全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 10期
易错 PCR技术提高黑曲霉 N25植酸酶活力的研究
冯慧玲 李春梅 吴振芳 陈惠
(四川农业大学生命科学与理学院,雅安 625014)
摘 要: 利用易错 PCR技术对黑曲霉 (A sp erg illus niger ) N25的植酸酶基因 phyA进行定向进化研究,突变基因产物重组
于表达载体 pET32a( + )中,并导入大肠杆菌 BL21 ( DE3)构建突变体文库,经筛选获得了最佳突变菌株 pET32aphyA ep, 其植
酸酶活力比出发酶提高了 418%。突变酶的酶学性质研究发现, 与野生酶相比, 它的热稳定性, 最适温度和最适 pH 值无显
著变化。
关键词: 植酸酶 定向进化 易错 PCR 酶活力
Increasing Activity of Phytase from Asperg illus niger N25
by Errorprone PCR
FengHu iling L i Chunm ei Wu Zhenfang ChenH ui
(Co llege of Biology and Science, Sichuan Agricultural University, Yaan 625014)
Abstrac:t Random mutagenes is on A sperg illus niger N25 phy tase gene phyA was conducted by us ing erro rprone PCR strategy.
The erro rprone PCR produc tw as recomb inated in expression vec to r pET32a ( + ) , and introducted intoB acillu s coli BL21 ( DE3),
constructed mu tant library. W e have obtained the bestm utant stra in pET32aphyAep after screen ing, wh ich has 41 8% h ighe r phytase
enzyme ac tiv ity than or ig ina l stra in. The results show ed that the therm ostab ility, the optim um tem perature and the optimum pH va lue
d id no t have the sign ificant change comparew ith the w ild phytase.
Key words: Phy tase D irec ted evo lution E rrorprone PCR Enzym e activ ity
收稿日期: 20100512
基金项目:国家自然科学基金 ( 30671530 )
作者简介:冯慧玲,女,本科在读,研究方向:生物科学酶工程; Em ai:l 297983129@ 99. com
通讯作者:陈惠,女,教授,研究方向: 微生物酶工程研究; Em ai:l ch en62hu@i yah oo. com. cn
植酸及其盐类是谷物中磷的主要贮藏形式,单
胃动物因体内缺乏能分解植酸的酶而难以利用食物
中的植酸。植酸酶 (肌醇六磷酸酶, Phytase)能将植
酸水解为肌醇和磷酸, 提高单胃动物对植物性饲料
中磷的利用率,降低粪便中磷的含量,还可降低植酸
的抗营养作用 [ 1- 3]。目前,植酸酶主要应用于饲料
工业, 制粒过程需要经过高温加热,致使多数天然酶
活力急剧下降,不能满足工业上的需求,限制了植酸
酶的进一步推广应用。所以,进一步筛选耐热性好
或酶活力高的酶及探索更好的提高酶活力和热稳定
性的方法仍是研究的重点。
定向进化 ( d irected evo lut ion)是酶分子改造的
一种新策略,它主要通过体外模拟自然进化机制,利
用基因随机突变、重组和定向筛选技术,使进化过程
朝着人们需要的方向发展。易错 PCR技术是最早
最成熟的一种定向进化策略 [ 4]。本研究拟通过运
用易错 PCR技术对黑曲霉 (Asp erg illus n iger) N25的
植酸酶基因 phyA进行定向进化研究, 以期获得酶
活力或热稳定性提高及其它酶学性质有所改善的突
