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生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 11期
高效氯氰菊酯降解菌 JCN13的
分离鉴定及降解特性研究
张琛 1 王圣惠 2 闫艳春 2
(1山东农业大学生命科学学院 ,泰安 271018; 2中国农业科学院研究生院 ,北京 100081)
　　摘 　要 : 　从生产高效氯氰菊酯的农药厂污水曝气池中 ,分离到一株能降解高效氯氰菊酯并以之为唯一碳源进行生长的
细菌 JCN13。经生理生化试验和 16S rDNA分析 ,鉴定菌株 JCN13为沙雷菌属 (Serra tia sp. )。气相色谱检测 ,菌株 JCN13在 4
d内对 100 mg/L高效氯氰菊酯的降解率为 89% , 8 d内基本降解完全。经气质联用检测 ,发现高效氯氰菊酯在被菌株 JCN13
降解的过程中存在异构体的转化。
关键词 : 　高效氯氰菊酯 沙雷菌属 生物降解 异构化
Isolation , Identif ication and Degradation Character istics
of Beta2cypermethr in Degrading Stra in JCN13
Zhang Chen1 W ang Shenghui2 Yan Yanchun2
(1 College of L ife Science of Shandong Agricultural University, Taian 271018;
2 Graduate School of Chinese Academ y of Agricultural Sciences, B eijing 100081)
　　Abs trac t: 　Strain JCN13 which was isolated from polluted wastes of pesticide p lant, could degrade beta2cypermethrin and utilize it
as the sole carbon resource for growth. Based on the results of physiological2biochem ical p roperties and phylogenetic sim ilarity of 16S
rDNA gene sequences, strain JCN13 was identified as Serratia sp. After being cultivated for 4 days, the strain could degrad 89% beta2
cypermethrin and comp lete degradation was observed in 8 days. The GC2MS analysis showed that certain isomerization took p lace during
the beta2cypermethrin degradation p rocess by strain JCN13.
Key wo rds: 　Beta2cypermethrin Serratia sp. B iodegradation Isomerization
收稿日期 : 2009206207
基金项目 :国家高科技研究发展计划“863计划”(2008AA10Z402、2006AA10Z402)
作者简介 :张琛 (19822) ,男 ,硕士研究生 ,主要从事环境微生物学研究
通讯作者 :闫艳春 ,教授 ; Tel: 010282109685, E2mail: yanyanchun@ caas. net. cn　　氯氰菊酯 ( cypermethrin, CP)是一种重要的拟除虫菊酯杀虫剂 ,具有较高的杀虫活性 ,可以用于防治多种农业害虫 ,应用范围非常广泛。氯氰菊酯化学结构中有 3个手性碳原子 ,因此共有 8个对映异构体 ,并且各个对映异构体之间的杀虫活性差异明显(图 1)。高效氯氰菊酯 ( beta2cypermethrin,β2CP)是氯氰菊酯的两对高效外消旋体混合物 ,含 4个对映异构体 ,杀虫活性高于氯氰菊酯 (表 1) [ 1 ]。高效氯氰菊酯虽然属于低毒农药 ,但是它对鱼类及其他水生生物高毒 [ 2 ]。近年来 ,研究发现高效氯氰菊酯对哺乳动物及人类有潜在的致癌性和生殖、发育毒 性 [ 3, 4 ]。因此 ,随着高效氯氰菊酯的广泛应用 ,由其引起的环境污染问题受到人们的普遍关注。图 1 氯氰菊酯的化学结构式微生物修复作为一种安全、有效的农残消除手段 ,受到人们的青睐。迄今 ,已经筛选到多株氯氰菊酯降解菌 [ 5, 6 ]。但是 ,关于高效氯氰菊酯降解菌 ,以及高效氯氰菊酯在微生物降解过程中发生的异构体转化现象则未见报道。
2009年第 11期 张琛等 :高效氯氰菊酯降解菌 JCN13的分离鉴定及降解特性研究
表 1 氯氰菊酯的对映异构体和非对映异构体成分
