全 文 ：技术与方法
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 2期
生物技术在忍冬属植物研究中的应用
韩琳娜 张永清
(山东中医药大学药学院,济南 250355)
摘 要: 对近年来生物技术在忍冬属植物快速繁殖、种质资源鉴定和药用活性有效成分生产方面的研究进展进行了综
述, 包括忍冬属植物的组织培养、染色体核型分析、生物化学和分子生物学的研究。
关键词: 忍冬属 生物技术 研究进展
Research Progress in PracticalM edicinal
Plant B iotechnology ofLonicera L inn.
H an L inna Zhang Yongqing
(College of Pharmacy, Shandong University of T raditional ChineseM ed icine, J inan 250355)
Abstrac:t The pape r presen ted the research prog ress in rap id propagation, g ermp lasm identification and the production o f activ e
pharmaceutica l ingredients o f the genus Lonicera L inn. . T issue culture, chromosom e karyotype ana lys is, biochem istry and m olecu lar bio l
ogy resea rch ed rev iewed.
Key words: Lonicera L inn. B iotechno logy Research prog ress
收稿日期: 20091021
基金项目:国家科技支撑计划 ( 2006BAI06A1208 ) ,山东省农业良种工程 大宗道地中药材种质资源收集、保存与整理 !重大课题 ( 2008LZ013
02 )
作者简介:韩琳娜,女,讲师,硕士,主要承担生物化学、细胞生物学的教学科研工作; Em ai:l l innahan@ 163. com
通讯作者:张永清,教授, Em ai:l zyq622003@ 126. com
忍冬科忍冬属 ( Lonicera L. )植物约有 200种,
分布于北半球温带和亚热带地区,我国有 100余种。
该属有多种植物具有重要的药用价值,如忍冬、灰毡
毛忍冬、淡红忍冬、菰腺忍冬、金银忍冬、大花忍冬、
皱叶忍冬、细毡毛忍冬和盘叶忍冬等。其中忍冬的
根、茎、叶、花、果实均可药用,其干燥花蕾与茎枝分
别称为金银花、忍冬藤,属于常用中药材, 具有清热、
解毒、抗菌等功效 [ 1]。除药用外, 忍冬属植物还在
绿化观赏、营养保健、日用化工、保持水土及畜牧兽
医等领域具有重要的经济价值 [ 2, 3]。组织培养、染
色体核型分析、生物化学和分子生物学等现代生物
技术, 在植物品质改良、资源保护和种质鉴定等领域
发挥着越来越重要的作用, 有着广阔的应用前景。
就生物技术在忍冬属植物研究中的应用概况进行归
纳与总结,旨在为促进忍冬属植物资源的综合开发
利用和深化相关研究提供参考。
1 组织培养
李利改等 [ 4]率先以忍冬幼嫩叶片作为外植体
开展了组织培养方面的研究,先诱导出愈伤组织,然
后再分化出芽和根,获得了再生植株。此后,相关研
究报道较少。 2000年后,关于忍冬属植物组织培养
方面的研究报道日多,但多数工作集中在利用茎尖、
茎段、芽及叶片进行离体培养及愈伤组织诱导,目的
是实现植株的快速繁殖。杨培君 [ 5]、向增旭 [ 6 ]等分
别建立了添加 20 mg /L 6BA, 02- 05 mg /L KT
和 05- 10 mg /L IAA的 B5为培养基的山东蒙花
品系的组培快繁体系, 仇键等 [ 7]针对蒙花 1、2号建
立了以 MS为基本培养基、添加 10 - 20 mg /L 6
