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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 8 期
猪基质 Gla蛋白基因序列多态及生物信息学分析
李敬瑞1 向程举2 刘章忠2 张义玲2 刘若余1
(1贵州大学动物科学学院 高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵阳 550025;2毕节地区畜牧技术推广站，毕节 551700)
摘 要:选择具有明显品种差异的 3 个猪品种(可乐猪、白香猪和大约克)构建品种 DNA池，采用 PCR产物直接测序法研
究公猪 MGP基因 5侧翼调控区、外显子 1 共 1 112 bp 范围内可能与精液品质相关的序列多态性，快速筛查到两个 SNPs(C-
849T、C-895T)。进一步利用生物信息学分析 MGP基因 5侧翼调控序列。预测出评分为 95 分以上的转录因子结合位点有 31
个，发现了 CpG岛。C-849T和 C-895T的变异则使白香猪比可乐猪和大约克多出了两个 HSF 可能的结合位点(85． 9 分)。1
个 TATA可能的结合位点(91. 4 分) ，1 个 cdxA可能的结合位点(92. 9 分)。研究结果为进一步研究 MGP 转录效率以及对猪
精液品质的影响奠定基础。
关键词: DNA池 SNPs MGP基因 5调控区 生物信息学
Polymorphisms and Bioinformatics Analysis of
Pig Matrix Gla Protein Gene
Li Jingrui1 Xiang Chengju2 Liu Zhangzhong2 Zhang Yiling2 Liu Ruoyu1
(1College of Animal Sciences，Guizhou University，Key Laboratory of Animal Genetics，Breeding and Reproduction in the Plateau Mountainous
Region，Ministry of Education，Guiyang 550025;2 Technical Extending Stations of Animal Husbandry，Region of Bijie，Bijie 551700)
Abstract: Three breeds of male pigs(Coke pig，white pig and Yorkshire)with different varietal characteristics were applied to
screen potential single nucleotide polymorphisms(SNPs)related to semen quality in the 5flanking region and exon region 1 of pig ma-
trix Gla protein(MGP)gene． Totally almost 1 112 bp were screened rapidly based on DNA pooling and direct sequencing of PCR prod-
ucts． Two single nucleotide polymorphisms(SNPs)were found in the 5 flanking region． Furthermore，bioinformatics tools were used to
analyze the promoter regions，by which 31 transcriptional factors binding sites were predicted with scores higher than 95． The CpG island
was founded in the region． Two possible HSF binding site(score 85． 9) ，a possible TATA binding site(score 91. 4)and a possible cdxA
binding site(score 92. 9)were founded in Coke pig MGP gene because of the variation of C-849T and C-895T． The result could estab-
lish the basis for further research on MGP transcription efficiency and its effect on semen quality．
Key words: DNA pooling SNPs MGP gene 5UTR Bioinformatics
