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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第5期
收稿日期 : 2011-11-04
基金项目 : “十二五”国家高技术研究发展计划项目（2011AA10A213）
作者简介 : 王凤雪 , 女 , 博士研究生 , 助理研究员 , 研究方向 : 动物病毒分子生物学 ; E-mail: wangfx_vet@163.com
通讯作者 : 武华 , 男 , 博士 , 研究员 , 研究方向 : 动物疫苗与分子免疫学 ; E-mail: huawuqyh@yahoo.com
高致病性 PRRSV Nsp2 基因 RNA干扰对
病毒复制的影响
王凤雪 师新川 温永俊 胡嘉欣 刘准 武华
（中国农业科学院特产研究所，长春 130122）
摘 要： 旨在构建针对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）TJ株 Nsp2基因的 siRNA的表达载体，研究 Nsp2基因的表达
抑制对 PRRSV复制的影响。设计并合成针对 PRRSV TJ株 Nsp2基因的 3对优势小发卡 RNA（shRNA），连接到 pRNAT-U6.1/Neo，
构建 shRNA表达载体，将鉴定正确的载体质粒转染 Marc-145细胞，6 h后接毒，每日观察 CPE；在接毒 PRRSV TJ株后不同时间
点取上清样品，测定样品 TCID50；并以 β-actin为内参，RT-PCR对 PRRSV Nsp2 mRNA进行半定量。结果表明，选取的 3条 Nsp2
基因的优势 siRNA 均能够抑制 PRRSV TJ株在 Marc-145细胞上增殖，其中 shRNA载体 S-1和 S-2抑制效果明显，与空载体相比
较差异极显著。本研究构建的 PRRSV Nsp2基因特异性 shRNA载体能够有效抑制 PRRSV的复制，可使病毒滴度 TCID50最多降低
103.38。
关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒 非结构蛋白 2 RNA干扰
Influence of RNA Interference Mediated HP-PRRSV TJ Nsp2 Gene
Silencing on Viral Replication
Wang Fengxue Shi Xinchuan Wen Yongjun Hu Jiaxin Liu Zhun Wu Hua
（Institute of Special Wild Economic Animal and Plant Science CAAS，Changchun 130122）
Abstract: It was to construct shRNA recombinant expression vector specific to Non-structural protein 2（Nsp2）gene and to investigated
the effect of Nsp2 gene siRNA on porcine reproductive and respiratory syndrome virus replication. Three pairs complementary single strand
DNA oligos targeting three various sites of Nsp2 siRNAs were designed, synthesized and cloned to pRNAT-U6.1/Neo expressed vector. The
vectors identified by sequencing were transfected into Marc-145 cells. Then, we infected the Marc-145 cells with PRRSV TJ strain after 6 h post
infection. CPE was observed every day. Sampling at series times was measured by RT-PCR aimed Nsp2 mRNA and TCID50 assay was used to
titer. The results showed three siRNAs of Nsp2 all inhibited the replication of PRRSV on Marc-145 cells successfully, among which the effect of S-1
and S-2 were visible. The specific shRNA vector of PRRSV Nsp2 could effectively inhibit the replication of PRRSV, and decreased the virus titre
not less than 103.38.