BA和 005- 02 mg /L NAA的诱导快繁体系。凤
爪金银花是沂蒙山区另一忍冬优良品种, 王光全
等 [ 8]对其组培条件进行了摸索, 制定了适宜的组培
快繁技术。据报道,众多研究者先后建立和优化了
2010年第 2期 韩琳娜等 :生物技术在忍冬属植物研究中的应用
红河金银花、红金银花、北京忍冬、邹叶忍冬、蓝靛果
忍冬等的组培与快繁体系, 涉及的内容主要是外植
体的消毒灭菌、愈伤诱导、丛生芽诱导、继代增殖、生
根和移栽体系的建立, 大多有着较高的诱导率和移
栽成活率。另外,曹方莉等 [ 9]还以当年生银翠蕾嫩
枝茎段为外植体,进行愈伤组织和不定芽培养,对获
得的不定芽采用秋水仙素浸泡法和培养基中添加秋
水仙素法诱导出了多倍体, 并进行了染色体鉴定。
结果表明,秋水仙素浓度对多倍体诱导率有显著影
响,为金银花同源四倍体的诱导与鉴定提供了依据。
国外学者也在对忍冬组织培养研究进行了不同
的尝试。Palacios等 [ 10]对桃色忍冬茎段外植体经由
器官发生途径的再生进行了报道, 在添加 4%蔗糖
和 08% D ifco bacto琼脂的 B5培养基上, 进行了以
茎段作为外植体的再生。通过在芽分化诱导培养基
中添加 05mg /L的 GA3, 比较了不同发育时间的外
植体对根诱导和伸长的影响,发现最佳根诱导与伸
长培养基为 1 /2WPM + 2 M M3吲哚丁酸 + 06%
key lis琼脂。K im等 [ 11]建立了金银花合子胚培养中
的体细胞胚胎发生和植物再生高频体系, 证明在添
加 452 M 2, 4D的 MS培养基中, 成熟的合子胚
以 467%的频率形成了胚性愈伤, 以此种液态培养
基建立了胚性愈伤的细胞悬浮培养体系, 接种到含
有 MS基本培养基的平板培养皿后, 胚性细胞悬浮
物形成了大量的体细胞胚,继而以 68%的频率发育
形成小植株,并移栽于温室。部分学者对忍冬悬浮
细胞培养过程中的次生代谢物变化及其生物转化途
径进行了探索性研究。如 Horiike等 [ 12]在金银花细
胞悬浮培养中获得了 6种姜黄二酮类物质,即 ( 2S)
2羟基姜黄二酮、( 2R ) 2羟基姜黄二酮、( 8S ) 6羟
基姜黄二酮、( 2R, 8S ) 8羟基2羟基姜黄二酮、
( 1S, 10S) ,l 10环氧姜黄二酮和 ( 1R, 10R ) ,l l0环
氧姜黄二酮。Yamamoto等 [ 13]认为, 金银花细胞悬
浮培养不会产生环烯醚和裂环烯醚苷, 但其细胞能
利用 7脱氧马钱素 7羟化酶将 7脱氧马钱素转化
成马钱素和环烯醚萜甙裂环马钱素, 也能利用开链
马钱素合成酶将马钱素或 7脱氧马钱素转化成开
链马钱素 [ 14, 15] ,而不能将香叶醇转化成环烯醚苷和
环烯醚萜甙裂环马钱素。Yamamoto[ 16]通过酶活性
抑制试验证明,上述转化过程均是由细胞色素 P450
介导的。
2 染色体核型分析
郭振怀等 [ 17]采用去壁、低渗、火焰干燥法, 对
金银花茎尖细胞染色体核型进行了观察研究, 发
现金银花染色体核型为 3A型, 核型对称性明显,
表明金银花在系统演化上有较强的原始性。王飞
等 [ 18]采用常规制片法结合显微摄影技术, 观察分
析了忍冬属两种药用植物金银花和金银忍冬的染
色体数目、核型及体积, 结果显示金银花和金银忍
冬都具有相同的染色体数目 2n = 18, 并且核型分
类都属于 2A型, 核型公式近相似, 反映了此属两
种植物密切的亲缘关系; 金银花和金银忍冬染色
体核型公式和相对长度组成的不同反映了两者间
的差异, 为两种药用植物的鉴定及良种选育提供
了依据。郑丽等 [ 19]通过灰毡毛忍冬和红白忍冬 [ 20]
的染色体数目和核型研究, 并与原种金银花核型进
行比较,发现灰毡毛忍冬和红白忍冬体细胞染色体
数目均为 2n = 18, 核型不对称系数 ( ASK% )分别
为 7371% 和 7023%, 属于 3B型。根据 Lev itzky
和 Stebbins的基本观点, 在被子植物中,核型进化的
基本趋势是由对称向不对称发展, 说明灰毡毛忍冬
