全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 1期
高效氯氰菊酯降解菌 CH7的分离
鉴定及降解条件的优化
张琛 1 王圣惠 2 闫艳春2
( 1山东农业大学生命科学学院,泰安 271018; 2中国农业科学院研究生院,北京 100081)
摘 要: 从农药厂活性污泥中, 分离到一株能以高效氯氰菊酯为唯一碳源生长的细菌 CH 7。经生理生化试验和 16S rD
NA分析, 将菌株 CH 7鉴定为铜绿假单胞菌 (P seudom onas aerug inosa)。采用 Boxbehnken设计试验、响应面法 ( response surface
m ethodology)优化菌株 CH 7的降解条件。在最优条件下 ( 294 C, pH 7 0, 接种量 0 15 g /L ), 菌株 CH7在 12 d内对 100 m g /L
高效氯氰菊酯的降解率为 90%。
关键词: 高效氯氰菊酯 铜绿假单胞菌 响应面法 降解条件优化
Isolation, Characterization and Condition Optim ization of
Betacypermethrin Degrading Strain CH7
Zhang Chen
1
W ang Shenghu i
2
Yan Yanchun
2
(
1
College of Life Science of Shandong Agricultural University, Taian 271018;
2
Graduate School of ChineseA cademy of Agr icultural Sciences, Beij ing 100081)
Abstrac:t Stra in CH 7, isolated from activa ted sludge, could utilize betacyperm ethrin as the so le ca rbon resource fo r grow th.
Based on the results o f phys io log ica lbiochem ica l properties and phy logenetic sim ilar ity o f 16S rDNA gene sequences, stra in CH 7 w as i
dentified as P seudom onas aerugino sa. Response surface m ethodo logy based on the Boxbehnken design o f exper iment was used to opti
m ize the degrad ing conditions o f strain CH 7Unde r the optim um degrading conditions( 294 C, pH 70, b iom ass 015 g /L ), strain CH 7
could degrade 90% betacyperm ethrin( 100 m g /L ) w ithin 12 day s.
Key words: Betacyperme thr in P seudom onas aeruginosa Response surfacem e thodo logy Degrad ing condition optim iza tion
收稿日期: 20090607
基金项目:国家高科技研究发展计划 ( ! 863∀计划 ) ( 2008AA10Z402, 2006AA10Z402 )
作者简介:张琛,男,硕士研究生,主要从事环境微生物学研究; Em ai:l chen. zh ang. a@ gm ai.l com
通讯作者:闫艳春,教授; Te:l 01082109685, Em ai:l yanyanchun@ caas. n et. cn
高效氯氰菊酯 ( cypermethrin )属于拟除虫菊
酯类杀虫剂,是氯氰菊酯 ( cypermethrin)的两对外消
旋体 ( cypermethrin和 cypermethrin), 与氯氰菊
酯相比,其杀虫谱更广、杀虫效率更高 [ 1, 2]。随着高
毒有机磷农药在农业上的禁用,高效氯氰菊酯作为
一种高效、低毒、广谱仿生杀虫剂产销量在逐年提
高,应用范围逐步扩大。研究表明,拟除虫菊酯类杀
虫剂不但对鱼类和某些益虫 (如蜜蜂、桑蚕等 )毒性
高,而且对哺乳动物和人类也有一定的危害,如潜在
的致癌性、生殖和发育毒性、神经毒性以及引起急性
中毒 [ 3- 5]。因此,如何有效地处理高效氯氰菊酯的
毒性和残留带来的危害,成为人们亟待解决的问题。
微生物修复在降解并消除农药残留方面具有安
全、高效等特点,是治理农药环境污染的有效生物修
复途径。本研究通过富集培养的方法,筛选到一株
