全 文 ：林业科学研究!"#$%!"&"$#$*, $##
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!!文章编号!$##$($)*&""#$%##$(##*,(#&
山鸡椒 9L脱氧木酮糖L?L磷酸还原异构酶
%HE基因的克隆和 CQI分析
刘英冠$! 吴庆珂$! 何关顺"! 汪阳东$!! 杨素素$! 陈益存$! 高!暝$
"$+中国林业科学研究院亚热带林业研究所! 浙江 富阳!,$$)##%"+广西壮族自治区田林县林业局!广西 田林!%,,,###
收稿日期$ "#$)(#*(#"
基金项目$ 国家自然科学基金项目",$,#%-#
作者简介$ 刘英冠"$**#(#!女!山东青岛人!硕士研究生!主要从事化工油料植物分子遗传育种研究+
!
通讯作者$研究员!主要从事化工油料植物分子遗传育种研究+/(0123$V5E$$$$$8$"-+9:0
摘要!在转录组测序结果分析基础上!以山鸡椒 9^].为模板!克隆得到山鸡椒 $(脱氧木酮糖(%(磷酸还原异构酶
.=基因 9^].全长!以山鸡椒基因组 ]^.为模板!设计引物,扩增拼接后获得山鸡椒 .=基因全长!命名为
/).=) 序列分析表明!/).=9^].全长为 $ %#$ @W!%.非编码区长 ,) @W!,.非编码区长 %, @W!开放阅读框长
$ )$, @W!预测编码含有 )# 个氨基酸残基的蛋白质!等电点为 -+-"!分子量为 %$+$" 4 )^ /).=基因全长为$" -#$
@W!其中外显子 $" 个!内含子 $$ 个) 对来自 $# 个种源的 /).=基因编码区单核苷酸变异位点进行分析表明$在
9^].区间内共发现 $# 个 D]` "K27M3<7693<:F2E酸的改变!为了分析氨基酸突变导致的蛋白质精细结构的变化!利用 DV2KK(` L^\2基的替换) 其中江西安远".a#的突变H5K$$*J;I引起了氢键的变化!推测可能对酶的活性产生影响) 研究结果为
深入研究山鸡椒脱氧木酮糖 %(磷酸还原异构酶的活性和功能奠定了基础!同时为山鸡椒遗传育种提供理论依据)
关键词!山鸡椒%.=%基因克隆%D]`K
中图分类号!D$&e)- 文献标识码!.
N/)*-*H .*8CQI+*./7(-()%9LF#)J7LFLJ7/O/)(#L?L,")(,".#
M#8O&)-()2#1.(#("%HE# -*&+"/7) 46*7*)
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>I:0$# K:6I91027:192EK9;17M27E >27027:192EK06F1F2:7K+J;V;29; 015;1T<17 20W19F:7 F;<<7S50<19F2T2F5+
6#7 4)18($ /2&%$( )?7$7(% .=% M<7<93:727M% D]`K
林!业!科!学!研!究 第 "& 卷
萜类化合物"F一类化合物!结构多样!广泛存在于植物和微生物
中) 据估计!植物体内的萜类化合物有 , ### 多
种*$+ !它们不仅在植物生长,发育等生命过程中发挥
重要作用!而且是中草药的有效成分!同时也是一种
重要的天然香料!广泛应用于医药,化工等重要领
域) 植物萜类合成的上游途径已基本探明!异戊烯
基焦磷酸"O` #`作为所有萜类化合物合成的中心前
体!有两条合成途径!分别是位于细胞质中的甲羟戊
酸途径"Z\.#和存在于质体中的甲基(^(赤藓醇()(
磷酸途径 "Z/` # 或 脱 氧 木 酮 糖(%(磷 酸 途 径
" _^` #
*"+
) $(脱氧木酮糖(%(磷酸还原异构酶
" _^N#参与 _^` 途径的第二步反应!催化 _^` 生
成Z/` !是该途径合成异戊二稀的第二个关键步骤!
