全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第2期
收稿日期:2007-11-07
作者简介:詹爱军(1970-),男,江苏扬州人,现在深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心工作,博士,主要从事动物传染病的研究
通讯作者:毕英佐,E-mail:yzbi@scau.edu.cn;0755-25593227
禽流感(Avianinfluenza,AI)是由正黏病毒科 A型流感病毒引起的一种禽类的感染或疾病综合征。既严
重威胁禽类健康,也具有现实性公共卫生意义[1,2]。虽然禽流感病毒(AIV)灭活疫苗在流感病毒防制过程中
发挥着重要的作用,但还是避免不了免疫后禽群再次发生禽流感病毒感染的现象,因此急需建立一种能够
鉴别疫苗免疫与自然感染的方法,以期达到及早监测到免疫群体野毒感染的目的。A型禽流感病毒(AIV)
基因组由 8条负链单股 RNA节段组成,其中第 8节段编码 2种蛋白,即非结构蛋白 1(NS1)和非结构蛋白
2(NS2)。NS1蛋白在感染早期合成,分子量为 24kD,主要在细胞核内聚集,在抑制由干扰素介导的抗病毒
H5亚型AIVNS1基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达
詹爱军 1,2 王新卫 3 王宪文 1 覃健萍 1 毕英佐 1 于康震 4 曹永长 1
(1华南农业大学动物科学学院,广州 510642;2深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心,深圳 518042;
3河南农业大学牧医工程学院,郑州 450002;4中国兽药监察所,北京 100081)
摘 要: 应用DNAStar软件,参照Genbank中注册的 AIVH5亚型毒株 NS1基因序列,设计了一对引物,用RT-
PCR方法成功地扩增出带双酶切位点的H5亚型AIV的NS1基因,通过BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切位点将H5NS1基因
插入转移质粒载体pFastbacHTa中,获得重组转移载体pFastbacHTa-H5NS1并将其转化DH10Bac细胞,与Bacmid发
生位点特异性转座作用,得到重组穿梭载体Bacmid-H5NS1,再将其转染昆虫细胞 HighFive,PCR鉴定证实该基因正确
地插入到病毒基因组的多角体蛋白基因启动子下游,经过SDS-PAGE和WesternBlot检测,NS1基因在HighFive细胞
中得到了表达,H5NS1大小约为28kD,而且表达的产物具有特异免疫学反应性。
关键词: 禽流感病毒 非结构蛋白 杆状病毒表达 克隆
MolecularCloningofNon-StructuralProteinNS1GeneofH5N1
AvianInfluenzaVirus(AIV)anditsExpressioninInsectCels
ZhanAijun1 WangXinwei2 WangXianwen1 QinJianping1 BiYingzuo1
YuKangzhen3 CaoYongchang1
(1ColegeofAnimalScience,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642;2TechnicalCenterofAnimaland
PlantQuarantineInspection,ShenzhenCIQ,Shenzhen518042;3ColegeofAnimalHusbandryandVeterinary,Henan
AgriculturalUniversity,Zhengzhou450002;4ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081)
Abstract: A pairofprimerswasdesignedbyemployingDNAStarsoftwareandconsultingtheNS1nucleotide
sequencesofH5subtypesAIV.ThentheNS1genewithflankingrestrictionsiteswassuccesfulyPCR-amplified.The
H5-NS1genewasexcisedwithBamHⅠandEcoR IandinsertedintothetransfervehiclepFastbacHTatoobtainthe
recombinanttransfervectorspFastbacHTa-H5NS1,whichwasusedtotransform DH10Bac-hostcels,producingspecific
transpositionwithBacmidtoyieldtherecombinantshutlevehicles,Bacmid-H5NS1.AndthentheBacmid-H5NS1was
furtherusedtotransfectHighFiveinsectcels,whenPCR identificationprovedthatthegenewasinsertedincorect
orientationdownstream oftheviruspolyhedralproteinpromoter;SDS-PAGEandWesternblotingdetectionconfirmed
thatthegenehadbeenexpresedinHighFivecels,thesizeoftheH5NS1beingapproximately28kD.Theexpresion
productcouldspecialyreacttotheseraofAIV.