高效氯氰菊酯降解菌 CH7,优化菌株的降解条件并
对其降解特性进行了初步研究。
1 材料与方法
11 试剂与培养基
高效氯氰菊酯原药:纯度 > 98%,购自山东华阳
农药厂。乙腈、正己烷为色谱纯, 其它试剂均为分析
纯。富集培养基、普通培养基和基础培养基见文献。
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 1期
12 降解菌的分离与筛选
从活性污泥中富集分离得到降解菌株, 该污泥
取自长期生产高效氯氰菊酯的华阳农药厂污水处理
曝气池。并参照本实验室方法富集、分离及筛选高
效氯氰菊酯降解菌 [ 7, 8]。
13 降解菌的鉴定
131 形态特征及生理生化鉴定 将分离到的降
解菌按照参考文献 [ 9]进行鉴定。
132 菌株 CH 7的 16S rDNA系统发育分析 提
取菌株 CH7的基因组并以之为模板, 设计引物 PCR
扩增 16S rDNA序列。引物序列: F ( AGA GTT TGA
TCC TGG CTC AG ); R ( GGC TAC CTT GTT ACG
ACT)。扩增序列用 pMD18T vector( TaKaRa)连接,
转化至大肠杆菌 DH5, 然后筛选白色阳性克隆,送
上海英俊公司测序。序列在 GenBank中进行注册、
比对, 应用 MEGA 40软件构建系统发育树。
14 菌株降解条件的优化
141 影响菌株降解的重要因素 本实验室研究
发现, 影响菌株降解农药的重要因素包括:温度、pH
值和菌体接种量 [ 10]。通过单因素试验确定各因素
的最佳取值范围: 温度 ( 25- 35# ); pH值 ( 6 - 8) ;
接种量 ( 01- 02 g /L)。
142 BoxBehnken试验设计 采用 BoxBehnken
统计学试验设计方法对 3个关键影响因素进行研
究。试验设计见表 1。试验结果为检测菌株 CH 7在
含有 100 mg /L高效氯氰菊酯的基础培养基中降解
第 4天的样品。
143 模型的建立和响应面分析 应用 SAS统计
学分析软件对表 1的试验数据进行分析, 考察模型
拟合度和各因素显著性,同时绘制二次响应面图,最
后获得最优降解条件的理论值。
15 菌株的生长和高效氯氰菊酯降解的测定
151 菌体生长曲线的绘制 在最优条件下,菌株
CH7接种到含高效氯氰菊酯 100mg /L的基础培养基
中,定期取样应用分光光度计 ( SC INCO S3100, Kore
a)测定 600 nm下的吸光值,绘制菌体生长曲线。
152 高效氯氰菊酯降解率的测定 在上述条件
下定时取样,用正己烷旋涡振荡萃取高效氯氰菊酯
残留, 经无水硫酸钠脱水后,样品置于 - 20# 冰箱保
表 1 BoxBehnken试验设计结果
组别 X1 X2 X3 高效氯氰菊酯残留量 (m g /L)
CH 7
1 - 1 - 1 0 626
2 1 - 1 0 788
3 - 1 1 0 619
4 1 1 0 769
5 - 1 0 - 1 566
6 1 0 - 1 630
7 - 1 0 1 562
8 1 0 1 620
9 0 - 1 - 1 498
10 0 - 1 1 485
11 0 - 1 1 487
12 0 1 1 467
13 0 0 0 349
14 0 0 0 338
15 0 0 0 352
注: X1代表温度, - 1 ( 25 C ) , 0 ( 30 C ) , 1 ( 35 C ) ; X 2代
表 pH值, - 1 ( 6 ) , 0 ( 7 ) , 1 ( 8 ) ; X 3代表菌体接种量, - 1
( 01 g /L ) , 0 ( 015 g/L) , 1 ( 02 g /L)
存。检测方法包括:薄层层析法 ( TLC )、高效液相色
谱法 (HPLC )和气相色谱法 ( GC )。
薄层层析法 (TLC) :采用 GF254(规格: 100 ∃ 100
mm,厚度: 02- 025 mm )将样品进行展层后定性分
析高效氯氰菊酯的降解。方法参照参考文献 [ 11]。
高效液相色谱法 (HPLC ) : 乙腈稀释的样品经
045 !m滤膜过滤后, 采用高效液相色谱仪 ( Thermo
Finnigan, USA )进行检测。条件: Zorbax SBC18色
谱柱; PDA检测器; 流动相为乙腈和水 ( 70 /30, v /
v );进样量 10 !L。
气相色谱 (GCFID):气相色谱仪 (Agilent 4890D),
色谱柱为 HP5毛细管柱,方法参照文献 [ 12]。
2 结果与分析
21 降解菌的分离和生理生化特性
从农药厂污水处理池采集的活性污泥经富集驯
化、筛选分离得到多株具有高效氯氰菊酯降解能力
的菌株,选出其中具有较强降解能力的菌株 CH7。
菌株 CH7为革兰氏阴性杆菌, 有鞭毛,能运动,
菌落大小不一,呈扁平状,边缘不整齐。生理生化特
性见表 2。
100