而 _^N是该途径的第一个关键酶!在萜类合成途径
中发挥重要作用!也是细胞萜类化合物代谢调控的
重要位点*,+ ) 目前已从银杏";263A"721"7( H+#,橡
胶"9$_$( 7#(%212$6%2%"Q+L+G+# Z6<3+(.IM#,阳春
砂 ",@"@?@ _21"%?@H:6I+#,金鱼草 ",6&2#*26?@
@(a?%H+#,喜树"D(@G&"&*$)( ()?@26(&( <^97<+#,长
春花"D(&*(#(6&*?%#"%$?%"H+#B+ :^7#等植物中分
离鉴定了 _^N酶基因*) [*+ )
山鸡椒"/2&%$( )?7$7( "H:6I+# <`IK+#又名山苍
子!隶属樟科"H16I19<1<#木姜子属"/2&%$( H10+#!是
我国南方重要的油料经济树种*$#+ ) 山鸡椒叶,花,
果实均含芳香油!果皮含油量达 ,d )d!山鸡椒
精油一般多指山鸡椒果皮中提取的精油!为挥发性
萜类化合物!主要成分是柠檬醛!含量在 -#d以上!
是合成紫罗兰酮系列香料的主要原料!这些香料广
泛用于高档化妆品,香皂等日用化工产品生产中)
山鸡椒精油因为具有柠檬果香和杀菌作用!被用为
天然的食品添加剂和食物防腐剂*$$+ ) 除此之外!山
鸡椒精油在平喘,抗心律失常,抗氧化等方面具有突
出优点!药用前景广阔*$"+ ) 目前!对于山鸡椒萜类
生物合成,功能基因开发和利用方面的研究较少!对
山鸡椒.=基因的克隆及序列分析未见报道) 本
研究以山鸡椒果实为材料!在前期转录组测序的基
础上!克隆得到山鸡椒 .=基因的 9^].全长!进
而获得.=基因全长!对基因序列及推导的氨基酸
序列进行生物信息学分析!并对来自 $# 个地区共计
"" 株单株的山鸡椒 ]^.进行 D]`K分析!同时分析
了氨基酸变异对蛋白质结构的影响!为今后研究单
核苷酸多态性和表型的关系!进一步为山鸡椒良种
选育奠定基础)
$!材料与方法
9+9:试验材料
"#$$ 年 , 月!于 "#$# 年栽植在浙江富阳市鹿山
街道栋山村的山鸡椒原生种源试验林中!随机选取
了能够反应山鸡椒分布范围的 "" 株植株!每个种源
随机选取 $ , 株!该试验林包括山鸡椒自然分布
区的 $# 个种源!分别来自湖南永州"aj#,福建建瓯
"kY#,贵州织金 "jk#,贵州毕节 "Lk#,江西安远
".a#,江西分宜"?a#,福建永安"a.#,四川长宁
"P]#和浙江富阳"Q#) 植株取样部位为花蕾或者
嫩茎!液氮速冻后 [&# f保存备用) 同年 % 月!于
浙江富阳中国林科院亚热带林业研究所后山采取山
鸡椒果实!液氮速冻后 [&# f保存!用于 N].提取
和基因的克隆)
9+;:试剂
大肠杆菌"E)*$#2)*2( )"12# Q^%
$
,WZ^ ($&J\<9(
F:IP3:727MG2F,反转录试剂盒 D6WT2FI:M<7 公司!P:@6EE5超保真快速 ]^.聚合酶," q
B:3EDF1IL有限公司) 所有引物由上海生工生物有限公司
合成)
9+<:实验和分析方法
$+,+$!山鸡椒总N].提取与 9^].第一链合成!
按照植物 N].快速提取试剂盒操作提取山鸡椒
N].!将满足实验要求的 N].放于 [&# f 冰箱备
用) 按照反转录酶 OO试剂盒的使用说明进行单链
9^].的合成)
$+,+"!/).=全长 9^].的扩增!以高通量测序
得到 /).=拼接全长作为模板!利用 I`20B.JJJP...BPP.JPJPJJPJPB(, .! /).=(N$ % .(
PP..P.B.BBB.PJ.BP.JJP.JJP(,. !以山鸡椒
9^].为模板!用P:@6EE5超保真快速 ]^.聚合酶
进行 P`N反应!扩增基因 9^].全长) 反应体系为
"#
!
