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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 9 期
东亚三角涡虫 DjPreb基因干扰载体的
构建及干扰效果鉴定
袁佐清 赵博生
(山东理工大学生命科学学院，淄博 255049)
摘 要: 以含有东亚三角涡虫 DjPreb基因的 pcDNA3-DjPreb 重组质粒为模板，经 PCR 扩增目的片段，将其克隆到干扰
载体 L4440 上，构建重组质粒 L4440-DjPreb后转化入大肠杆菌 HT115 感受态细胞中，IPTG 诱导表达 dsRNA后喂食涡虫。显
微观察喂食 dsRNA后的涡虫在再生过程中的表型变化，Real-time PCR检测载体对涡虫 DjPreb基因的表达抑制效果。试验结
果显示 DjPreb 基因的 RNA 干扰表达载体构建成功，DjPreb 基因 RNA 干扰后涡虫不能正常再生。Real-time PCR 分析饲喂
RNA干扰食物后 DjPreb mRNA的表达显著下降，进一步说明 DjPreb在涡虫头尾的形成中发挥作用。
关键词: 涡虫 DjPreb RNA干扰 再生
Construction of Interference Vector of Planarian Dugesia japonica
DjPreb Gene and Preliminary Identification of
Its Interference Efficiency
Yuan Zuoqing Zhao Bosheng
(School of Life Sciences，Shandong University of Technology，Zibo 255049)
Abstract: cDNA fragment for the DjPreb from adult planarians Dugesia japonica cDNA library was amplified from recombinant
plasmid pcDNA3-DjPreb using PCR and then cloned into the interference vector L4440． The recombinant plasmid L4440-DjPreb was
transferred into E． coli HT115 to make dsRNA induced by IPTG． RNA interference(RNAi)food was fed directly to worms then DjPreb
RNAi animals were amputated into three fragments and allowed to each piece regenerate． Animals were observed with a stereo-
microscope during the process of regeneration． The interference efficiency was assessed using relative quantitative real-time PCR
method． Results showed that the RNA interference vector L4440-DjPreb was constructed correctly． When DjPreb RNAi animals
were amputated into three fragments，regeneration was severely impaired． Relative quantitative real-time PCR analysis of DjPreb
mRNA indicated that the expression of DjPreb mRNA was significantly decreased after RNAi，compared to normal regenerating
planarians． The inability to regenerate after DjPreb knockdown，implicate that DjPreb gene play an important role in head and tail
formation．
Key words: Planarian DjPreb RNA interference Regeneration
收稿日期:2011-02-22
基金项目:山东省自然科学基金项目(ZR2009DM029) ，山东理工大学博士启动基金项目(4041-410013)
作者简介:袁佐清，女，博士，讲师，研究方向:发育生物学与分子生物学;E-mail:yuanzuoqing2008@ 126． com