Key words: Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Non-structural protein 2 RNA interference
双链 RNA（dsRNA）对基因表达的阻断作用被
称为 RNA 干扰（RNA interference，RNAi），能降解
与其互补的 mRNA，特异性诱发转录后基因沉默。
小发夹 RNA（short hairpin RNA，shRNA）为序列特
异性诱导目的基因表达沉默的 RNAi 技术，shRNA
具有紧密发卡环（tight hairpin turn），可高效、持久
沉默靶基因的表达［1］，在基因功能、抗病毒及肿瘤
基因治疗研究方面应用极广。装载了 shRNA 的载体
转到细胞中，shRNA 的发卡结构被细胞机制切割成
siRNA，然后 siRNA 结合到 RISC 上，降解 mRNAs。
属于动脉炎病毒科、动脉炎病毒属［2］的猪
繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and
2012年第5期 133王凤雪等 ：高致病性 PRRSV Nsp2 基因 RNA 干扰对病毒复制的影响
respiratory syndrome virus，PRRSV）可引起母猪繁
殖障碍和仔猪的死亡。2006 年以来我国境内该病
爆发严重，病原为新出现的高致病性 PRRSV（HP-
PRRSV）。PRRSV 为单股正链 RNA 病毒，全长约
15.5 kb，由 ORF1-ORF7 组成，编码非结构蛋白
Nsp1-Nsp12 及 7 个结构蛋白［3-6］。其中，非结构蛋
白 Nsp2 变异明显，HP-PRRSV Nsp2 蛋白的缺失报
道较多［7-9］。我国高致病性 PRRSV 致病性的改变可
能是病毒复制过程中病毒与细胞作用方式改变引起
的。有资料显示，Nsp2 蛋白与PRRSV的复制有关［10］，
Nsp2 蛋白作为一个多功能蛋白，可能对 PRRSV 复
制和病毒的致病性有很深的影响 ［11］。目前，国内与
HP-PRRSV 毒力及复制功能的相关研究较少。本研
究设计了高致病性 PRRSV TJ 株 Nsp2 基因特异性小
发卡干扰 RNA，构建质粒，转染 Marc-145 细胞后
接 PRRSV，通过病毒 CPE，Nsp2 mRNA 表达量的变
化、病毒滴度等方面，观察构建的 Nsp2 基因特异性
shRNA 载体对 HP-PRRSV TJ 株复制的抑制程度。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质粒、细胞和病毒 含鼠 U6 启动子的质粒载
体 pRNAT-U6.1/Neo 购自金思特科技（南京）有限公
司； Marc-145 细胞用含 8% 胎牛血清（FBS）的 MEM
培养液、5% CO2、37℃条件下培养。PRRSV TJ （属
于北美洲型） 分离株由本研究室分离鉴定并保存 ［12］。
1.1.2 试剂 限制性内切酶、质粒纯化试剂盒、转
染试剂 Lipofectamine2000TM、RNA 提取试剂 Trizol 均
为 Invitrogen 公司产品 ；MEM 购自 Gibco 公司 ；禽
源反转录酶（AMV）、Ex Taq 酶为 TaKaRa 公司产品。
其他试剂为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 引物设计与合成 根据网站（http ：//www.
ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html）提供的在
线分析软件寻找 PRRSV TJ 株 Nsp2 蛋白基因的优势
siRNA 序列，PRRSV TJ 株（GenBank No. EU860248）
利用 Prime Primier 5 设计合成扩增 shRNA 的寡聚核
苷酸，扩增的 shRNA 包括两个短反向重复序列，中
间由一茎环（loop）序列分隔的，组成发夹结构，由
pol Ⅲ启动子控制，随后的 5-6 个 T 作为 RNA 聚合
酶Ⅲ的转录终止子，两个互补的寡核苷酸两端带有
限制性酶切位点，本研究共找到 3 个优势序列，设
计了 3 对 shRNA 引物 ；同时设计用于 RT-PCR 检测
Nsp2 基因 mRNA 表达的一对引物（扩增产物长度
133 bp）及一对内参 β-肌动蛋白（β-actin）引物（扩