H!包括模板 %# 7M!上下游引物各 #+&
!
H!% q
P:@6EE5` PNL6>!
H!E]J` Z2A$+-
!
H!P:@6E(
E5超保真快速 ]^.聚合酶 #+"
!
H!N]1K<(?I<F!
H) 反应程序$*& f 预变性 , 027!*&
f 变性 ,# K!-# f 退火 ,# K!" f 延伸 ,# K!,% 个
循环后!" f 延伸 $# 027) $d琼脂糖凝胶电泳!进
行胶回收纯化)
将回收纯化的 P`N产物进行加 W:35.反应!反
应体系为 $#
!
H!包括 $# q/AJ1X L6>$
!
H! E]J` "
!
H!/AJ1X酶 "+%
!
H!EEQ
"
Y$e%
!
H!
)*
第 $ 期 刘英冠等$山鸡椒 $(脱氧木酮糖(%(磷酸还原异构酶.=基因的克隆和 D]` 分析
回收片段 ,
!
H) 加尾反应条件为 # f!,# 027)
将加尾反应的产物用 WZ^ ($&J\<9F:IP3:727M
G2F进行连接!构建 WZ^ ($&J(/).=载体) 将连接产
物转化大肠杆菌 Q^%
$
感受态!涂布于含有%# 0M-
H
[$氨苄青霉素的HL平板上!, f过夜培养!挑选阳
性克隆进行菌液 P`N鉴定和测序鉴定!选择测序正
确的克隆扩大培养!提取质粒并保存菌株)
$+,+,!/).=基因全长的获取!将获得的山鸡椒
.=基因 9^].序列在 ]PLO比对!找到其它物种
中与山鸡椒.=基因同源的序列!初步判断山鸡椒
.=基因中外显子与内含子的位置以及大小!根据
推测出的相邻外显子的位置信息设计引物!以山鸡
椒基因组 ]^.为模板!通过 P`N的方法分段扩增
出基因的全长) P`N产物用 $d琼脂糖凝胶电泳!
条带回收后送往上海生工生物有限公司测序) 测序
结果用 ]^.Z.]软件打开并进行序列比对!根据
9^].序列及引物信息!除去重复序列!拼接出山鸡
椒.=基因的全长!并利用 DW32M7"]PLO#构建基因
的结构图)
$+,+)!H9^_N序列生物信息学分析!利用 ]PLO
";FW$bbVVV+79@2+730+72;+M:T#L31KF程序与 P^
D<1I9; 程序进行序列相似性检索与保守结构域分
析!并用 YN??27E框) 用Z/B.%+# 软件进行氨基酸序列的多重比对
以及系统发育树的构建) 利用 /A`.D5";FW$bb97+
理论等电点等理化性质和二级结构) 运用 DUODD
ZY^ /H预测H9^_N的三级结构)
$+,+%!D]` 的统计与分析!提取 "" 株山鸡椒个体
的 ]^.!送往上海生工生物有限公司进行 D]`K的分
析!分析所有样本的外显子的 D]`K!并将其对应到
9^].上) 根据返回的 D]` 数据!计算转换和颠换的
D]` 数量!估算基因的核苷酸多样性水平!进一步分
析同义突变和非同义突变) 利用 DV2KK(` L^\2预测由氨基酸取代所引起的蛋白质精细结构改变)
"!结果与分析
;>9:&4%HE基因的&FQ+全长扩增
以反转录得到的 9^].为模板!通过 P`N扩
增!经过琼脂糖凝胶电泳检测显示!成功克隆到一条
特异条带!该片段大小在 $+% 4@ 左右"图 $#) 将胶
回收产物连接到J载体上!测序后!利用YN??27E查找开放阅读框!结果显示 /).=开放阅读框为
$ )$, @W!%.非编码区长 ,) @W!,.非编码区长 %,
@W!编码含有 )# 个氨基酸残基的蛋白质"图 "#)
图 $!/).=基因 9^].扩增的琼脂糖凝胶电泳结果
左侧第 $ 行数字为对应行核苷酸序号!第 " 行为对应的氨基酸序号
图 "! _^N全长 9^].序列及推导的氨基酸序列
%*
林!业!科!学!研!究 第 "& 卷
;>;:&4%HE基因全长的获取及序列分析
将上海生工生物有限公司返回的测序信息用
]^.Z.]打开!根据 9^].的序列信息及引物序列
进行拼接!去除重复序列!得到了 /).=基因的全
长) 用 DW32M7 分析 /).=基因结构!输入 9^].序
列和基因全长序列!给出的结果如图 ,) 分析可知!