和红白忍冬是衍生进化而来的变种, 这与中国植物
志所述相符合,为用染色体分析结果进行忍冬属植
物分类及鉴定提供了依据。
3 生物化学技术
同工酶是指细胞中分子结构、理化性质不同,但
催化相同反应的酶。同工酶是基因编码的产物, 其
酶谱差异主要是由决定酶蛋白本身的等位基因或非
等位基因的差异造成的。同工酶电泳图谱谱带发生
多态性变化,反映了生物在蛋白质水平上的多型性,
是生物发生遗传分化的证据 [ 21]。因此,利用它可以
鉴别生物诸多遗传变异。在植物系统发育与进化研
究中,常用于估计种间、种内分化程度,估计种内居
群间、居群内基因频率的变化, 分析种内亲缘关系
等 [ 22]。过氧化物酶 ( POD )同工酶是一组能够利用
H 2O2氧化供氢体 (底物 )的酶, 在高等植物中存在较
多, 这些同工酶可以直接表达基因,并且是植物体内
对生长期、生长环境、品种遗传特性比较敏感的一种
酶系。石俊英等 [ 23]采用 POD分析结合 RAPD标
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 2期
记,对忍冬大毛花忍冬与鸡爪花农家品种进行了分
析,其 POD的谱带数目分别为 5条和 2条,显示忍
冬两品系的过氧化物同工酶谱带数目和基团均有所
差异。赵永亮等 [ 24]采用聚丙烯酰胺凝胶垂直平板
电泳技术, 利用 POD同工酶和淀粉酶 ( AS)同工酶
对 10个地区 11个金银花样品的遗传多样性进行了
分析,以探讨不同产区金银花的亲缘关系。结果表
明,不同产区金银花的过氧化物酶和淀粉酶具有较
丰富的多态性,说明金银花不同居群在遗传本质上
是有区别的,提示该物种正处于分化阶段。特别是
产自河南荥阳的 1、2号样品和产自四川的 3号样品
在两种同工酶谱中的表现有较大差异, 认为不同产
区金银花亲缘关系与其遗传本质和地理位置有关。
4 分子生物学技术
DNA分子作为遗传信息的直接载体, 不受外界
因素和生物体发育阶段及器官差异的影响, 每一个
个体的任一细胞均含有相同的遗传信息, 因此,采用
DNA分子遗传标记 ( DNA mo lecular genet ic marker)
进行物种鉴别更为准确可靠。金银花作为传统中药
材,具有明显的道地性,药材质量与产地密切相关,
但通过显微鉴别和化学成分分析很难认定其道地产
区。利用分子标记技术可在基因水平上了解天然产
物多样性与物种、生态地理分布之间的关系,检测物
种遗传多样性, 探讨物种的亲缘关系和进化趋势。
与传统植物形态学、组织学和化学检测相比,它可在
DNA水平上鉴别生物种、亚种、变种甚至变异株。
因此, 能更充分、更确地表达其变异类型的遗传标
记,提供了一种灵敏、准确、科学的种质鉴别方法。
常用的分子标记方法有 RAPD、RFLP、AFLP、SSR、
ISSR等。
目前,从分子水平上对忍冬属植物进行研究,国
内报道集中于 RAPD分析。盛红梅等 [ 25 ]应用 RAPD
标记技术,从分子水平上分析了甘肃省境内的 23种
忍冬属植物的遗传多样性及其种间关系, 结果表明,
甘肃省忍冬属植物资源的遗传多样性较为丰富, 23
种忍冬明显聚为两大类,其下又有较多分支,其种间
关系与传统形态学分类结果基本一致, 但也有个别
种的归属及种间关系稍有变化。向增旭等 [ 26]利用
RAPD分析技术, 对金银花 6个种源的遗传多样性
及遗传关系进行了研究, 发现金银花 6个种源可聚
为 2大类,产自山东平邑、湖南隆回和江苏南京的野
生金银花种源遗传距离较近,聚为一类;来自河南封
丘的 2个野生种源和来自河南密县的 1个栽培种源
聚为一类。不同金银花种源问的遗传关系与地理分
布有一定的相关性。杨飞等 [ 27]运用 RAPD技术, 对
5个金银花品系进行遗传多样性研究,并构建了这 5
个金银花品系的 DNA指纹图谱。结果显示, 此金银
花 5个品系聚为两类, 与其形态学分类结果相符。
霍军伟等 [ 28]基于 RAPD技术, 研究分析了中国北方
野生蓝金银花的种群遗传多样性, 将 6个种群的 60
