全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第2期
收稿日期:2007-10-16
作者简介:但妍(1979-),女,重庆南岸人,硕士生,主要从事传染病快速诊断方面的研究;电话:(023)68486780,E-mail:cinyadane@hotmail.com
通讯作者:黄爱龙,博士生导师,Tel:(023)68486780,E-mail:ahuang@public.cta.cq.cn
登革病毒的基因组为单股正链 RNA。全长约 11kb,由 3个结构基因(C、prM、E)和 7个非结构基因构
成[1]。NS1是非结构蛋白中唯一的糖蛋白,也是唯一能在感染细胞表面表达和分泌到胞外的非结构蛋白。目
前已经证实在登革热病人的血清中存在循环 NS1抗原和高水平的抗 NS1特异性抗体,NS1可能在机体的
免疫保护和发病机制中发挥着重要作用[2~4]。
克隆并表达了登革病毒 2型 ns1基因片段,得到了重组 NS1蛋白,为进一步研究其生物学特性及免疫
学功能和血清学检测等方面奠定基础。
1 材料与方法
1.1 病毒与菌株
2型登革病毒ns1基因克隆及其表达产物的生物学特性研究
但妍 张娟 张君 郑建 黄爱龙
(重庆医科大学附属第二医院病毒性肝炎研究所,感染性疾病教育部重点实验室,重庆 400016)
摘 要: 目的 克隆并表达2型登革病毒非结构蛋白ns1基因片段,初步鉴定重组蛋白的生物学特性。方法 利
用登革热2型病毒重组质粒,经PCR方法扩增出 ns1全长基因片段,在 pQE30表达系统中表达,表达产物用 Ni柱亲和
层析纯化后,用鼠抗登革病毒免疫血清对重组蛋白进行 Western Blot及 ELISA鉴定。结果 构建的重组质粒 pQE-
30/NS1,pQE-30/NS1-N,pQE-30/NS1-80-200aa和 pQE-30/NS1-C经 IPTG诱导,重组蛋白高效表达并纯化成功,经
Western Blot及 ELISA证实重组蛋白可以被免疫血清特异识别。结论 2型登革病毒结构蛋白表达载体在大肠杆菌
SG13009中高效表达。纯化产物具有较强的免疫原性,为进一步研究NS1的生物学特性和血清学检测奠定了基础。
关键词: 登革病毒 非结构蛋白 克隆 原核表达 免疫原性
CloningandExpressionoftheNs1GeneEncodingthe
NonstructuralProteinofDengueVirusSerotype2and
IdentificationofTheirImmunogenicity
DanYan ZhangJuan ZhangJun ZhengJian HuangAilong
(KeyLaboratoryofMolecularBiologyonInfectiousDisease,TheInstituteforViralHepatitisoftheSecondAfiliated
Hospital,ChongqingUniversityofMedicalSciences,Chongqing400016)
Abstract: ObjectionTocloneandexpres thenonstructuralproteinencodedbyns1geneofdenguevirus
serotype2(DEN2)andtoidentifytheimmunogenicityoftherecombinantproteins.MethodThens1cDNAfragments
wereamplifiedwithPCR from theplasmidcontainedthegenomic-lengthcDNA ofDEN2strainNew GuineaC
(NGC),andwereinsertedtothemulti-cloningsitesofplasmidpQE30vectorandexpresedwithinductionofIPTG.
AfterpurificationusedNi-NTA,theimmunogenicityoftherecombinantproteinsidentifiedwithratantiserum against
denguevirusbyWesternblotasay.ResultTherecombinantproteinswerehighlyexpresedinE.coliSG13009and
couldberecognizedbytheseraagainstdenguevirusfrom rat.ConclusionItisevidentthattherecombinantproteins
showgoodimmunogenicity,whichmayprovideforapotentialsourcetostudythebiologicalsignificanceoftheproteins.
