i con
tributes to the adh esion ofL isteria mon ocy tog en es to eukaryot ic cells
via its cell w all anchor. M olecu lar M icrob iology, 2001, 39 ( 5 ):
12121224.
[ 13] D ram s iS, Bou rd ichon F, CabanesD, et a.l FbpA, a novelmu lt ifunc
tionalL isteriam onocytogenes v iru lence factor. M olecu larM icrob iolo
gy, 2004, 53 ( 2) : 639649.
[ 14] Caban es D, Dussu rgetO, Dehoux P, C ossart P. Auto, a su rface asso
ciated au tolysin ofL isteriam onocy tog ene s requ ired for en try into eu
karyotic cells and v iru lence. Mo lecular M icrob iology, 2004, 51
( 6) : 16011614.
[ 15] M ilohan ic E, G laser P, Coppe JY, Frangeu lL, et a.l T ran scrip tione
analys is of L isteria m onocytogenes iden tifies three groupsof genes
d ifferen tly regu lated by PrfA. Molecu lar M icrob iology, 2003, 47
( 6) : 16131625.
[ 16] M anoharM , Baum ann DO, B os NA, C ebra JJ. Gut colon ization of
m ice w ith actAn egat ive m utan t ofL isteriam on ocy tog en es can stim
u late a hum oralmu cosal imm une response. In fection and Immun ity,
2001, 69( 6 ): 35423549.
[ 17] Ol ierM, Pierre F, Rousseaux S, L ematre JP, et a.l Expression of
truncated internalin A is involved in im paired in tern alization of
som e L isteria m onocy tog enes isolates carried asym p tom at ical ly by
hum ans. Infect ion and Immun ity, 2003, 71( 3) : 12171224.
[ 18] 蒋苹,钱悦,冯爱平. 重组减毒单核细胞增多性李斯特菌作为
疫苗载体在抗肿瘤中的研究进展. 中国麻风皮肤病杂志,
2010, 26( 1 ): 4345.
185