种植物用优化的 SDS过程进行 DNA提取。在 PCR
扩增中, 27个操纵子随机引物被选择。总共 186个
位点被检测,其中 121个位点具有多态性,占到了总
位点数的 6505%。每个种群有意义多态性位点的
比率是 3889%。在整个遗传变异中, 一些变异是
在种群内,种群之间的关系是紧密的。RAPD分析
结果显示, 6个种群可被聚为 3个组。于燕莉等 [ 23]
采用 RAPD标记方法,对金银花两大品系大毛花和
鸡爪花的 DNA指纹图谱进行了分析, 试图从 DNA
分子水平上为两品系的鉴别提供依据,结果两品系
的 DNA指纹图谱和 POD指纹图谱具有明显差异,
表明 RAPD技术能有效地用于金银花品种的分类与
鉴别。
简单序列重复间扩增多态性 ( ISSR)是一种基
于微卫星序列的新型分子标记技术,结合了 SSR和
RAPD的优点。王晓明等 [ 29]通过建立金银花 ISSR
PCR体系, 对来自湖南、山东、河南的 22个金银花品
种进行标记,扩增出多态性条带 96条,为金银花品
种间遗传多样性分析提供了技术和理论支撑。李萍
等 [ 30]用 SDS法提取忍冬不同居群、外类群细毡毛忍
冬和山银花的总 DNA, 进行 5S rRNA基因间区的
PCR扩增和测序, 并用软件 Mega进行分析,发现忍
冬属植物 5S rRNA基因间区约 210 bp, 其中 G + C
含量较高,达 70%左右, 不同居群的忍冬碱基序列
有差别,通过测序可以进行鉴别。山银花与忍冬间
的遗传距离较大。从而得出, 忍冬属种间 5S rRNA
基因间区的序列差异大于种内; 道地药材之间的遗
传距离较小;道地与非道地药材之间的遗传距离大
于道地药材之间的遗传距离。朱颖等 [ 31]以败酱草
科的 C entranthu rubber为外类群, 对忍冬科 12个属
60
2010年第 2期 韩琳娜等 :生物技术在忍冬属植物研究中的应用
12个代表种的 ITS区序列进行了系统发育分析,将
12个属划分成 2个族, 3个姐妹群,并利用序列分析
划分亲缘关系距离。道地金银花转录间隔区的突
变位点可以通过限制性内切酶 E coN I被检测。由
于道地性金银花的 PCR产物不能被彻底消化, 王
冲之等 [ 32]使用 PCRRFLP分析鉴定不同地域起源
的金银花, 结果被 E coN I切割的 PCR产物在所有
道地性金银花中 70%以上被检测出来, 非道地性
金银花和来自金银花属的其它种只有少于 20%的
被检测出来, 这个比率与金银花的地理起源有很
大的相关性, 因此, 可用于金银花道地性的区分。
国外学者在分子水平的研究则侧重于对有效成分
合成关键代谢途径的探索。 Jiang等 [ 33]为了探究
茉莉酸的生物合成途径, 从忍冬中克隆了丙二烯氧
化合成酶 (AOS) ∀ 茉莉酸生物合成催化第一个定向
步骤的酶的基因, 命名为 LjAOS, 与其他 AOS是同
源的, 并通过定量 PCR分析 L jAOS mRNA在不同组
织中的表达,结果表明在绿原酸含量最高的花蕾中
L jAOS有大量积累。
5 总结
综上所述, 生物技术在忍冬属植物研究中的应
用起步较晚,国内主要用于快速繁殖、种质区分和药
材道地性区分,国外则倾向于更有效的获得其药用
活性成分。在组培快繁方面,虽然已经建立了多个
品种的快繁体系,但大多停留在试验阶段,距大规模
工厂化生产尚有一定距离。在花药、花粉、原生质体
培养和通过毛状根、细胞培养获得活性成分等领域,
许多关键技术尚有待突破。生化标记技术正日益被
分子标记所取代,其应用研究也就仅仅体现在个别
品种单一同工酶测试分析方面。目前, 各种分子标
记技术的兴起,为忍冬属植物种质鉴定和亲缘划分
开辟了广阔道路,如能将分子生物学技术更广泛地
应用于道地性研究、次生代谢关键酶基因的克隆及
表达等方面,对于有效控制中药材质量、实现活性成
分的工业化生产,将发挥出巨大的推动作用。
参 考 文 献
[ 1] 王天志, 李永梅. 金银花研究进展. 华西药学杂志, 2000, 15
( 4 ): 292.