Keywords: AvianinfluenzavirusNon-Structuralprotein Baculovimsexpresion Cloning
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
防御中起重要作用 。NS1蛋白在病毒感染的细胞中大量表达,但是在病毒粒子中检测不到。因此在理论
上,禽流感灭活疫苗免疫动物不会产生针对 NS1蛋白的抗体,而该抗体只能出现于野毒感染动物的血清
中,从而可以将 NS1蛋白作为诊断试剂来鉴别诊断免疫动物和自然感染动物[3]。为此,对 H5AIV的 NS1基
因进行了克隆与真核表达,旨在建立一种以 NS1蛋白为抗原,区分 AIV感染鸡群和疫苗免疫鸡群的鉴别
诊断方法。
1 材料与方法
1.1 病毒和抗体
禽流感病毒 A/Duck/GD/2001/H5N1由华南农业大学动物科学学院基因工程室分离、鉴定和保存。抗
H5N1亚型 AIV特异性抗血清,均由华南农业大学基因工程室提供。
1.2 质粒、菌株和主要试剂
E.coliDH5a为 Novagen公司产品;TaqDNA聚合酶,dNTP,AMV反转录酶,限制性内切酶 BamHⅠ﹑
EcoRⅠ、T4DNA连接酶均为大连宝生物工程有限公司产品;ReagentTotalRNAIsolationKit为上海生工生物
工程技术服务有限公司产品;GelExtractionKit为 OMEGA公司产品。转移载体 pFastbacHTa、穿梭质粒
Bacmid(在 DH10Bac细胞中)和昆虫细胞 HighFive由中山大学生物防治国家重点实验室赠送。
1.3 引物设计
应用 DNAStar软件,参照 Genbank中注册的 AIVH5亚型 NS1基因序列,设计了 1对引物,上游引物
(NSP1)5′端加 BamHⅠ酶切位点,下游引物(NSP2)5′端加 EcoRⅠ酶切位点用于该基因的克隆,预期扩增产
物大小为 690bp。根据 Invitrogen公司杆状病毒手册设计一对引物 M13UP和 M13DOWN,用于检测目的基
因是否连到杆状病毒载体上;引物序列分别为:
NSP15ATTGGATCCATGGATTCCAACACTGTGTCA3
NSP25ATTGAATTCTCAAACTTCTGACTCAATTGTT3
M13UP5-GTTTTCCCAGTCACGAC-3
M13DOWN5-CAGGAAACAGCTATGAC-3
引物由广州赛百胜生物工程公司合成,合成后的引物用加DEPC三蒸水稀释成25μmol/L的溶液-20℃保
存备用。
1.4 NS1基因的克隆与鉴定
病毒总 RNA的提取参照 ReagentTotalRNAIsolationKit说明书进行。然后,参照 ReverseTranscriptase
XI(AMV)说明书进行反转录,条件为:室温下作用 10min,42℃水浴 1h。PCR反应条件为:95℃预变性 5min,
然后 94℃1min,53℃1min,72℃1min,30个循环后,72℃再延伸 10min。PCR产物于 1%琼脂糖凝胶中电泳
分析。然后,将 H5亚型流感株 NS1基因扩增产物用 GelExtractionKit回收后直接送上海博亚有限公司
(PCR产物)测序。
1.5 重组杆状病毒转移载体的构建
杆状病毒转移载体 pFastBacHTa与 NS1PCR产物同时分别经 EcoRⅠ与 BamHI双酶切后回收。从凝
胶中回收 NS1片段和表达载体片段,用 T4DNA连接酶连接后转化工程菌 DH5a感受态细胞,用小量法提
取重组质粒,酶切和测序进行鉴定,筛选的阳性重组子命名为 pFastbacHTa-H5NS1。将重组质粒
pFastbacHTa-H5NS1转化 DH10Bac感受态细胞,涂布三抗、X-Gal、IPTG平板,放于 37℃避光培养 48h,挑取
白色菌落在新的三抗、X-Gal、IPTG平板上划线,放于 37℃避光培养 48h,挑取白色单个菌落至含有 3种抗
生素的 LB溶液摇振培养增菌,直接以菌液为模板用特异性引物 NSP1/NSP2进行 PCR鉴定,阳性的菌落可
能是野生型 Bacmid和 pFastBacHTa的杂合子,然后再用引物 M13UP和 M13DOWN进行进一步 PCR鉴定
阳性重组转座子,命名为 Bacmid-H5NS1。
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2008年第2期