/).=基因全长为 $" -#$ @W!内含子 $$ 个!外显子
$" 个)
图 ,!/).=基因结构
;+<:H9^_N生物信息学分析
"+,+$!多序列比对及进化树分析!根据H9^_N的
氨基酸序列检索 ]PLO数据库同源蛋白序列!构建
了 _^N与其它植物的 _^N蛋白的系统进化树!如
拉丁学名$胡黄连"H2)#"#*2C( %)#"G*?1(#2T1"#( <`77<3+#!丹参"I(1_2(
@21&2"#*2C( L67M<+#!萝芙木"(?_"1T2( _$#&2)21(&( "H:6I+# L123+#!
烟草":2)"&2(6( &(7()?@H277+#!番茄" / )^"G$#%2)"6 $%)?1$6&?@Z23(
H277+#!麻风树"5(&#"G*( )?#)(%H277+#)
图 )! _^N同源蛋白的系统进化树分析
图 ) 所示!山鸡椒 _^N与单子叶植物水仙":(#)2%?%
&(C$&( H+T1I+)*26$6%2%N:<0+#,玉米"8$( @( %^H+#
和狗尾草"I$&(#2( _2#2F2%"H+# L<16T+#的 _^N亲缘
关系较近) ]^.Z.]对此 ) 种植物 _^N氨基酸序
列进行多序列比对!结果显示 ) 种植物 _^N的相似
性达 *"+"d!蛋白质功能域有着相同的氨基酸组
成!即两个 _^N结合基序"0:F2>#$ H`.^ D/QD.O和
]GBH/\O/.Qa!两个 ].^ Q`结合基序 "0:F2>#$
BDJBDOBJ和H..BD]\J"图 %#)
"+,+"!H9^_N氨基酸组成及理化性质分析!/A(
.`D5` I:F`1I10程序预测的山鸡椒 _^N蛋白质等
电点为 -+-"!分子量为 %$+$" 4 )^ 氨基酸组成以亮
氨酸"$#d#,丙氨酸"$#d#含量为最高"图 -#!蛋
白质不稳定系数为 ,"+,"!为稳定蛋白质!/A`.D5
I`:FK913<预测 H9^_N为亲水性蛋白) I`预测H9^_N亚细胞定位于叶绿体!JZQZZ工具对
山鸡椒 _^N氨基酸序列的跨膜结构域进行预测!山
鸡椒 _^N整条肽链都位于膜外!也即山鸡椒 _^N
不存在跨膜结构域) 用 J1IM_^N氨基酸序列的转运肽进行预测!结果表明!该
序列含有叶绿体转运肽的分值最高"#+%-#!叶绿
体转运肽包含 ) 个氨基酸!含有转运肽酶切位点)
由此可以推断山鸡椒 _^N蛋白在质体外合成后!在
转运肽的作用下运输到叶绿体!由特异的水解蛋白
切去转运肽!成为成熟的蛋白质!不与膜脂结合) 此
推断与 _^` 途径在细胞中的作用部位是质体的事
实相吻合)
"+,+,!H9^_N二级结构及保守结构域分析!利用
DY`Z.工具对 H9^_N二级结构进行预测!如图
所示!H9^_N中
$
螺旋含量为 ,+",d!延伸链为
-*
第 $ 期 刘英冠等$山鸡椒 $(脱氧木酮糖(%(磷酸还原异构酶.=基因的克隆和 D]` 分析
j0^ _N$ .^.%,&"%+$%]F^_N$.^ &^"%,-+$%D2^_N$_` w##)*-*)*+$%右侧数据代表每行最后一个氨基酸的编号
图 %!山鸡椒,狗尾草,玉米和水仙 _^N多序列比对
图 -!H9^_N中每种氨基酸的摩尔比
$+--d!无规则卷曲占 ,&+*)d!