[ 2] 张永清.忍冬的经济用途.生物与特产, 1989( 1 ) : 1314.
[ 3] 周满宏,唐红.甘肃省忍冬科野生观赏植物资源评价与利用.中
国园林, 2000, 16 ( 3) : 7475.
[ 4] 李利改,郭龙.金银花的组织培养. 植物生理学通讯, 1987( 4 ):
5859.
[ 5] 杨培君,陈德经,赵桦, 等. 蒙花忍冬的组织培养与快速繁殖研
究.西北植物学报, 2003, 23( 7) : 13041307.
[ 6] 向增旭,高山林.忍冬组织培养体系的建立和优化.中国中药杂
志, 2007, 32 ( 24) : 26622663.
[ 7] 仇键,谭晓风.蒙花 1、2号金银花的组织培养与快速繁殖.中南
林学院学报, 2005, 25( 4) : 5356.
[ 8] 王光全,孟庆杰,孟庆军.凤爪金银花的组织培养技术.河北林业
科技, 2002 ( 5) : 25.
[ 9] 曹方莉,王晓明,赵思东,等.花蕾型金银花同源四倍体的诱导和
鉴定.安徽农业科学, 2008, 36( 9) : 36193621.
[ 10] PalaciosN, Ch ris tou P, LeechM J. Regeneration ofL onicera ta tarica
plants via advent itious organogen es is from cu ltu red stem explants.
P lan t Cell Reports, 2002, 20( 9) : 808813.
[ 11] K im SW, Oh SC, In DS, Liu JR. H igh frequen cy som at ic em bryo
genesis and p lant regeneration in zygotic emb ryo cu ltu res of Japa
n ese honeysuck le. Plant Cel,l T issue and Organ Cu ltu re, 2003, 72
( 3) : 277280.
[ 12] H oriike T, Ohsh iroM, K uroyanag iM . B iotransformat ion of the ger
m acrane type sesquiterpene curd ione by suspens ion cu ltured cells of
L on icera japonica. Phytochem istry, 1997, 44( 4 ) : 627632.
[ 13] Y amam otoH, ShaM, K itamu ra Y, eta.l Iridoid b iosyn thesis: 7deox
y loganet ic acid 1OG lucosyltran sferase in cu ltu redL on icera japoica
cells. P lan t B iotechno,l 2002, 19( 5) : 295301.
[ 14] K atan o N, Yam am otoH, Iio R, Inoue K. 7deoxylogan in 7hydroxy
lase in Lonicera japon ica cell cu ltures. Phytochem istry, 2001, 58
( 1) : 5358.
[ 15] Y am am oto H, Katano N, OoiA, Inou e K. Transform at ion of logan in
and 7deoxylogan in into secologan in by L onicera japon ica cell su s
p ension cu ltu res. Phytochem istry, 1999, 50( 3 ) : 417422.
[ 16 ] Yam am oto H, Katano N, Oo i A, In oue K. S ecologan in syn thase
wh ich catalyzes the ox idative cleavage of logan in in to secologan in is
a cytoch rom e P450. Phytoch em istry, 2000, 53( 1 ) : 712.
[ 17] 郭振怀,王敏,李三星.金银花染色体核型研究.河北农业大学
学报, 1993, 16( 1 ): 3335.
[ 18] 王飞,王冰.忍冬属两种药用植物的染色体核型分析.中药材,
2005, 28( 3 ): 168170.
[ 19] 郑丽,梅树模,汪冶,等.红白忍冬的染色体及核型分析.怀化医
专学报, 2007, 6( 1 ): 3537.
