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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010 年第 7 期
一种适合从柑橘果皮提取总 RNA的方法
高雪
(韩山师范学院生物系，潮州 521041)
摘 要: 柑橘果皮由于富含果胶、酚类物质等干扰 RNA分离的物质，较难提取到纯度高的 RNA。本试验建立了一种适
于从柑橘果皮提取 RNA的方法，从脐橙和蕉柑两种柑橘的果皮提取总 RNA，经凝胶电泳、紫外分光光度法检测所提 RNA 的
品质。研究结果表明，该法所提 RNA条带清晰、无降解。OD260 /OD280接近 2. 0，具有较高的纯度。RT-PCR试验结果进一步表
明，该法提取的 RNA纯度高，完全能够用于后续的分子生物学研究。
关键词: 柑橘 果皮 总 RNA 提取方法
A Method of Extracting Total RNA from Peel of Citrus Fruit
Gao Xue
(Biology Department，Hanshan Normal University，Chaozhou 521041)
Abstract: One method of extracting total RNA from citrus fruit peel tissue which is rich in polysaccharides and polyphenol was
studyed． The quality of total RNA was analyzed through gel electrophoresis and UV spectrometer． The results indicated that the RNA i-
solated from citrus peel(navel orange peel and mandarine orange‘JIAOGAN’peel)showed clear bands of 28S rRNA and 18S rRNA，
and the value of OD260 /OD280was close to 2. 0． RT-PCR amplification results also showed that the quality and purity of the RNA ob-
tained from this method can meet the demands of molecular biology experiment．
Key words: Citrus Peel Total RNA Extraction method
收稿日期:2010-01-04
基金项目:国家星火科技项目(2008GA780034) ，潮州市科技引导计划项目，韩山师范学院团队科研项目
作者简介:高雪，女，博士，副教授，主要从事果蔬采后生理、植物分子生物学等研究;E-mail:gaoxue_1@ 163． com
从材料中提取纯度高、完整性好的 RNA是保证
后续试验如逆转录酶聚合酶链式反应(reverse tran-
scriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR) ，North-
ern 杂交，cDNA 文库构建等生物学研究的必要前
提。但由于 RNA 酶无处不在且性质稳定，RNA 易
降解，故在提取时需防止外源 RNA酶的污染及抑制
内源 RNA 酶的活力。由于不同植物、不同生长部
位、组织所含的多酚类、糖类、蛋白质以及一些不明
的次级代谢物有很大差别，不利于 RNA 的分离纯
化，因此能否有效地去除这些物质是提取高质量植
物 RNA的关键［1］。提取不同植物材料 RNA的最适
条件及其相应方法不尽相同。常用提取植物 RNA
的方法有 Trizol试剂法、异硫氰酸胍法、CTAB(十六
烷基溴化三甲胺)法、SDS(十二烷基苯磺酸钠)法
等。柑橘果皮富含果胶和酚类物质，较难获得高得
率和高纯度的总 RNA。本研究探讨一种从柑橘类
果实的果皮提取 RNA 的方法，通过 RNA 得率、纯
度、电泳图谱等分析，证明该方法提取的总 RNA 具
有量多质纯的特点，为深入进行柑橘的分子生物学
研究，及对其它富含果胶和酚类物质的植物总 RNA
提取也有借鉴意义。
1 材料和方法
1. 1 材料与试剂
试验果实分别为脐橙和蕉柑果实。
试剂:M-MLV反转录酶(Promega) ;Taq 酶(Pro-
mega)。其余试剂来自上海生工生物工程公司。
提取 RNA 的各种缓冲液配制如下:匀浆缓冲
液:6%氨基水杨酸，1% SDS，5%苯酚，50 mmol /L
Tris pH8. 5。提取缓冲液:2% CTAB，100 mmol /L
Tris pH8. 0，20 mmol /L EDTA pH8. 0，1. 4mol /L
NaCl。沉淀缓冲液:1% CTAB，50 mmol /L Tris
2010 年第 7 期 高雪:一种适合从柑橘果皮提取总 RNA的方法
pH8. 0，20 mmol /L EDTA pH8. 0。
试剂(除含 Tris 者)和塑料耗材先用 0. 1%
DEPC(焦碳酸二乙酯，diethypyrocarbonate)处理 24 h
以上，然后高压灭菌;研钵等高温烘烤 12 h 以上，以
避免 RNA酶的污染。
1. 2 柑橘果皮 RNA的提取
脐橙和蕉柑果实分别取果皮，液氮速冻后，于
－ 80℃保存待用。(1)取果皮组织 5 g，在液氮保护
下充分研磨。按 1 mL /g组织加入匀浆缓冲液，和苯
酚 /氯仿(1∶ 1) ，匀浆。(2)将匀浆液转移到 50 mL
RNase-free 离心管中，4℃，10 000 r /min 离心 15
min，转移上清至另一 50 mL 离心管(如希望提高
RNA产量，可加入匀浆缓冲液，重复该步骤 1 次)。
(3)加入 0. 1 倍体积的 3mol /L NaAc(pH5. 2)和 1
倍体积的异丙醇，－ 20℃放置 0. 5 － 2 h 沉淀 RNA。
