全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第5期
收稿日期:2008-03-30
作者简介:陶萍(1980-),女,四川邛崃人,硕士生,研究方向:传染性疾病的快速诊断;E-mail:athrun_akira@qq.com
通讯作者:黄爱龙,E-mail:ahuang@public.cta.cq.cn
登革病毒(Denguevirus,DEN)是黄病毒科(Flaviviridae)成员,它包括 1~44个血清型。登革病毒感染主
要引起登革热(DF)、登革出血热(DHF)和登革休克综合症(DSS),人群对登革病毒普遍易感。DHF/DSS病
情严重,病死率高,其发病机制至今尚未阐明。目前对该病尚无疫苗预防和特效药物治疗,加上控制蚊媒困
难等原因,登革病毒感染在世界范围内呈蔓延趋势。[1]因此研究快速方便的检测方法就势在必行。登革病
毒可编码 3种结构蛋白(核心蛋白 c、膜结合蛋白前体 PrM和包膜蛋白 E)和 7种非结构蛋白(Ns)。包膜蛋
抗登革病毒2型E蛋白单克隆抗体的制备
和生物学特性的鉴定
陶萍 1 帅光泽 2 赖梅梅 1 王雪梅 1 郑健 1 黄爱龙 1
(1重庆医科大学附属第二医院病毒性肝炎研究所 感染性疾病分子生物学教育部重点实验室,重庆 400016;
2成都大学校医院,成都 610106)
摘 要: 为了制备可用于胶体金快速检测试纸条的抗登革病毒2型(DEN2)E蛋白单克隆抗体(mAb),通过基因
克隆获得E基因与质粒pET32a(+)的重组质粒,将重组质粒转化入大肠杆菌BL21,IPGT诱导表达重组蛋白。以DEN2
重组E蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗DEN2E蛋白的mAb,以间接ELISA法和Westernblot进行mAb
特异性鉴定;同时采用间接ELISA法鉴定mAb的Ig亚类。结果表明获得1株可分泌特异性mAb的杂交瘤细胞(7C7),其
抗体亚类为IgG1。Westernblot显示该株mAb能特异识别重组pET32a-DEN2E蛋白。因此,成功制备出抗DEN2E的
1株mAb,为建立快速特异检测登革病毒感染的实验方法提供了有力的工具。
关键词: 登革病毒 单克隆抗体 生物学特性 E蛋白
PreparationandCharacterizationofMonoclonalAntibody
AgainstDENEnvelopePretein
TaoPing2 ShuaiGuangze2 LaiMeimei1 WangXuemei1 ZhengJian1 HuangAilong1
(1TheInstituteforViralHepatitisoftheSecondAfiliatcalHospitalChongqingUniversityofMedicalScience,KeyLabof
MolecularBiologyonInfectionsDiseasesMinistryofEducation,Chongqing400016;2ChengduUniversity,Chengdu610106)
Abstract: Topreparemonoclonalantibody(mAb)againstDEN EnvelopePretein.Thegeneofdenguevirustype2
(DEN2)EnvelopePreteinstrainwasinsertedintocloningvectorpET-32a.ThenitwaslinkedtoexpresionvectorpET-
32a(+)andtransfectedtoE.coliBL21cels.TheEgenefrom DEN2wasexpresedbyIPTGinduction.BALB/cmice
wereimmunizedbyrecombinantDEN2Eprotein.Splenocytesoftheimmunizedmicewerecolectedandfusedwith
themousemyelomacellineSP2/0cels.Thehy-Bridomacelsthatsecretedanti-DEN2EproteinmAbswerecloned
bylimiteddilutionmethod.ThespecificityofmAbwastestedbyELISAandWesternblotanalysis.ThesubtypeofmAb
wastestedbyELISA.Resultsshowedthatfrom over124positivehybridomaswhichsecretedanti-DEN2Eprotein
mAbs,onehybridomawasscreenedout,designated7C7,andchromosomeanalysisrevealedthattheobtainedhybridoma
featureduniversalcharacteristicsofthemonoclonalhybridomacelswhichsecretedmAb.Thesubtypeof7C7wasIgG1.