通讯作者:赵博生，男，博士，教授，E-mail:zhaobosheng@ sdut． edu． cn
WD-40 重复蛋白出现在各种真核生物蛋白
中，如 G蛋白、磷酸酶和转录调控因子。WD-40 蛋
白由多个重复的WD-40 基元组成。每个基元由约
40 个保守的氨基酸组成，在氨基端有一对甘氨酸
－组氨酸残基(glycine-histidine，GH) ，在羧基端有
一对色氨酸 － 天冬氨酸残基(tryptophan-aspartic
acid，WD) ，因此称作 WD-40［1，2］。WD-40 重复序
列在进化过程中高度保守，在哺乳动物、植物、果
蝇、线虫、酵母和原核生物中都发现有大量同源蛋
白［3，4］。WD-40基元顺式排列，数目通常为 4 － 8 个，
2011 年第 9 期 袁佐清等:东亚三角涡虫 DjPreb基因干扰载体的构建及干扰效果鉴定
低至 2个或多达 16 个重复基元的蛋白也有报道，基
元之间以短的可变序列连接［3，4］。这些重复基元组
成结构域能与其他蛋白和配体相结合。WD-40 结
构域为不同蛋白相互作用提供了一个平台，从而使
它具有功能多样性［3］。WD-40 家族成员参与多种
生物功能，如参与细胞周期调控［5］、RNA转录［6］、囊
泡运输［7］、细胞骨架装配［8］、细胞信号转导［9］、细胞
死亡［10］和脂肪形成［11］等。
催乳素调控元件结合蛋白(prolactin regulatory
element binding，PREB)是垂体和肾上腺的一个转
录因子。PREB蛋白的基本序列包含两个潜在的转
录调节 PQ富集结构域和 3 个较类似的 WD 重复区
域，从而使它成为一个 WD 重复蛋白成员，PREB 蛋
白与 WD蛋白家族的一个亚群具有相似之处，发挥
着调节基因的功能［12］。目前，人们已经从人(Gen-
Bank 登录号:Homo sapiens，NP_037520)、鼠(Mus
musculus，NP_057912)、黑猩猩(Pan troglodytes，XP_
515352)、爪蟾(Xenopus tropicalis，NP_001001231)、
黑青斑河豚(Tetraodon nigroviridis，CAG02780)及果
蝇(Drosophila melanogaster，NP_608995)等体内克隆
了 Preb基因。涡虫具有强大的再生能力和成体干
细胞 neoblasts，可以从一个较小的身体片段再生成
一个完整的个体，而且再生周期短，已经成为研究再
生和胚胎发育的重要模式生物［13，14］。我们曾报道
了东亚三角涡虫 DjPreb 基因(GenBank 登录号:
FJ627263)在胚胎发育和再生过程中的表达图式，表
明 DjPreb基因可能参与了涡虫头和尾的形成［15，16］。
为了进一步探索涡虫 DjPreb 基因的功能及其作用
机制，本研究拟通过构建东亚三角涡虫 Djpreb 基因
的干扰载体，经 IPTG 诱导表达 dsRNA 后喂食涡
虫，探索 DjPreb基因在涡虫再生过程中正确形态形
成中的作用。
1 材料与方法
1． 1 材料
试验用东亚三角涡虫采自淄博市博山泉河头
泉水中。将采集的涡虫饲养于灭菌处理过的凉开
水中。试验用质粒载体 pcDNA3 购自 Invitrogen 公
司，含东亚三角涡虫 DjPreb 基因的重组质粒 pcD-
NA3-DjPreb由本实验室构建，干扰载体 L4440、大
肠杆菌(Escherichia coli)HT115 为本实验室保存。
氨苄青霉素、四环素、T4连接酶以及 Xba I、Hind III
等限制性内切酶和各种 Marker、Taq 酶、胶回收试
剂盒均购自 TaKaRa 公司;Reverse Transcriptase M-
MLV 购自 Promega 公司;Tryptone、Yeast Extract 为
英国 Oxoid 公司生产;Real-time PCR Master Mix
(SYBR GREEN)购自 TOYOBO 公司;所用引物
由上海生工生物技术公司合成;其他试剂为国产
分析纯试剂。
1． 2 方法
1． 2． 1 引物设计与 PCR 扩增 结合含有 T7聚合
酶的 L4440 干扰载体的多克隆位点以及 DjPreb
基因的限制性内切酶位点设计上游和下游引物，
5-GCTCTAGAAAACGAAATGAAAGCG-3 (下 划
线表示 Xba I 酶切位点) ，5-CGAAGCTTCATTA-
AAACAAGCTCAG-3(下划线表示 Hind III 酶切
位点) ，PCR 产物包含完整的 DjPreb 基因的开放
阅读框。以 pcDNA3-DjPreb 质粒为模板，加入合
成的引物进行 PCR 扩增，琼脂糖凝胶电泳检测。
1． 2． 2 连接与转化 将 PCR 得到的 DjPreb基因片
段与 L4440 质粒分别用 Xba I 和 Hind III 进行双酶
切，DNA 回收试剂盒分别回收，T4连接酶 16℃ 连接