增产物长度 547 bp）。所有引物由 Invitrogen（上海）
贸易有限公司合成，引物序列见表 1。
1.2.2 siRNA 的筛选及 PRRSV TJ 株 Nsp2 蛋白基因
shRNA 表达载体构建 使用网站提供的软件选取针
对 PRRSV 的优势 RNAi 靶向位点，为了保证干扰效
果，在 Nsp2 基因上共选取 3 个位点 ：1、2 和 3。引
物扩增 shRNA 序列，利用两端酶切位点顺序克隆到
pRNAT-U6.1/Neo 载体上，测序鉴定阳性克隆，并纯
化质粒，-20℃保存备用。
表 1 扩增 Nsp2基因、shRNA序列及内参基因所用引物
片段 引物名称 引物序列（5-3）
Nsp2 部分片段
Ns-U CGCCAGAGTGTAGGAACG
Ns-L ACAATGCCAAGCCTAAGC
shRNA 1
S1-U GATCCCCGGATGGTGAATTCCAACTTCAAGAGAGTTGGAATTCACCATCCGGTTTTTTCAA
S1-L AGCTTTGAAAAAACCGGATGGTGAATTCCAACTCTCTTGAAGTTGGAATTCACCATCCGGG
shRNA 2
S2-U GATCCCAACCTCACGTCAACTCATTTCAAGAGAATGAGTTGACGTGAGGTTGTTTTTTCAA
S2-L AGCTTTGAAAAAACAACCTCACGTCAACTCATTCTCTTGAAATGAGTTGACGTGAGGTTGG
shRNA 3
S3-U GATCCATGGCAGGTTTGAGTTTCTTTCAAGAGAAGAAACTCAAACCTGCCATTTTTTTCAA
S3-L AGCTTTGAAAAAAATGGCAGGTTTGAGTTTCTTCTCTTGAAAGAAACTCAAACCTGCCATG
β-actin
β-actin-U CTGGCATTGTCATGGACTCT
β-actin-L GCGATGATCTTGATCTTCAT
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第5期134
1.2.3 shRNA 表达载体的转染及病毒的感染 在 6
孔细胞培养板中铺 Marc-145 细胞单层，每孔含细
胞数 6×104，用不含抗生素的 6% FBS 的 MEM 培
养 24 h。 根 据 LipofectamineTM2000 说 明 书， 用 无
血清 DMEM 稀释 4 μg shRNA 表达载体质粒 S-1、
S-2、S-3 和空载体 SD，轻轻混匀 ；同样方法稀释
Lipofectamine2000TM（使用前轻轻颠倒混匀），室温
作用 5 min 后，将两者混合均匀，室温作用 20 min，
以使脂质体包括质粒形成复合物 ；在此期间，用灭
菌 PBS 洗涤细胞两遍，待复合物形成后，将之加入
细胞中，轻轻混匀，37℃，CO2 培养箱孵育 4 h，用
含双抗（青霉素 100 IU/mL、链霉素 100 μg/mL）和 2%
血清的 MEM 换液，同时做不转染对照。转染后 6 h
后接入0.01 MOI的 PRRSV，感作1 h后，吸去病毒液，
换含有 2% FBS 的 MEM 培养液，37℃培养，24-36 h
荧光显微镜下观察转染效率，随后逐日观察 CPE。
1.2.4 半定量 RT-PCR 检测 shRNA 表达载体抑制
效果 转染后 12、24、36 和 72 h，收集细胞上清，
用 TRIzol 法进行细胞总 RNA 的提取。反转录获
得 cDNA 后，利用设计的 Nsp2 检测引物和内参对
照 β-actin 扩增引物进行 RT-PCR 反应。反转录条件
为 70℃ 10 min，冰水浴 5 min，42℃ 50 min，70℃ 5
min，冰水浴 3 min。PCR 扩增程序为 ：94℃ 2 min ；
94℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 30 s，共 30 个循环 ；最
后 72℃再延伸 10 min。扩增产物经 1.5% 琼脂糖凝
胶电泳，电泳完毕后用紫外凝胶成像分析仪照相并
用 BandLeader 软件灰度扫描，计算目的条带与内参
条带灰度比值。
1.2.5 shRNA 干扰后病毒毒价滴定 当细胞出现
CPE 时，收集各处理细胞的培养上清，10 倍系列稀