ThusonespecificmAbagainstDEN2Eproteinwaspreparedsuccesfulyandidentifiedprimarily.
Keywords: DenguevirusMonoclonalantibody Characterization Eprotein
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第5期
白 E蛋白是 DEN吸附靶细胞、致病及诱导免疫保护的关键性蛋白,是登革病毒重要的抗原蛋白,也是登革
病毒主要的毒力蛋白,而且还带有型特异、属特异抗原决定簇[2]。因此,利用重组 E蛋白来制备抗登革病毒
2型(DEN2)E蛋白的单克隆抗体(mAb),为下一步制备 E蛋白的胶体金试纸条做准备。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 质粒和菌株 质粒 pSV-ME及小鼠抗 DEN2血清由第三军医大学馈赠。质粒 pET-32a,大肠杆菌
JM109、BL21为本室保存。
1.1.2 主要试剂 PCR试剂盒、限制性内切酶、T4连接酶等均购自TaKaRa公司。福氏佐剂,PEG(Mr4000),
HAT,HRP标记的羊抗鼠 IgG及鼠抗体 IgG亚类 ELISA试剂盒等均购自 Sigma公司。SupersignalWestPico
ChemiluminescentSubstrateKits购自 PIERCE公司。硝酸纤维膜购自辛创公司。RPMI1640培养基为 GIBCO
公司产品,胎牛血清为 PAA公司产品。其他试剂均为进口分装或国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 引物的设计与合成 用 PrimerPremier5.00软件包设计用于扩增 DEN2E1-1362(去羧基端)序列的
上下游引物 M1和 M2。M1:5-GCGAGATCTATGCGTTGCATAGGAAT-3(斜体下划线为 BglI酶切位点);
M2:5-ATGCTCGAGAGTCCATGAGACCCCACTG-3(斜体下划线为 XhoI酶切位点)。上述引物由上海英骏生
物技术有限公司合成。
1.2.2 DEN2E基因的 PCR扩增和回收 以 pSV-ME为模板用 PCR法扩增目的基因 DEN2E1-1362。1.2%
琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物,PCR产物纯化试剂盒回收纯化特异的 DEN2E1-1362基因片段。
1.2.3 表达载体构建 用 PCR产物纯化试剂盒纯化目的基因片段,经 BglI、XhoI双酶切后再次纯化;
pET-32a经 BamHI、XhoLI双酶切后纯化。连接酶切纯化后的目的基因与 pET-32a并转化感受态菌 E.coli
JM109。鉴定后提取质粒 pET-32a-E,转化表达宿主菌 E.coliBL21,获得含有连接 DEN2E的 pET-32a(+)质
粒的 BL21表达菌(BL21/pET-32a/DEN2E)。
1.2.4 重组蛋白的表达与纯化 挑取阳性 BL21克隆,IPTG诱导表达。分别进行不同诱导时间、诱导温度、
诱导培养体系及不同 IPTG浓度诱导实验,确立最佳的诱导表达条件后,诱导表达目的蛋白,用 Ni-NTA琼
脂糖树脂进行纯化,纯化方法按试剂盒说明书进行,SDS-PAGE电泳[3]对表达产物进行鉴定。
1.2.5 免疫印迹分析 取纯化后目的蛋白经 l0%SDS-PAGE电泳分离后转移至 NC膜上。用含 10%脱脂奶
粉 PBS室温封闭 2h后,加入按 1:100封闭液稀释的抗 DEN2血清为一抗,室温封闭 2h,洗膜后加入相应的
HRP标记的羊抗鼠 IgG,室温作用 1h,洗膜后,ECL显色。