#
折叠为 -+$d!
可见
$
螺旋和无规则卷曲是该蛋白主要的二级元
件!延伸链与
#
折叠散布于整个蛋白质中) P^
D<1I9; 程序对 _^N保守功能域预测!H9^_N为一多
结构域蛋白!分属于 _^` 还原异构酶家族, _^` (I<(
E2K:0(P家族以及 _^` N(P家族"图 &#)
"+,+)!H9^_N三级结构预测!以运动发酵单胞菌
蛋白"`^LO^$$I#4#为模板!利用 DUODD(ZY^ /H对
H9^_N蛋白质进行同源建模!得到的蛋白三维构象
如图 * 所示!蛋白质在空间折叠成&\ 形!蛋白质
&P 端和&] 端构成&\ 形的两臂)
图 !H9^_N二级结构预测
*
林!业!科!学!研!究 第 "& 卷
图 &!H9^_N保守功能域预测
图 *!H9^_N的三维结构
;>=:CQI的统计与分析
"+)+$!D]` 位置及变异类型分析!对 "" 个山鸡椒
单株 ]^.进行测序分析!得出 /).=基因编码区
共有 $# 个单核苷酸变异位点!平均 $* @W 有 $ 个
D]` "表 $#) 对 /).=编码区的 $# 个 D]`K的分析
得出!有 & 个属于转换!包括 P(J% 个!.(B, 个%颠
换 " 个!包括.(P$ 个!B(J$ 个"表 "#)
表 9:&4%HE编码区单核苷酸变异位点
单株编号
单核苷酸位置
"* )&" %$ %, -#" $, $ )#* $ ),, $ ))# $ ))&
Q$ P J . . B B P P P J
Q" . P . . B P P P P P
?a$ . J . . B P P P P P
?a" . P . . B P P P P P
?a, . P . . B P P P P P
k^ . P . . B P P P P P
kY$ . P . . B P P P J P
kY" . P . . B P P P P P
a.$ P J . . B P P P P J
a." . P . . B J P P P P
jk$ . P . . B J J J P P
jk" . P . . . J J P P P
Lk$ . P . . B P J J P P
Lk" . P . . B J J J P J
aj$ . P . . B J P P P J
aj" . P . . B J P P P J
.a$ . P B . B P P P P J
.a" . P . . B J P P P P
.a, . P . B B J P P P P
P]$ . P . . B P P P P P
P]" . P . . B J P P P J
P], . P . . B P P P P P
表 ;:转换$颠换统计
基因 D]` 数量
转换
P(J .(B
颠换
P(J .(B
/).= $# % , $ $
"+)+"!D]`K引起的氨基酸变化!对检测到的 $#
个编码区的 D]`K进行了氨基酸编码突变类型的分
类!主要分为同义突变,错义突变和无义突变) 在这
$# 个 D]`K中!有 - 个属于同义突变!其 D]`K突变
位点均位于密码子第 , 位核苷酸上%有 ) 个属于错
义突变!没有无义突变!这 ) 个错义突变引起了氨基
酸位点的突变!分别是氨基酸序列 )# 位甲硫氨酸
"Z变为苏氨酸"J;I#!$,& 位赖氨酸"H5K#突变为谷氨
酸"B36#!)" 位亮氨酸 "H<6#突变为苯丙氨酸
&*
第 $ 期 刘英冠等$山鸡椒 $(脱氧木酮糖(%(磷酸还原异构酶.=基因的克隆和 D]` 分析
" ;`<#)
利用 DV2KK(` L^\2蛋白质精细结构的变化!发现 Z肽区域!对 _^N酶结构没有影响%H5K$$*J;I位于
].^ Q`结合基序附近!氢键由 , 条变成 ) 条!侧链
变短 "图 $##%H5K$,&B36 氢键由 ) 条变成 % 条%
H<6)" ;`<对结构无影响!无键的形成和破坏)
.$$H5K$$* 的氨基酸结构%."$.*% .$# 蛋白质三级结构".$$* 为H5K#%L$$J;I$$* 的氨基酸结构%
L"$.*% .$# 蛋白质三级结构".$$* 为J;I#
图 $#!DV2KK(` L^\2变化和部分蛋白质结构
,!结论与讨论
_^N是萜类生物合成途径 Z/` 途径的关键
酶!它由 ].^ Q`提供还原力!将 _^` 生成 Z/` )
此途径合成的 O``主要用于单萜,二萜和四萜的生
物合成*$,+ !单萜是山鸡椒精油的主要成分!其中柠
檬醛占单萜含量的 &+d &+)d*$)+ ) 由此推断!