2010年第 1期 张琛等:高效氯氰菊酯降解菌 CH7的分离鉴定及降解条件的优化
22 菌株 CH7的 16S rDNA系统发育分析
经 PCR扩增菌株 CH 7的 16S rDNA片段长约
15 kb, 在 GenBank中的注册号为 FJ009446, 经
BLAST比对发现菌株 CH7的 16S rDNA与铜绿假单
胞菌的 16S rDNA相似度最高, 并构建系统发育树
(图 1)。结合形态学特征、生理生化性质和系统发
育分析, 将菌株 CH 7鉴定为铜绿假单胞菌 (P seudo
monas aerug inosa)。
23 菌株降解条件的优化
231 模型的建立与显著性检验 应用 SAS软件
对表 1数据进行回归分析, 得到高效氯氰菊酯残留
量 ( Y )对编码自变量温度 (X 1 )、pH 值 (X 2 )和接种
量 (X 3 )的二次多项式方程如下:
Y = 34633 + 5425X 1 - 0738X 2 - 0538X 3 -
03X 1X 2 - 015X 1X 3 - 0175X 2X 3 +
23221X 12 + 12195X 22 + 1596X 33 ( 1)
用 F值来考察方程的显著性,对响应面的方差
分析见表 3。
统计分析表明 R 2 = 9827%, 表明该二次多项
式在 9827%的水平上显著, 模型拟合度较好, 可以
用来解释试验结果。
表 2 菌株 CH7的生理生化特性
试验 \菌株
中文名称 英文缩写 CH 7
试验 \菌株
中文名称 英文缩写 CH 7
鼠李糖 RHA - D山梨醇 SOR -
N乙酰葡萄糖胺 NAG + 3羟基 苯甲酸盐 mOBE -
D核糖 R IB - 丙酸盐 PROP +
肌醇 INO - 癸酸盐 CAP +
蔗糖 SAC - 戊酸盐 VALT +
麦芽糖 MAL - 柠檬酸盐 C IT +
衣康酸 ITA + 组氨酸 H IS +
辛二酸盐 SUB - DL乳糖 LAT +
丙二酸盐 MNT + 糖原 GLYG -
乙酸盐 ACE + L阿拉伯糖 ARA -
L丙氨酸 ALA + 3羟基 丁酸盐 3OBU +
甘露醇 MAN + 4羟基 苯甲酸盐 pOBE +
D葡萄糖 GLU + L丝氨酸 SER -
水杨素 SAL - L脯氨酸 PRO +
D蜜二糖 MEL - L岩藻糖 FUC -
表 3 二次多项式模型方差分析
残余 自由度 平方和 均方 F 值 P r > F
失拟误差 3 45467 500 15155 833 2789 0034 8
纯误差 2 1086 667 0543 333
总误差 5 46554 167 9310 833
图 1 菌株 CH7和其他细菌的 16S rDNA系统发育树
方程 ( 1)每个系数的显著性检验表明温度和
pH值对菌株降解农药影响显著 (P < 001), 而菌体
接种量和各因素之间的交互作用影响不显著 (P >
005)。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 1期
232 高效氯氰菊酯残留量响应面分析 将菌
体接种量定为 0 15 g /L, 应用 SAS软件绘制温度
和 pH值与高效氯氰菊酯残留量之间的响应面图
(图 2)。
图 2 温度和 pH值影响菌株 CH7降解
高效氯氰菊酯的响应面图
在驻点处的温度为 294 C, pH 值为 70,高效
氯氰菊酯的残留量为 3426 g /L。因此菌株 CH7降
解高效氯氰菊酯的最优条件:温度 294 C; pH值为
70;接种量为 015 g /L。
24 菌株生长和降解性能的测定
在最优条件下前 4 d菌株 CH7的生长和降解
率均达到最大值, 高效氯氰菊酯的降解率在 65%
以上。 4 d以后菌株开始衰退, 降解能力随之减
弱。最终在 12 d内菌株 CH 7能降解 90% 的高效
氯氰菊酯 (图 3)。结果证明, 在最优条件下菌株
CH 7对高效氯氰菊酯的降解结果与回归模型理论
结果相符。
3 结论
从农药厂活性污泥中分离到一株高效氯氰菊
酯降解菌 CH7, 经形态、生理生化及 16S rDNA分
析, 将菌株 CH7鉴定为铜绿假单胞菌。基于 Box
Behnken试验设计, 应用 SAS软件进行响应面分
析, 优化得到影响菌株 CH 7降解高效氯氰菊酯的
条件 (温度 294 C; pH 7 0;接种量 015 g /L )。在
最优条件下, 菌株 CH7在 4 d和 12 d对 100 mg /L
高效氯氰菊酯的降解率达到 65%和 90% , 并验证
了回归模型科学性与合理性。
% 不接种时 100 m g/L高效氯氰菊酯的降解;
& 接种时 100 m g/L高效氯氰菊酯的降解;
∋ 100m g /L高效氯氰菊酯培养基中菌体生长;
图 3 最优条件下菌株 CH7的生长曲线和
高效氯氰菊酯降解曲线
参 考 文 献
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