农药名称缩写
顺式体 反式体
1R, cis,αS
+1S, cis,αR
1S, cis,αS
+1R, cis,αR
1R, trans,αS
+1S, trans,αR
1S, trans,αS
+1R, trans,αR
顺反比 异构体数
CP √ √ √ √ 45 /55 8
α2CP √ 1 /1 2
θ2CP √ 1 /1 2
β2CP √ √ 2 /3 4
1 材料与方法
1. 1 培养基与试剂
高效氯氰菊酯原药 (纯度 > 98% ) ,购于山东华
阳农药厂。正己烷为色谱纯。富集培养基、普通培
养基和基础盐培养基见参考文献 [ 7 ]。
1. 2 菌株的分离与筛选
称取一定量的活性污泥 (取自山东华阳农药
厂 ) ,加入到含有 200 mg/L高效氯氰菊酯的富集培
养基中 ,摇床培养并每周转接。每转接一次高效氯
氰菊酯浓度提高 200 mg/L ,直到农药浓度达到
1 000 mg/L。然后换用基础盐培养基 ,保持高效氯
氰菊酯浓度 1 000 mg/L并适时转接 ,驯化一个月
后 ,再用梯度稀释法、平板涂布法等进行菌株的分
离纯化。
1. 3 菌株的鉴定
1. 3. 1 生理生化鉴定 按照参考文献 [ 8 ]对纯化
到的菌株进行鉴定。
1. 3. 2 菌株 JCN13的 16S rDNA系统发育分析
提取菌株 JCN13的基因组 [ 9 ] ,以之为模板 ,利用通
用引物 PCR扩增菌株 JCN13的 16S rDNA序列 ,方
法参照参考文献 [ 10 ]。所得菌株序列在 GenBank
中进行注册并比对 ,并用 MEGA 4. 0构建菌株 16S
rDNA系统发育树。
1. 4 菌株生长和降解性能的测定
1. 4. 1 菌株生长的测定 将菌株 JCN13接种到含
有 100 mg/L高效氯氰菊酯的基础盐培养基中 ,摇床
培养定时取样 ,使用分光光度计 ( SC INCO S23100,
Korea)测定 600 nm下的吸光值。
1. 4. 2 菌株降解性能的测定 样品经正己烷旋涡
振荡萃取 3次 ,合并萃取液 ,加入无水硫酸钠脱水 ,
置于 - 20°C冰箱保存待测。
色谱检测方法 :紫外分光光度法 (UV2vis)、气相
色谱法 ( GC)和气质联用法 ( GC2MS)。
紫外分光光度法 (UV2vis) :采用分光光度计
( SC INCO S23100, Korea) ,对标样进行全波长扫描 ,
发现在 278 nm处有高效氯氰菊酯的特征吸收峰 ,并
且光吸收值与高效氯氰菊酯浓度线性关系良好 ,可
用于高效氯氰菊酯残留检测。
气相色谱 ( GC2F ID ) : 气相色谱仪 ( A gilen t
4890D ) ,色谱柱为 HP25毛细管柱 ,方法参照参考文
献 [ 11 ]。
气质联用法 ( GC2MS) :仪器 (Agilent 4890N ) ;
柱子为 VF25MS(30 m ×0. 25 mm ×0. 25μm ) ;采用
程序升温 (初始温度 100°C持续 1 m in,以 30°C /m in
升到 270°C持续 10 m in) ;进样量 1μl。
2 结果与分析
2. 1 降解菌的生理生化特性
菌株 JCN13为革兰氏阴性近球形短杆菌 ,显微
镜下细胞形态很小 ,菌落呈白色有粘性。表 2为菌
株 JCN13的生理生化特性 ,初步将 JCN13归为沙雷
菌属 (Serra tia sp. )。
2. 2 菌株 JCN13的系统发育分析
菌株 JCN13 16S rDNA序列有 1 503个碱基 ,在
GenBank中的登记注册号为 FJ009447,用 BLAST软
件与已注册的 16S rDNA序列进行比对 ,发现菌株
JCN13序列与沙雷菌属 ( S erra tia sp. )序列相似性
很高 ,选择部分相似序列构建系统发育树 (图 2)。
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 11期
表 2 菌株 JCN13的生理生化特性
试验 /菌株
中文名称 英文缩写
JCN13
试验 /菌株
中文名称 英文缩写
JCN13
鸟氨酸脱羧酶 ODC + 葡萄糖 GLU +
精氨酸双水解酶 ADH + 蔗糖 SAC -
赖氨酸脱羧酶 LDC + L2阿拉伯糖 L2ARA -
脲酶 URE + D2阿拉伯糖醇 D2ARL -
L2阿拉伯糖醇 L2ARL - α2葡萄糖 α2GLU -
半乳糖酸盐 GAT - α2半乳糖苷酶 α2GAL -
52酮基葡萄糖酸钠 52KG - N2乙酰 2β2葡萄糖苷酶 β2NAG -
脂肪酶 L IP + 鼠李糖 RHA -
酚红 RP - 肌醇 INO -
β2葡萄糖苷酶 β2GLU + 侧金盏花醇 ADO -
甘露醇 MAN + β2葡萄糖苷酶 β2GUR -
麦芽糖 MAL + 纤维二糖 CEL -
吲哚产生 IND - D2山梨醇 SOR +
海藻糖 TRE + α2麦芽糖苷酶 α2MAL -
β2半乳糖苷酶 β2GAL + 丙二酸盐 MNT -
图 2　菌株 JCN13和其他细菌的