山鸡椒中关键酶.=基因的表达水平!可能影响山
鸡椒单萜的产量!进而对山鸡椒精油的品质产生影
响) 为了研究 .=基因对植物萜类化合物合成的
影响!在大肠杆菌,薄荷"B$6&*( *(G1")(1^YLI2X+#,
长春花等多种物种中克隆了 .=基因*$% [$+ !并利
用基因工程的手段对 .=基因在萜类合成途径中
的作用进行了研究!结果显示过量表达 .=基因可
以促进相应的萜类化合物含量的增加!但目前在山
鸡椒以及其它樟科植物中!关于 .=基因的克隆和
功能未见报道)
本研究应用 NJ(`PN的方法!首次从山鸡椒果
实中获得了含有 $" 个外显子和 $$ 个内含子的
/).=基因全长!并得到 $ %#$ @W 的 9^].全序列
及其编码的包含 )# 个氨基酸的蛋白质序列!通过
LH.DJ程序发现山鸡椒 _^N与水仙的 _^N有着较
高的同源性!进化树分析也表明两者距离较近) 对
山鸡椒 _^N蛋白的氨基酸序列和二级结构进行了
生物信息学分析!发现H9^_N是一个由 )# 个氨基
酸组成的非跨膜蛋白!]端含有叶绿体转运肽和转
运肽酶切位点!对玉米,拟南芥",#(72F"G%2%&*(12(6(
"H277+# Q<57;#,水稻"J#^C( %(&2_( H+#,亚麻"/20
6?@?%2&(&2%2@?@H277+#等 _^N酶的氨基酸进行分
析!也发现转运肽的存在*$&+ !作者推测山鸡椒 _^N
酶在是在细胞质中合成后由转运肽运送至叶绿体!
因为 _^N是 _^` 途径的关键酶!而 _^` 途径仅存
在于质体中!因此这一推断与 _^` 途径在细胞中的
作用部位是质体相吻合)
D]` 是目前使用最广泛的遗传标记技术!具有
分布广,数量多,遗传稳定性高等优点!可以在亲缘
关系较近的种源间进行精确的遗传多样性研究) 研
究发现!某一性状或功能!大多是由许多 D]` 位点
在遗传上共同作用的结果*$*+ !但是少数的 D]` 位点
甚至单个位点也可能引起某一性状的改变!水稻的
脱粒性状可能是一个位点突变导致的*"#+ ) 本文对
$# 个种源的.=基因进行了 D]` 分析!揭示了该
基因在种源间的多态性!$# 个 D]` 位点中有 ) 个
D]` 位点引起了氨基酸的改变!其中江西安远的氨
基酸突变 H5K$$*J;I发生在蛋白质 ].^ Q`结合基
序附近!引起了氢键的变化!可能对 _^N酶的活性
产生了影响!进而对下游产物产生影响) "#$" 年斯
林林等对 $# 个地区的精油成分进行了分析!发现江
西安远的柠檬烯含量最高*$)+ !因此这种推测有可能
成立) 为了验证这一猜测!下一步将进行定点突变!
**
林!业!科!学!研!究 第 "& 卷
分析验证 H5K$$*J;I突变对酶活性的影响!并在全
国山鸡椒自然分布区范围内!考虑到水分等环境条
件的情况下!大范围对山鸡椒 D]`K和含油率,精油
品质等经济性状进行关联性分析!为山鸡椒遗传育
种和优树选育奠定基础)
参考文献!
*$+ 1`MF;<>2(
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还原异构酶基因的克隆及表达分析*k++广州中医药大学学报!
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