1.6 重组杆状病毒的获得与 NS1基因在 HighFive细胞中的表达
将 Bacmid-H5NS1转染 Highfive昆虫细胞。待细胞 80%病变后收集上清作为第 1代重组病毒,经过 3
次传代后筛选到高滴度的含有 NS1基因的重组杆状病毒。将重组杆状病毒接种处于对数生长期并且生长
良好的 HighFive细胞,进行基因表达。同时设置 Bacmid感染细胞作为对照。
1.7 表达蛋白的 SDS-PAGE分析与 Westernblot鉴定
感染后 72h,细胞已贴壁很松,用培养基轻轻将其吹下,3000r/min离心 10min,弃培养基上清,细胞沉
淀用冰预冷的 PBS洗涤两次,按每 1×106个细胞加入 200μl2×SDS-PAGELoadingBufer煮沸 5min,取 20μl
以 12%凝胶进行电泳,完毕后经考马斯亮蓝染色,后将凝胶置于 VL凝胶成像系统中进行照相和分析。同
时设未插入外源基因片段的 Bacmid转染的细胞。然后,样品再进行 SDS-PAGE电泳后,取下凝胶进行转
印。将转印好的 NC膜与被 AIV阳性血清按常规方法进行 Westernblot反应[4]。
2 结果
2.1 NS1基因的克隆与鉴定
采用 RT-PCR技术,用特异性引物 NSP1/NSP2成功扩增出 NS1基因,扩增产物经 1%琼脂糖电泳检测
可见大小约 700bp左右的片断,与预期结果一致(图 1)。将该
PCR产物送生物公司测序,结果获得了目的基因 NS1。
2.2 重组杆状病毒转移载体的构建
pFastbacHTa-H5NS1质粒经 BamHI和 EcoRI双酶切后获
得两个 DNA条带,大小分别为 4850bp和 700bp;用 BamHⅠ单
酶切获得单一条带,大小约为 5550bp。与预期的相符(图 2),
序列分析进一步验证插入的 NS1基因序列正确。
2.3 重组转座子 Bacmid-H5NS1的 PCR鉴定
以 Bacmid-H5NS1为模板,用引物 M13UP和 M13DOWN
鉴定 PCR。引物 M13UP和 M13DOWN位于 Bacmid中 miniatTn7两端序列,所以在未经 pFastBacHTa-转化
的 DH10Bac中,Bacmid的 PCR扩增产物为大约 300bp的片段,转化之后的 DH10Bac中,重组 Bacmid的
PCR扩增产物为大约 3100bp的片段(图 3),与预期值相符,重组正确。
图 2重组质粒 pFastbacHTA-H5NS1酶切鉴定
图 1 H5NS1基因 PCR扩增
M:DNAMarkerDL20001~6:H5NS1基因 PCR产物
M1:DNAMarkerDL20001:pFastbacHTA-H5NS1的 BamHI,EcoRI双酶
切 M2:DNAMarkerDL150002:pFastbacHTA-H5NS1的 BamHI单酶切
图 3 BacmidH5NS1的 PCR鉴定
M1:DNAMarkerDL2000 M2:DNAMarkerDL15000
1~3:BacmidH5NS1的 PCR产物
詹爱军等:H5亚型AIVNS1基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达 193
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
(下转第198页)
2.4 表达产物的 SDS-PAGE
H5NS1基因本身编码的蛋白理论分子量为 24kD,加上载体两端序列编码的约 4kD,则表达的融合蛋
白的理论分子量为 28kD。重组病毒感染 HighFive细胞后,经 SDS-PAGE分析,比对照组多出一蛋白条带,
分子量与融合蛋白的大小基本一致(图 4)。
2.5 WesternBlot鉴定
表达的 NS1蛋白用特异性的禽流感阳性血清进行免疫印迹分析 (WesternBlot检测),结果如图 5所
示,在分子量为 28kD处出现特异条带。而野生型杆状病毒转染 HighFive细胞后表达蛋白检测呈阴性。表
明 NS1蛋白待到表达,并且具有特异的免疫学反应性。
图 4 重组 H5NS1蛋白的 SDS-PAGE分析
1:野生型杆状病毒转染 Highfive细胞收获的蛋白 2,3:
重组杆状病毒 BacmidH5NS1转染 Highfive细胞收获的蛋白