1.2.6 BALB/c小鼠的免疫 用 Bradford法测定重组蛋白 pET-32a-E的浓度,与等体积的福氏完全佐剂混
合至完全乳化,对 BALB/c小鼠腋下,腹股沟及背部皮下多点注射,剂量为每只 100μg,进行基础免疫。每隔
2周以福氏不完全佐剂加 100μg重组蛋白溶液间加强免疫 3次,末次免疫后 2周即在追加免疫前先用间
接 ELISA测定免疫小鼠的血清抗体滴度,当达到 1∶5×105后,取相同的抗原量尾静脉注射追加免疫。
1.2.7 杂交瘤细胞的建立 在加强免疫后的第 3d,取免疫小鼠的脾细胞与 Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞按常规
方法融合,用间接 ELISA法筛选能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞,以 TMB为底物,测定其 A450值,其 A450
值大于阴性(以 RPMI1640培养液为阴性对照)值 2.1倍以上为阳性。通过有限稀释法克隆化使杂交瘤细胞
100%阳性,经 3次克隆化培养,逐级扩大培养冻存。
1.2.8 杂交瘤细胞的染色体计数 将杂交瘤细胞培养至对数生长期,加入终浓度为 0.08mg/L的秋水仙
素,继续培养 6h后,用 0.075mol/L的 KC1低渗处理 30min,甲醇:冰醋酸为 3∶1的固定液固定 3次,加入少
量固定液混匀,滴片,Gimsa染色,油镜下观察分析细胞分裂中期的染色体核型,并进行显微摄像。
1.2.9 mAb的免疫反应特异性鉴定 (1)采用间接 ELISA方法:用重组蛋白 pET-32a-E、pET-32a诱导表达
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蛋白和 BL21菌体蛋白溶液分别包被 96孔酶标板(10mg/L)。一抗为 pET-32a-E阳性杂交瘤细胞培养上清,
二抗为 HRP标记的羊抗鼠 IgG,用 TMB显色,于波长 450nm测定 A450值。(2)用 Westernblot分析:将重组
蛋白 pET-32a-E、pET-32a诱导表达蛋白和 BL21菌液进行 10%SDS-PAGE电泳后,转移至 NC膜上,用 50g/
L的脱脂奶粉 PBS4℃封闭过夜,用 ELISA筛选获得的抗 pET-32a-E特异性 mAb细胞培养上清为一抗,以
1:100的比例用 PBS稀释,37℃孵育 2h。二抗为 HRP标记的羊抗鼠 IgG,1:5000稀释于 PBS,37℃孵育 2h。
ECL显色成像。
1.2.10 mAbIg亚类的鉴定 按照试剂盒说明书进行。
2 结果
2.1 目的基因的扩增和克隆
将获得的 PCR产物用 1.5%琼脂糖凝胶电泳,显示在 1362bp处有一特异条带,与预计的目的基因大
小相等。将该片段纯化后连接于 pET-32a载体,酶切和 PCR鉴定为阳性的克隆进行测序,测序结果表明
DEN2E1-1362基因已成功克隆于 pET-32a(+)(图 1)。
2.2 目的蛋白的表达及表达产物的纯化
经 10%SDS-PAGE检测及考马斯亮蓝染色发现带有重组质粒的工程菌表达产物中有一相对分子量约
为 70kD的新蛋白区带,与推测蛋白分子量大小相符。经 Ni2+树脂柱纯化后的蛋白见图 2。
图 2 pET32-a-E蛋白的表达纯化图 1 DEN2E1-1362基因片段的扩增及鉴定
1.PCR扩增 E1-1362片段 2.pET32-a-E1-
1362扩增 E1-1362片段 3.100bpMarker
1.蛋白分子量 Marker 2.pET32-a-E蛋白
2.3 免疫印迹鉴定
用抗 DEN2血清分别与转至膜上的重组蛋白 pET-32a-E、pET-32a诱导表达蛋白、BL21菌体蛋白反应.