(4)4℃，6 000 r /min离心 10 min，弃上清;用 80%乙
醇洗涤沉淀 1 次，离心，去乙醇;加入 1 mL RNase-
free水溶解，转到 10 mL离心管中。(5)加入等体积
(1 mL)提取缓冲液溶解沉淀;然后加入 2 倍体积(2
mL)的沉淀缓冲液(使 RNA 形成絮状沉淀) ;9℃，
7 500 r /min离心 30 min;弃上清(可重复该步骤 1
次)。(6)9℃，7 500 r /min，离心 20 min;弃上清，加
入 1 mL RNase-free 水溶解，加入等体积的 6 mol /L
LiCl沉淀 RNA，于 － 20℃放置 2 h 沉淀 RNA。(7)
4℃，7 500 r /min 离心 20 min，弃上清，加入 100 μL
RNase-free水溶解，转到 1. 5 mL 离心管中。(8)加
入 0. 1 倍体积的 3 mol /L NaAc(pH5. 2)和 2 倍体积
的乙醇，－ 20℃沉淀 2 h。(9)4℃，14 000 r /min 离
心 15 min，80%乙醇洗涤沉淀 1 次;用吸头吸出残存
的乙醇。将打开盖的离心管在实验台放置几分钟，
以便乙醇挥发完全。(10)加入适量 RNase-free水溶
解，贮存于 － 80℃。
1. 3 RNA的纯度、完整性及质量检测
1. 3. 1 RNA 的纯度及完整性测定 RNA 纯度鉴
定:取 1 μL样品，用 RNase-free水稀释至 100 μL，用
紫外分光光度法测定 RNA在 230，260 和 280 nm处
的紫外吸光值(A) ，每个样品重复 3 次，取平均值。
以 A260 /A280及 A260 /A230比值作纯度分析
［2］;RNA 含
量用计算公式:
RNA(μg /μL)= A260 × 40 ×稀释倍数 /1 000
RNA电泳分析:RNA完整性用1. 0%琼脂糖凝胶
电泳(100 V，30 min) ，然后紫外凝胶成像系统观察。
1. 3. 2 RT-PCR 分析检验 RNA 质量 提取的总
RNA分别采用 M-MLV 反转录酶反转录合成 cDNA
作为 PCR扩增模板，以柑橘管家基因 ubiquitin 的保
守序列设计引物进行 PCR 扩增。ubiquitin 引物:F:
5-TCTTCGCAGGAAAGCAAC-3，R:5-CCTCAGACG-
CAAAACCAG-3。
PCR扩增程序:94℃预变性 5 min;94℃ 45 s，
53℃ 1 min，72℃ 30 s，(27 个循环) ;72℃ 延伸
10 min。扩增产物于 1. 0%琼脂糖凝胶上电泳分离。
2 结果与分析
2. 1 RNA样品的紫外扫描分析
提取的 RNA经过紫外分光光度计测定，结果显
示，脐橙 RNA的 OD260 /OD280比值为 1. 96，蕉柑的比
值为 1. 94，均在 1. 9 － 2. 0 之间，表明所提取的总
RNA无蛋白质、多糖、酚类等杂质污染，纯度高。脐
橙果皮总 RNA 的得率为 380. 17 － 402. 39 μg /g，蕉
柑果皮总 RNA的得率为 391. 70 － 423. 58 μg /g。结
果表明，采用本方法提取的脐橙和蕉柑果皮 RNA的
得率和纯度都较好。
2. 2 RNA的纯度、完整性检测
RNA样品的凝胶电泳分析是判断 RNA 质量的
重要手段之一，从 18S和 28S rRNA的完整性可判断
RNA有无降解以及降解程度，还可判断有无 DNA
污染。琼脂糖凝胶电泳检测结果(图 1)显示，从两
种柑橘果皮中提取的 RNA 的 28S 和 18S 条带整齐
清晰，且 28S 亮度高于 18S，表明 RNA 没有发生降
解;在电泳检测中未发现 DNA 污染，说明该方法提
取的总 RNA质量合格。
2． 3 RT-PCR分析
提取的总 RNA反转录合成 cDNA 作为模板，以
柑橘管家基因 ubiquitin 的保守序列设计引物进行
PCR扩增，以检测 cDNA质量。
从图 2 可见，以 cDNA 作为模板扩增获得的
ubiquitin基因片段(320 bp)在 27 个循环后都出现
了明显的条带，说明 RNA 反转录的 cDNA 质量良
好，完全满足 RT-PCR 的要求。进一步说明采用本
方法提取的柑橘果皮 RNA质量好，可供分子生物学
后续研究使用。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 7 期
1．脐橙;2．蕉柑
图 1 RNA电泳结果
1．脐橙;2．蕉柑
图 2 ubiquitin基因 PCR扩增结果
3 讨论
分离提取高质量的 RNA是基因表达、调控和基
因工程研究的基础，一种好的 RNA 提取方法要求
RNA无降解、产量高、纯度高。某些植物富含多糖、
酚类物质及其它次生代谢物质，往往不利于 RNA的
提取，因此很难用一种方法来适应所有的植物组织
的 RNA提取。所以，要根据实际情况对试验方法改
进与组合。
利用 LiCl沉淀RNA是RNA制备中采用的方法，
该法制备的 RNA纯度高，无多糖等生物大分子的共
沉淀［3，4］。但采用常规 LiCl沉淀方法在提取柑橘果
皮 RNA 时，由于柑橘果皮的多酚类物质、果胶等含
量特别丰富，因此较难提取出纯度高的 RNA。本方
法调整了部分试剂，改进了提取步骤，获得的柑橘果
皮总 RNA 质量好、得率高。在利用该方法获得
RNA的基础上，成功开展了后续的分子生物学研
究，包括建立了脐橙果皮褐变的差减文库［5］、North-
ern blotting等［6，7］，此外，采用该法从番茄幼果、叶片
中提取 RNA，提出的 RNA 完整性好、得率高。因
此，本方法是一种适合于从富含果胶和酚类物质的
植物材料中大量提取总 RNA的方法，可以用于基因
表达分析和分子克隆试验。
参 考 文 献
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［6］Gao X，Li ZG，Fan J，et al． Molecular cloning and expression of an
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