16S rD NA系统发育树
2. 3 菌株 JCN13生长和降解性能研究
在接种后的 4 d内 ,菌株 JCN13生长迅速 ,同时
能将 100 mg/L高效氯氰菊酯降解 89%。随后 ,菌
株生长放缓 ,对高效氯氰菊酯降解率下降。最终 ,在
8 d内菌株 JCN13能将 100 mg/L高效氯氰菊酯基
本降解完全 (图 3)。
□. 不接种时 100 mg/L高效氯氰菊酯的降解 ;
■. 接种时 100 mg/L高效氯氰菊酯的降解 ;
●. 100 mg/L高效氯氰菊酯培养基中菌体生长
图 3　菌株 JCN13的生长曲线和高效氯氰菊酯降
2. 4 菌株对高效氯氰菊酯的降解特性研究
图 42A为高效氯氰菊酯 ( beta2CP)的总离子流
图 ,可以看到在 12. 36 m in和 12. 43 m in处出现了 2
个峰 ,分别代表高效氯氰菊酯的顺式体 ( cis)和反式
体 ( trans)。图 42B和 42C表示菌株 JCN13降解高效
氯氰菊酯第 4天和第 6天的色谱图 ,可以发现高效
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2009年第 11期 张琛等 :高效氯氰菊酯降解菌 JCN13的分离鉴定及降解特性研究
氯氰菊酯有明显的降解。值得注意的是高效氯氰菊
酯的两个特征吸收峰变成了 4个峰 ,分别在 12. 05
m in和 12. 22 m in处出现两个新的色谱峰 ,根据出峰
时间、峰形特点和相关文献报道 ,参照表 1初步断定
12. 05 m in处的峰为氯氰菊酯 (CP)的低效顺式体
(1S, cis,αS + 1R, cis,αR ) , 12. 22 m in处的峰为 CP
的低效反式体 ( 1S, trans,αS + 1R, trans,αR ) [ 11, 12 ]。
随后 ,经过质谱分析并与数据库质谱图比对 ,证实了
上述断定。表明在菌株 JCN13对高效氯氰菊酯的
降解过程中存在异构体的转化。菌株 JCN13并不
是直接将高效氯氰菊酯降解 ,而是在降解过程中伴
随着将高效氯氰菊酯转化为氯氰菊酯的两个低效体
的过程。
图 4 菌株 JCN13降解高效氯氰菊
酯的 GC2M S总离子流图
3　结论
从农药厂活性污泥中分离到一株高效氯氰菊酯
降解菌 JCN13,经生理生化和 16S rDNA分析 ,将菌
株 JCN13归为沙雷菌属 (Serra tia sp. )。菌株 JCN13
能在 4 d内将 100 mg/L高效氯氰菊酯的降解 89% ,
8 d基本降解完全。
高效氯氰菊酯在微生物降解过程中存在异构
体的转化 ,菌株 JCN13能将高效氯氰菊酯边转化
边降解。
参 考 文 献
1　 W ang P, Zhou Z, et al. Chromatographia, 2004, 59: 625～629.
2　 Polat H, Erkoc FU, et al. Chemosphere, 2002, 49 (1) : 39～44.
3　 Shafer TJ,Meyer DA, et al. Environ Health Perspect, 2005, 113 (2) :
123～136.
4　 Van W ijngaarden RP, B rock TC, et al. Ecotoxicology, 2005, 14 ( 3) :
355～380.
5　 Tallur PN,Megadi VB, et al. B iodegradation, 2008, 19 (1) : 77～82.
6　许育新 ,戴青华 ,等.农业环境科学学报 , 2004, 23 (5) : 958～963.
7　 Xu GM, ZhengW , et al. International B iodeterioration & B iodegrada2
tion, 2008, 62: 51～56.
8　 Buchanan RE, GibbonsNE. Bergey’sMannual of Detem inate Bacteri2
ology(8 th edition) . Baltimore:W illiam and W ilkins, 1984.
9　 Sambrook J, Fritsch EF, et al. Molecular Cloning: A laboratoryMan2
ual ( 3 rd edition ) . New York: Cold Sp ring Harbor Laboratory
Press, 1989.
10　Zhang J, Sun Z, et al. J HazardMater, 2009, 163 (2～3) : 723～728.
11　L iu W , Gan J, et al. J Agric Food Chem, 2004, 52 (20) : 6233～6238.
12　陈智东 ,陈平 ,等. 农药科学与管理 , 2004, 24: 12～14.
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