释，共 7 个稀释度，接种于预先在 96 孔板培养的
Marc-145 细胞中，100 μL/ 孔，每个样品设 8 个重
复。观察细胞病变，直到没有细胞病变孔出现，按
Karber 法计算 TCID50。
2 结果
2.1　shRNA的扩增及表达载体的构建
引物对 S1-U/S1-L、S2-U/S2-L 和 S3-U/S3-L 分别
退火扩增，获得 shRNA 片段，BamHⅠ/Hind Ⅲ处理
pRNAT-U6.1/Neo 载体和 shRNA 片段，T4 连接酶连
接载体与 shRNA 片段，测序鉴定正确的特异 shRNA
表达质粒分别命名为S-1、S-2和S-3，测序结果见表2，
试剂盒纯化鉴定为阳性的 shRNA 表达载体质粒，测
定浓度，-20℃保存备用。
表 2 Nsp2基因特异的 shRNAs载体测序结果
shRNA 表达载体名称 siRNAs 序列（5-3） 酶切位点
S-1 GGATCCCCGGATGGTGAATTCCAACTTCAAGAGAGTTGGAATTCACCATCCGGTTTTTTCAAAGCTT BamH Ⅰ，Hind Ⅲ
S-2 GGATCCCAACCTCACGTCAACTCATTTCAAGAGAATGAGTTGACGTGAGGTTGTTTTTTCAAAGCTT BamH Ⅰ，Hind Ⅲ
S-3 GGATCCATGGCAGGTTTGAGTTTCTTTCAAGAGAAGAAACTCAAACCTGCCATTTTTTTCAAAGCTT BamH Ⅰ，Hind Ⅲ
2.2　 shRNA表达载体转染效率及对PRRSV的抑制
作用
用 shRNA 表达载体转染 Marc-145，同时设定
空载体质粒对照，6 h 以后，用 0.01 MOI 的 PRRSV
TJ 株接毒。转染后 24 h，荧光显微镜下观察（图 1），
空载体 S 和 3 个 shRNA 表达载体质粒转染孔内荧光
细胞占所有细胞总数均在 40%-60% 以上 ；转染 60
h 后，观察细胞病变，结果（图 2）显示，shRNA
表达载体处理细胞接毒后均无明显细胞病变，而
空载体对照和未处理对照的单层感染细胞上都产生
了 PRRSV 特异的细胞病变。说明筛选到的这 3 个
siRNA 均能抑制 PRRSV 的复制。
A. 转染空载体 S 的 Marc-145 细胞 ；B. 转染 Nsp2 基因 shRNA 表达载体 S-1
的 Marc-145 细胞；C. 转染 Nsp2 基因 shRNA 表达载体 S-2 的 Marc-145 细胞；
D. 转染 Nsp2 基因 shRNA 表达载体 S-3 的 Marc-145 细胞
图 1 24 h荧光显微镜下观察 Nsp2特异 shRNA表达
载体在Marc-145细胞上的转染效率（20×）
2012年第5期 135王凤雪等 ：高致病性 PRRSV Nsp2 基因 RNA 干扰对病毒复制的影响
2.3 半定量 RT-PCR检测PRRSV Nsp2 mRNA相对
表达量
1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测 RT-PCR 产物（图
3）发现，与空载体（S）及未处理对照组（C）相
比，shRNA 表达载体 S-1、S-2 和 S-3 处理细胞接毒
后，检测 Nsp2 扩增片段条带（133 bp）的亮度，S-3
处理细胞中目的条带亮度较弱，但不如 S-1、S-2 处
理细胞抑制效果明显，内参 β-actin 扩增条带在各处
理细胞中亮度基本一致。灰度扫描半定量结果 （图
4）显示，与空白组及阴性对照组相比，S-1、S-2 和
S-3 处理细胞接 PRRSV TJ 株的 Nsp2 mRNA 相对表
达量与内参对照 β-actin 相对表达量比值较低，S-1、
S-2 与内参相比较差异极显著（t检验，P<0.001）。
说明设计构建的 Nsp2 shRNA 表达载体能有效抑制
PRRSV 复制，并且 S-1、S-2 抑制效果更明显。
A. 未转染细胞接毒孔 ；B. 空载体转染后接毒孔 ；C. Marc-145 细胞对照孔 ；
D. shRNA 表达载体 S-1 转染后接毒孔 ；E. shRNA 表达载体 S-2 转染后接毒
孔 ；F. shRNA 表达载体 S-3 转染后接毒孔 ；圈内为 CPE 细胞
图 2 60 h观察 Nsp2特异 shRNA对 PRRSV TJ株在
Marc-145细胞上复制的抑制效果（20×）