WesternBlot结果显示抗 DEN2血清能与重组蛋白 pET-32a-E在预期的位置发生反应。ECL显色,结果表
明,重组蛋白有良好的免疫反应性(图 3)。
2.4 杂交瘤细胞株的建立
细胞融合后,经间接 ELISA筛选获得能分泌抗 DEN2E的 mAb的细胞株共 124株,经 3次连续克隆化
及间接 ELISA进行特异性筛选后得到了 1株可分泌抗 DEN2E的特异性 mAb的细胞株 (7C7)。将杂交瘤
细胞连续 3个月传代,该细胞株仍能稳定分泌特异性的 mAb。
2.5 杂交瘤细胞染色体计数
7C7细胞核型分析染色体数目接近 2种亲本细胞的染色体数目之和,即小鼠脾细胞的染色体数目(40
条)与 Sp2/O骨髓瘤细胞染色体数目(2n=54-64)之和。7C7株的染色体众数为 99条。显微镜下观察,这株
细胞的染色体核型主要为端着丝粒,少数为中着丝粒。
2.6 杂交瘤细胞培养上清 Ig亚类鉴定
用细胞上清与羊抗鼠 Ig及其亚类进行 ELISA间接反应,结果显示 mAb属于 IgG1亚类。
陶萍等:抗登革病毒2型E蛋白单克隆抗体的制备和生物学特性的鉴定 147
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2.7 mAb的特异性鉴定
经过间接 ELISA和 Westernblot检测,所得 mAb与 pET-32a转化菌体蛋白以及 BL21菌体蛋白之间均
无交叉免疫反应,说明所得的 mAb特异性良好(图 4)。
图 3 重组蛋白 pET-32a-E的免疫印迹鉴定
1.pET-32a诱导表达蛋白 2.BL21菌体蛋白
3.重组蛋白 pET-32a-E
图 4 DEN2EmAb特异性的 WesterBlot分析
1.pET-32a诱导表达蛋白 2.BL21菌体蛋白
3.pET-32a-E重组蛋白
3 讨论
登革病毒的编码蛋白中,E蛋白是登革病毒最大的结构蛋白和主要包膜糖蛋白,包括 A、B和 C3个非
重叠的抗原结构域,含有中和抗原表位,能诱导机体产生中和抗体,是 DEN吸附靶细胞、致病及诱导免疫
保护的关键性蛋白,其结构和功能的深入研究对阐明 DEN的致病机制及疫苗研制均有重要意义[4]。
目前,对于登革病毒的检测方法包括病毒的分离培养和鉴定、分子生物学诊断、血清学诊断。其中,检
测 IgM和(或)IgG的 ELISA捕捉法、包被抗原的间接 ELISA法,和血凝抑制试验(HI)是最常用的登革感染
检测方法。
免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种免疫标记技术。胶体金标记技术
标记物的制备简便,方法敏感、特异,不需要使用放射性同位素及有潜在致癌物质的酶显色底物,不需要荧
光显微镜,操作简便,应用范围广,适用于快速筛查。为此,制备了 DEN2E蛋白特异的 mAb,作为制备其特
异的胶体金试纸条的基础。
本研究中扩增了登革 2型病毒 E基因去羧基端序列,并构建了 pET-32a-E重组子,在 E.coliBL21中诱
导表达。获得的融合表达蛋白用杂交瘤技术制备并筛选针对 DEN2E的特异性抗体。利用 Westenblot检
测,所得抗体仅与重组 DEN2E蛋白反应,说明所得 mAb特异性良好。下一步将研究 mAb是否与其它黄病
毒属病毒血清产生交叉反应,并为制备快速检测 DEN2E蛋白的胶体金试剂盒提供基础。
参考 文献
1 GoodarziMO,KorenmanSG.FertilSteril,2003,80(2):255~8.
2 KatrinCL,DavidWV,DouglasMW,etal.JournalofVirology,1999,6:4738～4747.
3 F.奥斯伯.R布伦特,RE金斯顿.精编分子生物学实验指南[M].北京:科学出版社,2001,39~40.
4 HalsteadSB.JExpMed,1997,146:210.
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