收稿日期:2011-01-25
基金项目:贵州省农业科技攻关项目［黔科合 N Y字(2009)3073］
作者简介:李敬瑞，男，硕士研究生，研究方向:分子遗传与动物育种;E-mail:ljr4359@ 163. com
通讯作者:刘若余，男，博士，教授，研究方向:分子遗传与动物育种;E-mail:liury04@ 163. com
基质 Gla蛋白(MGP)是体内研究中发现的第一
个血管钙化抑制因子，它通过影响细胞分化，与钙、
磷离子形成复合物等途径影响钙化过程，分布在软
骨、骨髓和动脉壁，在心脏、肾脏和肺内有高水平表
达［1］。MGP基因含有 4 个外显子和 3 个内含子，是
一种多功能细胞分化调控因子，参与初级精母细胞
形成精子这一过程［2］。目前，关于 MGP基因的研究
很少，仅见于其与骨质疏松症、动脉粥样硬化的关系
研究［1］。基因的精确表达依赖于机体内一系列复
杂、严密的基因调控系统，而转录因子与转录因子结
合部位的相互作用是这一系统的重要组成部分［3］。
启动子位于基因 5端区域且控制转录起始，各基因
启动子中转录因子结合位点的不同排列，决定着基
因表达的组织特异性和时空性［4］。
DNA池是指将具有某一共同特征群体的部分
个体 DNA提取后经过定量和稀释成一定浓度，按比
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例或等量混合构成一个池。这种混合 DNA 样品的
某些多态性位点经过 PCR 扩增后，其产物经过电
泳、测序等方法绘制等位基因型和估算等位基因频
率等，可确定该位点与性状的相关性［5］。常用的单
个个体比较测序寻找序列多态的方法是可行的，但
所用个体数太少不易发现 SNPs，且花费成本较高;
应用 DNA池测序筛查 SNPs，切实有效，大大减少了
工作量、降低了研究成本。鉴于以往的研究，本研究
利用 DNA池和测序技术，以具有明显品种差异的 3
个猪品种为材料，研究 MGP 基因 5侧翼调控序列、
外显子 1 序列的多态性，并做生物信息学分析。生
物信息学的发展为真核生物基因调控研究提供了
新的工具和方法［6，7］，利用生物信息学软件对 MGP
基因转录因子结合位点和启动子区域作出预测，
并且对潜在的转录因子结合位点进行分析，可为
MGP基因表达调控研究提供科学参考和依据，对
系统完整的阐述基质 Gla 蛋白的功能也有重要
意义。
1 材料与方法
1. 1 材料
可乐猪公猪、大约克公猪耳组织样各 18 个均采
自贵州毕节地区种畜场，白香猪公猪耳组织样 18 个
采自贵州大学科研养猪场。
1. 2 方法
1. 2. 1 样本处理和 DNA池构建 饱和苯酚氯仿抽
提法提取 DNA，用紫外分光光度计测量每个 DNA
样品浓度 3 次，取平均值，再稀释为 100 ng /μL，同
一品种 18 个 DNA 样品中各取 5 μL 混合构建品种
DNA池。
1. 2. 2 引物设计和 PCR 反应 根据 NCBI 上的
MGP基因组序列(GenBank 登录号:CU463008) ，用
Oligo6． 0 软件设计引物。上游引物 S:5-AATGC-
CTTTGGAAAATGTGAGA-3，下游引物 AS:5-AAG-
TAAACTAAAGCCAGAGGAAAA-3，扩增该基因 5侧
翼调控区、外显子 1 序列，引物由上海英骏生物技术
有限公司合成。
利用构建的 DNA池进行 PCR 反应。反应体系
(50 μL) :基因组 DNA 4 μL，10 pmol /μL上、下游引
物各 3 μL，2 × Taq PCR Master Mix试剂 25 μL，三蒸
水 15 μL。PCR 扩增程序:94℃ 4 min;94℃ 45 s，
60℃ 45 s，72℃ 90 s，35 个循环;72℃ 10 min。PCR
产物用 1%琼脂糖凝胶电泳。
1. 2. 3 PCR产物的纯化测序和序列的 BLAST 分析
及 SNPs的确定 将特异性好、产量高的 PCR 产物
委托上海英骏生物技术有限公司进行纯化测序，利
用 DNASTAR软件中的 SeqMan 程序对测序结果进
行校正和 BLAST分析确定 SNPs。
1. 2. 4 序列分析与结构预测在线分析软件 启动
子在线分析软件 Neural Network Promoter Prediction、
Promoter SCAN、Promoter2. 0，转录因子结合位点预
测软件 TFSEARCH 以及 CpG island 预测软件
MethPrimer。
2 结果
2. 1 三个猪品种 DNA池的 PCR扩增结果
经过 35 个循环的 PCR扩增后，取 3 μL PCR产
物进行琼脂糖凝胶电泳，结果(图 1)出现大小约为
1 112 bp左右的单一条带，扩增片段与目的片段大
小一致，特异性较好。
M. Marker;1．可乐猪;2．大约克;3．白香猪
图 1 PCR扩增结果
2. 2 PCR产物测序和 BLAST分析结果
以 3 个猪品种 DNA池为材料，用自行设计的引