S. 空载体处理细胞接毒上清；S-1，S-2，S-3. Nsp2 干扰 RNA 载体 S-1、S-2 和 S-3
处理细胞接毒上清 ；C. 未处理细胞接毒上清 ；H2O. PCR 阴性对照
图 3 mRNA水平检测 Nsp2特异 shRNA表达载体对
PRRSV的抑制效果
图 4 灰度扫描半定量结果
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第5期136
2.4　病毒毒价滴定
收集 PRRSV Nsp2 shRNA 表达载体处理细胞后
接毒的细胞冻融物，进行毒价滴定。结果表明，S-1、
S-2 和 S-3 处理细胞后接毒的细胞冻融物均比空载
体 S 和未处理细胞接毒的冻融物毒价低（图 5），可
使病毒滴度 TCID50 最多降低 103.38。说明构建的 3 个
Nsp2 shRNA 表达载体均能够抑制 PRRSV 的复制，
S-1 和 S-2 的抑制效果最明显，差异极显著（t检验，
P<0.001）。该结果与 Nsp2 基因的 mRNA 水平半定
量结果相符。
编码的一个半胱氨酸蛋白酶，并且发现在细胞培养
中半胱氨酸蛋白酶抑制子能够阻断病毒的复制。本
试验采取了 RNA 干扰的手段研究 Nsp2 基因对 HP-
PRRSV 复制的影响。siRNA 的沉默效应与目的基因
mRNA 靶位点的可及性密切相关，试验研究和软件
分析均表明了这一点，靶 mRNA 与 siRNA 反义链结
合区域的二级结构越复杂，siRNA 结合越难，RNA
干扰的效果就越差［18-21］。
本试验设计的 3 条 PRRSV Nsp2 基因特异性
shRNA 序列遵循几个基本原则 ：（1）shRNA 包括两
个短反向重复序列，中间由一茎环（loop）序列分
隔的，组成发夹结构，由 pol Ⅲ启动子控制。随后
在连上 5-6 个 T 作为 RNA 聚合酶Ⅲ的转录终止子。
（2）两个互补的寡核苷酸两端带有限制性酶切位点。
（3）shRNA 目的序列的第一个碱基必须是 G 以确保
RNA 聚合酶转录。（4）shRNA 插入片段中的茎环靠
近寡核苷酸的中央。（5）在正义链和反义链序列上
不存在连续 3 个或以上的 T。
4 结论
本试验结果表明，质粒介导的针对 PRRSV Nsp2
的 3 个基因特异性 shRNA 载体转染 Marc-145 细胞，
能够有效抑制 PRRSV 在 Marc-145 细胞内的复制和
增殖，特别是在 PRRSV 复制早期。带有的荧光标记
能评价转染效率，保证抑制试验效果的可信度。毒
价滴定表明，这些 shRNAs 处理细胞后接毒，病毒
滴度均有所下降，而 S-1 和 S-2 处理细胞接毒后，病
毒滴度 TCID50 降低明显，最多降低 103.38，与空载体
比较差异极显著（P<0.001）。
参 考 文 献
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图 5 Nsp2特异 shRNA表达载体处理 Marc-145细胞后
PRRSV复制滴度的测定
3 讨论
RNA 干 扰（RNA interference，RNAi） 现 象 最
早在秀丽线虫和植物体内发现［13］，主要由核酸内切
酶介导引发的 RNAi 反应［14］。RNAi 简单说是指短
的双链 RNA 通过降解与其互补的 mRNA，从而特异
性诱发转录后基因沉默的现象。其基本原理是短干
扰 RNA（short interference RNA，siRNA）被输送到
RNA 诱导沉默复合物（RNA-induced silencing protein
complex，RISC），siRNA 作为引导序列引导 RISC 与
同源 mRNA 结合，解旋酶催化下，mRNA 与 siRNA
的正义 RNA 链相互交换，而与 siRNA 的反义链结合，
核酸酶特异性识别、切割和降解靶 mRNA，随后
siRNA 双链重新形成，继续发挥降解同源 mRNA 作
用［15］。siRNA 导入哺乳动物细胞中也能引发 RNAi
效应［16］，该技术可以控制动物病原微生物的细胞
内复制过程。利用基因干扰沉默病毒蛋白表达，研
究 PRRSV 基因功能，国内已有研究者进行了结构蛋
白的研究［17］。前人的研究初步证明，PRRSV 非结
构蛋白在病毒复制过程中发挥着作用，特别是 Nsp2
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（责任编辑 马鑫）