Keywords: DenguevirusNonstructuralprotein Clone Prokaryoticexpresion Immunogenicity
2008年第2期
表 1 扩增登革病毒 2型 ns1基因片段所用引物
2型登革病毒(NGC株)全基因质粒(GeneBankaccessionnumber:AF038403)为澳大利亚 Monash大学
PeterJ.Wright教授惠赠,大肠杆菌 JM109和 SG13009均为本实验室保存。
1.2 质粒和试剂
质粒 pQE30表达载体、Ni亲和层析树脂购自 QIAGEN公司;PCR试剂盒、限制性内切酶、T4连接酶等
均购自 TaKaRa公司;SupersignalWestPicoChemiluminescentSubstrateKits购自 PIERCE公司。其他试剂均
为进口分装或国产分析纯。
1.3 血清标本
鼠抗登革 1~4型病毒血清由美国 CDC的 JefChang博士惠赠。
1.4 ns1目的基因片段的扩增
PCR反应混合液中 (含 10×缓冲液 MgC12,5mM,dNTP1mM,RNaseTaq5U),按以下条件进行反应:
94℃预变性 5min后进入循环反应,94℃30s.55℃30s,72℃60s。共 30个循环,72℃延伸 5min,于 4℃保温。其
中上游引物 5端携带 BamHI的酶切位点,下游引物的 5端携带 SalⅠ的酶切位点。1.5%琼脂糖凝胶电泳
分析扩增产物。
1.5 ns1基因片段表达载体的构建
用 PCR产物纯化试剂盒回收纯化特异的 ns1基因片段,经 BamHI和 SalⅠ双酶切纯化回收后,与同样
处理的 pQE30表达载体经 T4DNA连接酶 4℃作用过夜,转化宿主菌 JM109,酶切鉴定筛选阳性克隆,送序
列鉴定。实验操作详见分子克隆手册[5]。
1.6 NS1重组蛋白的表达与纯化
将 ns1基因片段正确插入的重组质粒转化 SG13009,挑取单菌落接种于含卡那霉素、氨苄青霉素双抗
的 LB培养基中,37℃震荡培养至 OD600约为 0.6~0.8,加入 IPTG至终浓度 1.0mmol/L,37℃继续培养 4h,收
集菌液。N端带有 6×His标签的 NS1蛋白用 Ni-NTA树脂纯化,洗脱的蛋白经透析除去咪唑及尿素进行复
性。SDS-PAGE电泳对表达产物进行鉴定。
1.7 免疫印迹分析
取纯化后登革 2型病毒 NS1蛋白及其片段经 l2%SDS-PAGE电泳分离后转移至 NC膜上。用含 10%脱
脂奶粉 PBS室温封闭 2h后,分别加入按 1:100稀释的鼠抗登革病毒 1~4型血清,一抗 4℃结合过夜,PBST
洗膜后加入相应的 HRP标记的羊抗鼠 IgG,室温作用 1h,洗膜后,ECL显色。
2 结果
2.1 PCR扩增登革 2型病毒 NS1基因片段
以登革 2型病毒重组质粒为模板,扩增 ns1基因,电泳分析显示在约 1000bp、366bp、360bp和 489bp
有特异亮带,大小与预计相符(图 1)。
2.2 重组质粒的构建及鉴定
PCR回收产物用 BamHⅠ及 SalⅠ酶切后定向插入用相同酶消化的 pQE30载体中,获得重组质粒 pQE-
30/NS1,pQE-30/NS1-N,pQE-30/NS1-80-200aa和 pQE-30/NS1-C,重组质粒经酶切鉴定和测序,均与预期结
果吻合,见图 2。
但妍等:2型登革病毒ns1基因克隆及其表达产物的生物学性研究 169
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
2.3 NS1片段在大肠杆菌中表达与纯化
ns1基因片段(图 3)重组质粒转化的阳性克
隆,通过表达条件的比较,证实在 LB培养体系,在
1.0mmol/LIPTG、37℃诱导条件下,于 4h达高峰。
表达蛋白经 SDS-PAGE电泳示相对分子量分别约
为 41kD、14kD、13kD和 20kD,与推测蛋白分子量
大小相符,所表达的蛋白约占菌体蛋白的 30%~
40%。经分离证实表达产物包涵体形式存在,用 Ni
亲和层析树脂进行纯化后获得较高纯度的重组蛋
白(图 4)。
2.4 免疫印迹鉴定
鼠抗登革病毒 1~4型血清分别与转至膜上的
重组蛋白反应。WesternBlot结果显示 1~4型免疫
血清与 rNS1结合作用后,在同一位置呈一致的特
异显色带,2型血清与 rNS1-80-200aa结合反应后,有一明显阳性特异性直条带,其他血清在相同位置未见
任何阳性条带,见图 5。结果表明,重组蛋白与免疫血清有良好的免疫反应性。
图 1 2型登革病毒 ns1目的基因的扩增
1:100bpMarker 2:NS1fragment 3:NS1-Nfragment
4:NS1(80~200aa)fragment 5:NS1-Cfragment
图 2 重组质粒的酶切鉴定
1:λ-EcoT14digestDNAMarker 2:pQE-30/NS1digestedwithBamH