[ 20] 汪冶,梅树模,郑丽,等.灰毡毛忍冬的染色体及核型分析.怀化
医专学报, 2006, 5( 2 ): 7576.
[ 21] 段会军,张彩英, 张丽娟,等. 河北省大豆种质资源同工酶及
RAPD标记多样性研究. 中国油料作物学报, 2003, 25 ( 2 ):
1520.
61
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 2期
[ 22 ] 宋志文,杨光, 等. 东北地区野豌豆属植物过氧化物同工酶研
究.植物研究, 2001, 21( 1) : 131135.
[ 23 ] 石俊英,于燕莉,卢燕. RAPD和 POD分析技术在金银花品种鉴
定中的应用.山东中医药大学学报, 2001, 25 ( 2) : 137138.
[ 24 ] 赵永亮,张长付,覃晓娟.金银花的过氧化物酶和淀粉酶同工酶
遗传多样性研究.安徽农业科学, 2008, 36( 15) : 62256227.
[ 25 ] 盛红梅,安黎哲,陈拓,等.忍冬属植物的遗传多样性及其种间
关系研究.西北植物学报, 2005, 25( 7 ): 14051409.
[ 26 ] 向增旭,郭巧生.不同金银花种源间遗传关系的 RAPD分析.植
物资源与环境学报, 2007, 16( 2 ) : 5759.
[ 27 ] 杨飞,张敏,彭兴扬,等. 金银花五个品系的 RAPD分析及 DNA
指纹图谱的建立.武汉植物学研究, 2007, 25 ( 3) : 235238.
[ 28] H uo JW, Y anXF. Rap id analys is on genetic d iversity of popu lations
of w ild b lue honeysu ck le(L onicera caerulea ) in northeastC h ina. In
ternationalAgroB iotechn ology C on feren ce[ C ] . 2005, 110114.
[ 29] 王晓明, 李俊彬, 李永欣,等. 金银花 ISSRPCR反应体系的建
立与优化.中国农学通报, 2008, 24 ( 11) : 7377.
[ 30] 李萍,蔡朝晖,邢俊波. 5SrRNA基因间区序列变异用于金银花
药材道地性研究初探.中草药, 2001, 32( 9) : 834837.
[ 31] 朱颖,董玉芝,昝少平, 等.忍冬科的系统发育核糖体 DNA ITS
区序列证据.干旱区研究, 2007, 24 ( 6) : 840844.
[ 32] Wang CZ, L i P, D ing JY, et a.l D iscrim inat ion ofL onicera japon ica
thunb. from d if feren t geographical orig ins us ing restriction fragm ent
length po lym orphism analys is. B iological& Ph arm aceut ical Bu lle
t in, 2007, 30( 4) : 779782.
[ 33] J iang, K, PiY, H ou R, et a.l Mo lecu lar clon ing and expression profi
l ing of the firs t specif ic jasm onate b iosyn th et ic pathway gen e allene
oxid e syn thase from Lon icera japon ica. Mo lecular B iology Reports,
2009, 36( 3 ): 487493.
(上接第 57页 )
[ 39 ] Ran iKS, Sw amy MV, S eenayya G. Production of ethanol form vari
ou s pure and natural cellu los ic b iom ass by C lostrid ium th erm ocellum
strains SS21 and SS22. Process B ioch em istry, 1998, 33 ( 4 ):
435440.
[ 40] Cho KM, Yoo YJ, KangH S. In tegrat ion of endo /exoglucanase and
bglucos idase genes into the yeast chrom osom es for direct conversion
of cellu lose to ethano.l E nzym e and M icrobial Technology, 1999, 25
( 1 ) : 2330.
[ 41 ] B alusu R, Padu ru RR, Ku ravi SK, et a.l Opt im izat ion of criticalm e
d ium com pon ents us ing respon se surface m ethodology for ethano l
product ion from cellu losic b iom ass by C lostrid ium th erm ocellum
SS19. Process B iochem istry, 2005, 40: 30253030.
[ 42 ] D esvaux M. Th e cellu losom e of C lostrid ium celluloly ticum. E nzym e
andM icrob ialTechnology, 2005, 37( 4 ): 373385.
62