过夜。连接产物转化于大肠杆菌 HT115 感受态
细胞。
1． 2． 3 重组质粒的筛选与鉴定 将转化的感受
态细胞涂布在含 60 mg /mL、12. 5 mg /mL 的氨卞
青霉素和四环素的 LB 平板培养基上，37℃培养
过夜，挑取单菌落于液体 LB 培养基培养后，提取
重组质粒经 PCR 检测后，用 Hind III 和 Xba I 双
酶切鉴定，将鉴定正确的质粒送上海博尚生物公
司测序。
1． 2． 4 dsRNA 的诱导表达 将带有重组质粒
L4440-DjPreb的大肠杆菌 HT115 接种于含60 mg /mL
氨苄青霉素和 12. 5 mg /mL 四环素的 LB 液体培养
基中，37℃恒温振荡放大培养至 OD550约为 0. 5 －
0. 6 之间时，加入 IPTG 诱导表达 2 h 后，4℃离心收
集细菌沉淀。用无菌水重悬菌体，并与猪肝颗粒以
及 2%琼脂糖混合，10 μL 于冰上迅速冷却，制成
小球。
121
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 9 期
1． 2． 5 含 dsRNA 的菌喂食涡虫 用制备好的食物
喂涡虫，每隔 3 d 喂食 1 次，喂食 3 次后切割涡虫成
咽前、咽中、咽后 3 段。让切割后涡虫片段再生 9 d
后，重新喂食 3 次再次切割让其再生，其间显微镜观
察涡虫再生表型变化，并拍照。
1． 2． 6 Real-time PCR检测干扰后涡虫 DjPreb基因
表达 收集第 2 轮干扰后再生 7 d 的涡虫，借助
RNAiso Reagent试剂以一步法提取东亚三角涡虫总
RNA［17］。使用 Reverse Transcriptase M-MLV 进行涡
虫总 RNA的反转录，合成第一链 cDNA。以涡虫的
β-actin基因作为内参，进行实时荧光定量 PCR。用
Primer 5 软件设计了涡虫 β-actin 基因引物序列:β-
actin sense primer:5-GGATGATGAGATGCGATGT-
TG-3，β-actin anti-sense primer:5-ATGCCAGGTC-
CAGATTCGTCA-3。涡虫 DjPreb 基因引物序列:
DjPreb forward:5-CATTCTTTCTGAACGCCACTC-
3，DjPreb reverse:5-CTCTCCACTGCCGACACC-
T-3。
确定了模板 cDNA 和各对引物的质量以后，用
TOYOBO公司的 SYBRGREEN Real-time PCR Mas-
ter Mix 进行 Real-time PCR，仪器为 Applied Biosys-
tems 7500 Real-Time PCR System。每个反应作 6 次
重复。
1． 2． 7 数据处理 Real-time PCR 结束后，所得数
据以 ABI 7500 SDS 软件(美国应用生物系统公
司)进行分析，根据目的基因和 β-actin 的 Ct 应运
相对 Ct 法即 2-ΔΔCt法来计算各再生时期 DjPreb 基
因 mRNA的相对表达量。结果均以未切完整涡虫
的 DjPreb基因的表达量作为参照。用 SPSS13. 0
对 Real-time PCR获得的数据进行单因素方差分析
来判断处理组和对照组的差异性。结果以平均值
$标准差表示，P ＜ 0. 05 差异显著。
2 结果
2． 1 PCR 得到含有 Xba I 和 Hind III 酶切位点的
DjPreb基因片段
用 PCR基因扩增法得到含有 Xba I 和 Hind III
两个酶切位点的 DjPreb 基因片段，结果(图 1)为一
条 1 100 bp左右的条带，与预期大小一致，条带特异
且亮度明显。
M． 2000 bp DNA Marker;1． PCR扩增产物
图 1 DjPreb基因的 PCR扩增结果
2． 2 重组质粒 L4440-DjPreb 的酶切鉴定及 PCR
鉴定
重组质粒经 PCR 检测，得到一条约为 1 100 bp
的条带(图 2) ，与目的基因大小一致。重组质粒经
双酶切产生两条分子量分别为 1 100 bp 和 2 700 bp
的条带(图 3) ，这与目的基因 DjPreb 片段及双酶切
后的线性质粒 L4440 的大小相一致，表明基因
DjPreb 已插入质粒载体 L4440 中，干扰载体构建成
功。再将重组质粒送交上海生工生物工程公司进行双
向测序，测序结果与 DjPreb基因序列完全一致，阅读框
正确，说明已经成功构建了 L4440-DjPreb重组质粒。
1． PCR扩增产物;M． 2000 bp DNA Marker
图 2 L4440-DjPreb 重组子的 PCR检测结果
1．重组质粒;2．酶切质粒;M． 15000 bp DNA Marker
图 3 L4440-DjPreb重组子双酶切检测结果