物扩增 MGP基因 5侧翼调控区、外显子 1 序列并测
序，BLAST分析发现 2 个 SNPs:C-849T 和 C-895T，
形成了 CC和 CT两种基因型，如图 2 所示。
2. 3 MGP基因 5调控区的启动子预测结果
将测序得到的 MGP 基因 5调控区用 3 种不同
的软件分析，得出潜在的启动子结构。Neural Net-
work Promoter Prediction软件分析发现有 3个可能的
启动子，分别在 －308至 －258 bp，－476 至 － 426 bp，
－937至 － 887 bp 处;Promoter2. 0 分析发现在 － 500
bp处存在可能的启动子区段;Promoter SCAN 预测
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结果没有发现启动子区段，如表 1 所示。
图 2 三个猪品种 DNA池的 PCR产物测序和 BLAST分析结果
表 1 启动子预测结果
软件 起始位点 终止位点 评分
Neural Network
Promoter Prediction
－ 308 － 238 0. 80
－ 476 － 426 0. 90
－ 937 － 887 0. 99
Promoter 2. 0 － 500 0. 503
Promoter SCAN / / /
2. 4 MGP 基因 5调控区的转录因子结合位点和
CpG岛预测结果
将 MGP基因 5调控区用在线工具 TFSEARCH
分析，95 分以上的有 31 个。其中，NIT2 有 5 个，
ADR1 有 19 个，STRE 有 3 个，AML1a 有 6 个，SRY
有 3 个，AP-4 有 3 个，cap 有 17 个，Nkx2 有 3 个，dl
有 3 个，而 C-849T和 C-895T 的变异使 HSF 多两个
为 52 个，TATA 多 1 个为 8 个，CdxA 多 1 个为 12
个。MGP基因 5调控区发现了 1 个 CpG island，位
于 － 451 至 － 286 bp 处，其外的 CpG 位点可能是甲
基化的，该岛大于 100 bp，G + C 含量大于 50%且该
调控区评分为 100 分的转录因子结合位点有 13 个，
如图 4 所示。
图 4 转录因子结合位点和 CpG岛预测结果
3 讨论
可乐猪是国家保护的地方品种，公猪 6 － 7 月
龄，体重 50 kg以上可以配种，其精液品质的研究尚
未见报道。大约克后备公猪 6 月龄体重可达 90 －
100 kg，成年公猪体重 250 － 300 kg。刘剑锟［8］选取
了 9 头大约克公猪测定了精液品质，采精量为
243 － 260 mL，精子活力为 0. 957 － 0. 967。白香猪
是世界著名的侏儒猪，性成熟早，小公猪 18 日龄开
始爬跨，30 日龄有精液排出，初配体重 22 kg以上。
刘培琼等［9］测定了白香猪的精液品质，采精量为
113 ± 18. 74，精子活力为 0. 770 ± 0. 11。本研究以
上述 3 个公猪品种为材料，利用品种 DNA池和测序
技术，成功地在 MGP 基因 5侧翼调控区、外显子 1
共 1 112 bp范围内筛查出两个 SNPs;用生物信息学
软件分析发现，白香猪比可乐猪和大约克多出了 4
个转录因子结合位点。结合白香猪与大约克精液品
质的差异，这 4 个转录因子结合位点是否会影响
MGP基因的表达，有待进一步研究。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 8 期
基因表达调控机制是后基因组时代一个重要的
研究内容。基因表达是基因经过转录、翻译，产生有
生物活性的蛋白质过程。特定的基因启动子序列、
转录因子结合位点和特定的转录因子相结合，决定
了基因表达的时空特异性［10］。因此进行基因表达
调控的研究就需要确定基因序列中的转录因子结合
部位。5调控区是各种转录因子结合的区域，不同
的转录因子对基因的表达调控起着不同的作用，基
因的表达是这些转录因子共同作用的结果［11］。本
研究应用 DNA池结合测序技术在 MGP基因 5调控
区序列检测到了两个 SNPs，并做生物信息学分析。
结果表明，包括 HSF、c-Myb、ADR1、AML-1a、NIT2 等
在内的多个转录因子可能对于 MGP 基因的表达机
制起着重要的作用。生物信息学作为一门新的学科
对于基因和蛋白的研究有着重要的辅助作用［2］。
通过生物信息学分析 MGP基因 5调控区，预测启动
子区域和潜在的转录因子结合位点，对 MGP基因和
蛋白的研究有着重要的辅助作用和指导意义，但最
终的结论还需要试验来证实。
参 考 文 献
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(责任编辑 李楠)
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