IandXhoI(3400bp+1056bp) 3:pQE-30/NS1-NdigestedwithBamH
IandXhoI(3400bp+366bp) 4:pQE-30/NS1-80-200aadigestedwith
BamHIandXhoI(3400bp+360bp) 5:pQE-30/NS1-C digestedwith
BamHIandXhoI(3400bp+486) 6:100bpMarker
图 3 带 His标签的 NS1重组蛋白片段示意图
rNS1rNS1-N,rNS1-80-200aa和 rNS1-C分别代表 NS1全长重组蛋
白,NS1的 N端,NS1第 80~200氨基酸
图 4 登革 2型病毒 NS1蛋白片段表达纯化 图 5 Westernblot检测登革病毒免疫血清与 NS1蛋白的结合反应
1:Lowmolecularweightproteinmarker 2:rNS1
fragment 3:rNS1-Nfragment 4:rNS1-80-200aa
fragment 5:rNS1-Cfragment
A:rNS1fragment B:rNS1-Nfragment C:rNS1-80-200aafragment
D:rNS1-Cfragment
1:DV1immunizedratseraresponsetorecombinantNS1proteins
2:DV2immunizedratseraresponsetorecombinantNS1proteins
3:DV3immunizedratseraresponsetorecombinantNS1proteins
4:DV4immunizedratseraresponsetorecombinantNS1proteins
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2008年第2期
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
(上接第167页)
11 赵宝华,张莉.微生物学报,1999,39(2):174~177.
12 牟建楼,王颉,陈志周,等.酿酒,2005,32(1):77~78.
13 池振明,张厚程,赵双枝.生物工程进展,2002,22(2):40~43.
14 路玲玲,檀建新,张伟,等.河北农业大学学报,2003,26:163~166.
15 张书祥,肖亚中,任杰,等.生物学杂志,1997,14(1):23~25.
A:rNS1fragment;B:rNS1-Nfragment;C:rNS1-80-200aafragment;D:rNS1-Cfragment
1:DV1immunizedratseraresponsetorecombinantNS1proteins
2:DV2immunizedratseraresponsetorecombinantNS1proteins
3:DV3immunizedratseraresponsetorecombinantNS1proteins
4:DV4immunizedratseraresponsetorecombinantNS1proteins
3 讨论
近年来,登革病毒的感染不仅在东南亚流行趋势加重,而且在世界许多国家和地区复燃,成为严重的
公共卫生问题。但目前登革病毒感染尚无有效的防治措施,登革疫苗的研制也未取得突破性进展,早期检
测诊断方法也正在逐步深入研究。
NS1蛋白是登革病毒的一种重要的非结构糖蛋白,高度保守,可能与病毒毒力有关,但确切功能尚未
阐明。在病毒感染哺乳动物细胞时,NS1蛋白主要有 3种存在形式,与细胞内的细胞器相连或通过选择性
运输途径分泌到细胞表面,或者以可溶性的糖基化方式释放到细胞上清中[6]。4型登革病毒在感染不同宿
主细胞时,由于翻译后处理过程可能存在差异,如糖基化、蛋白切割位点的差异,4个型别的 NS1蛋白分子
量也不相同,介于 35～53kD之间,且不同型别的 NS1蛋白的等电点不同。NS1蛋白包含群特异性和型特异
性决定簇,具有多种 T和 B细胞抗原表位,能够诱发细胞免疫和体液免疫应答。通过比较不同血清型的 4
种 NS1蛋白氨基酸系列,发现 80~200aa变异性最大,可能是型特异性抗原决定簇所在。实验证明,利用原
核系统表达的登革 2型病毒 rNS1蛋白、rNS1-N蛋白和 rNS1-C蛋白可以与 4型登革病毒免疫血清发生反
应,显示出良好的特异性。而 rNS1-80-200aa蛋白只跟 2型登革病毒免疫血清发生特异性反应,也证明了之
前的推测。
综上所述,成功获得了重组的登革 2型病毒 NS1蛋白,具有较好的免疫原性,为下一步制备登革病毒
抗 NS1蛋白型特异型单克隆抗体,以期建立登革病毒分型诊断的方法做好准备。亦为进一步 NS1的生物
学性质、免疫学特性以及亚单位疫苗的研制奠定基础。
参考 文献
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但妍等:2型登革病毒ns1基因克隆及其表达产物的生物学性研究 171