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2011 年第 9 期 袁佐清等:东亚三角涡虫 DjPreb基因干扰载体的构建及干扰效果鉴定
2． 3 DjPreb基因 RNAi后再生涡虫的表型
为了分析 DjPreb 在涡虫再生过程中的作用，我
们进行了 DjPreb 基因的 RNAi 敲除试验。图 4 是咽
前即头部再生片段 DjPreb 基因的 RNAi 表型。对照
涡虫随着再生的进行，胚芽基正常生长再生形成损伤
部分，再生 7 d后，虫体已经形成很好的后部胚芽基，
咽也正常形成(图 4-a)。然而 DjPreb RNAi 后，涡虫
尾部呈现锯齿状胚芽基，而且相比对照要粗厚(图
4-b) ，再生不完全甚至完全不产生胚芽基(图 4-c)。
所有图片均为左前背上放置，Scale bars:100 μm
图 4 头部再生片段 DjPreb RNAi表型
图 5 是中间再生片段 DjPreb 基因的 RNAi 表
型。在第 2 轮干扰再生 7 d 后，中间再生片段显示
出明显的再生缺陷，包括背部中线色素颜色加深和
不对称的眼点(图 5-a) ，锯齿状的后部胚芽基(图 5-
b) ，尾部再生缺陷(图 5-b，d，e) ，不能再生眼点(图
5-c，d，e) ，整个身体变得厚重和缩小(图 5-d，e)。
而对照涡虫能形成较好的前后胚芽基，眼点和咽再
生正常(图 5-f)。
所有图片均为左前背上放置，Scale bars:100 μm
图 5 中间再生片段 DjPreb RNAi表型
图 6 是咽后即尾部再生片段 DjPreb 基因的
RNAi表型。DjPreb基因 RNAi后，强烈抑制了胚芽
基的再生，许多尾部片段不能再生出新的头部片段
(图 6-a，b) ，整个身体变厚和缩小并有黑斑点(图 6-
b)。而对照能正常再生出头部，眼点和咽也能正常
分化(图 6-c)。
所有图片均为左前背上放置，Scale bars:100 μm
图 6 尾部再生片段 DjPreb RNAi表型
2． 4 Real-time PCR检测干扰后 DjPreb基因的表达
用相对定量 Real-time PCR 分析饲喂 RNAi 食
物和对照食物后 DjPreb mRNA 在再生涡虫中的表
达变化。结果(图 7)表明，RNAi 后 DjPreb mRNA
的表达显著下降。
RNAi后 DjPreb mRNA的表达显著下降，* 表示 P ＜ 0. 05
图 7 DjPreb RNAi后 DjPreb mRNA表达的相对
定量分析
3 讨论
将目的基因与载体重组转化入工程菌诱导表达
dsRNA后喂养涡虫，dsRNA 在涡虫体内被内切核酸
酶 Dicer识别加工成为短双链 RNA(siRNA) ，形成
RNA诱导基因沉默复合体(RISC) ，由 RISC 介导切
割靶 mRNA 分子中与 siRNA 反义链互补的区域，从
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 9 期
而特异性地降解目标 mRNA，达到干扰基因表达作
用，影响目的基因的表达。这种方法在涡虫的基因
功能研究中已经得到了广泛的使用并取得了
成功［17，18，20］。
PREB蛋白与 WD 蛋白家族的一个亚群具有相
似之处，发挥着调节基因的功能。PREB 与催乳素
启动子结合并激活它，而且还能调控蛋白激酶 A
(PKA)对启动子的作用。Imachi 等［21］研究发现，
PREB通过与类固醇 11β-羟化酶(CYP11B1)启动子
的 PREB 反应顺式作用元件(PRCE)相结合，通过
cAMP 调控 CYP11B1 基因的表达。Murao 等［22］的
结果表明在肾上腺，PREB通过 cAMP来调节 B 族 I
型清道夫受体(SR-BI)的转录。
通过 DjPreb基因干扰试验，可以确定 DjPreb 基
因的 dsRNA对涡虫 DjPreb基因有干扰作用，影响再
生正常进行。当 RNAi 9 d 后，涡虫被切割成 3 段，
不同片段的再生都受到了影响。而对照再生片段能
在 7 d内再生出缺失部分。涡虫再生不同时期的整
体原位杂交结果显示，在涡虫前后端形成的胚芽基
中检测到 DjPreb强信号;DjPreb在完整涡虫和再生
涡虫都呈梯度表达，在涡虫前端和后端信号强，中
部信号最弱［15］。DjPreb 敲除后涡虫不能正常再
生，用相对定量 Real-time PCR 分析饲喂 RNAi 食
物后 DjPreb mRNA 的表达显著下降，进一步说明
DjPreb在涡虫再生过程的组织形成中发挥重要作
用，推测可能是通过调控蛋白激酶 A 对启动子的
作用来调控基因表达，从而在头尾的形成中发挥
作用。
参 考 文 献
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(责任编辑 李楠)
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