M:标准分子量蛋白 Marker(图中箭头所指处为重组蛋白)
图 5 重组蛋白 H5NS1的 Western-Blot分析
M:标准分子量蛋白 Marker(图中箭头所指处为重组蛋白)
1:野生型杆状病毒转染 HighFive细胞后表达蛋白检测呈阴
性 2,3:重组杆状病毒 BacmidH5NS1转染 HighFive细胞
后表达蛋白检测呈阳性
3 讨论
NS1蛋白是 AIV的非结构蛋白之一,也是具有多种生物活性的转录调控蛋白,抑制含有 poly(A)结
构的 mRNA从细胞核内向外运输;抑制前提 RNA的拼接;通过核内融合调节病毒 mRNA的合成;最为
重要的是其抑制宿主产生的干扰素活性[5],利于病毒在宿主细胞内的繁殖。如前述,NS1蛋白的出现仅仅限
于病毒的感染期,可刺激动物机体产生相应抗体,注射灭活疫苗后由于病毒不复制,不会产生针对 NS1蛋
白的抗体,因而可以利用 NS1蛋白作为诊断试剂来鉴别诊断 AIV自然感染和注射灭活疫苗鸡群。利用 RT-
PCR技术成功地扩增了鸡源 H5N1亚型禽流感的 NS1基因,经网上 Blast比对与测序分析,证实获得了长
度为 690bp的目的基因。为进一步构建表达 NS1蛋白的基因载体、研究 NS1蛋白的功能奠定了基础。
体外基因表达系统包括原核细胞系统和真核细胞系统。原核细胞系统主要是大肠杆菌细胞,它操作简
便、周期短、收益大及表达产物稳定,但是表达基因的相对分子量有限,不宜过大,且不能对表达产物进行
一些翻译后加工、修饰。真核细胞系统包括 CHO等哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞等,哺乳动物细胞
表达系统表达量低,酵母细胞表达系统是低等植物,表达产物的生物学特性与原蛋白有很大区别,而昆虫
细胞表达系统(即杆状病毒表达系统)具有独特的生物学特性,日益受到人们的重视[6,7]。与其它表达系统
相比,该系统具有以下几个方面的特点:重组蛋白具有完整的生物学功能、能进行翻译后的加工修饰[8]、表
达水平高、能容纳大分子的插入片段[9]、能同时表达多个基因并且杆状病毒对脊椎动物无感染性[10]。因此,
昆虫细胞杆状病毒表达系统得到越来越广泛的应用。用大肠杆菌-昆虫细胞穿梭载体(Bac-to-Bac系统)技
术成功表达了 H5亚型 AIV的 NS1基因,表达的 NS1融合蛋白分子量为 28kD,Westernblot检测结果表明
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(上接第194页)
其具有特异性免疫学反应性,但须进一步建立临床检测诊断禽流感感染禽和免疫禽的诊断方法,以期达到
实际应用效果。
参考 文献
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构建了 E.tenela杂交虫株 F2的 cDNA表达文库。并且利用构建的文库用抗体或核酸探针进行了新基因的
筛选工作,获得了一些虫体表面抗原基因及阶段性虫体抗原基因。Brothers等(1988)[8]利用 E.tenelaTA4
基因片段克隆出了该基因的全长 cDNA,Binger等 (1993)[9]用兔抗 E.tenela裂殖子表面抗原的抗体从
cDNA文库中筛选出了一个片段(KMZ527),为从构建的 cDNA文库中筛选功能基因奠定了基础,也为构建
完文库后进行后续的工作提供了思路和方法。
SMART技术是构建 cDNA表达文库的常用方法[10],所建文库可用于全长基因的筛选,该方法构建文库
的特点是:1)起始材料少,只要 1μg总 RNA就可满足建库要求,这对于获取生物材料较难的文库构建尤其
适用;2)所建文库具有全长性,应用 5′末端转换机制,在新生的 cDNA第一链末端加寡聚 C,再用含寡聚 G
的 5′引物及 3′端 CDS引物扩增出全长基因,可从全长文库中筛选感兴趣的目的基因,而不必再花时间扩
增全长。应用 SMART方法成功构建 E.maxima孢子化卵囊 cDNA表达文库,经检测文库质量良好,达到所
构建文库的容量应不小于 1.7×105pfu/ml、插入片段的大小应在 500bp以上的要求[11,12],为筛选抗原基因和
功能性基因奠定了基础。
参考 文献
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