变酶,为该酶的定向改造和工业应用奠定基础。
1 材料与方法
11 材料
111 菌株和质粒 大肠杆菌 BL21 ( DE3)菌株、
质粒 pUC18phyA和 pET32a ( + )均为本实验室
保存。
112 分子生物学与生化试剂 限制性内切酶、T4
DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、dNTP、氨苄青霉素
2010年第 10期 冯慧玲等:易错 PCR技术提高黑曲霉 N25植酸酶活力的研究
钠、卡那霉素钠、IPTG, PCR胶回收试剂盒及质粒提
取试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司, 引物由
上海英俊生物技术有限公司合成, 其它试剂均为进
口或国产分析纯试剂。
113 培养基 大肠杆菌培养基为 LB培养基。
12 易错 PCR扩增与突变文库的构建
根据黑曲霉 N25植酸酶基因序列 ( GenBank登
录号: AF218813)设计引物扩增植酸酶基因表达片
段。正向引物: 5 CGGGGTACCCTGGCAGTCCCCGC
CTC3 , 反 向 引 物: 5 CCGGAATTCCTAAGCAAAA
CACTCC3 ,下划线处分别为 Kpn I和 EcoR I酶切位
点,所扩增的片段为 phyA全长 14 kb。易错 PCR扩增
体系 ( 50 L)为 10 mmo l/L TrisHC l ( pH8. 3), 50
mmol /L KC,l 7 mmo l/L MgC l2, 0. 1 mmo l/L M nC l2, 0. 2
mmol /L dATP、dGTP, 1mmol /L dCTP、dTTP,引物各 0. 2
mo l/L,模板 DNA ( pUC18phyA) 100 ng, Taq DNA聚
合酶 25U。循环参数: 94! 3 m in; 94! 1 m in, 50! 1
m in, 72! 2m in( 30个循环 ); 72! 10m in。
将上述易错 PCR产物以 1% (W /V )的琼脂糖凝
胶电泳,用胶回收试剂盒纯化回收大小 14 kb左右
的条带。将纯化的 DNA和 pET32a( + )质粒分别用
Kpn ∀和 E coR ∀双酶切后进行连接并转化大肠杆
菌 BL21(DE3)菌株。通过菌落 PCR鉴定阳性克隆
子比例,命名为 pETphyA和 pETphyA ep,构建突变
体库。
13 植酸酶的表达,筛选和酶活力测定
植酸酶基因突变体库的高通量筛选采用试管筛
选法。接种以上获得的所有克隆子到装有 2 mL
LBAMP培养基的 10 mL试管中, 37! 培养 12 h,以
2%的接种量接种到装有 3mL LBAMP培养基中继
续培养 3 h后加入终浓度为 1mmo l/L的 IPTG,诱导
培养 4 h。取 1mL诱导液 4! 条件下 4 000 r /m in离
心 10m in,弃去上清。细胞裂解采用溶菌酶法,酶活
性测定在酶标板上进行, 用钒钼磷法测定植酸酶的
活力 [ 5, 6]。取 50 L裂解液于酶标板中, 加入 100
L植酸钠溶液,于 37! 水浴 30m in后,加入 100 L
颜色终止液,对照组先加颜色终止液后加植酸钠溶
液,静止 10 m in后测定酶活。设立 pETphyA和
pET32a ( + )空载体对照。
14 植酸酶基因的诱导表达
将重组大肠杆菌 pET32aphyA和筛选获得的有
益突变株接入 10 mL LBAMP培养基中, 37! 培养
12 h,以 2%的接种量接种到 20 mL新鲜 LBAMP培
养基中继续培养 3 h后加入终浓度为 1 mmo l/L的
IPTG,诱导培养 4 h, 4! 条件下 4 000 r/m in离心 10
m in, 弃去上清。
15 表达产物分析和鉴定
对诱导前和诱导后菌体沉淀进行 SDSPAGE
分析检测重组蛋白的表达情况。细胞裂解采用
溶菌酶法, 并对裂解液进行酶活性测定。 SDS
PAGE电泳检测参照 Inv itrogen公司操作手册。
植酸酶活性单位定义为在 37! 、pH 45的条件
下, 1 m in从 00051 m o l的植酸钠溶液中稀释放
出 1 nmo l无机磷所需要的植酸酶量为一个酶活
性单位 ( U )。
16 酶学性质分析
161 最适反应温度 分别将突变前后菌株诱导
表达后稀释的粗酶液分别在 30! 、37! 、45! 、
50! 、55! 、60! 和 65! 范围内进行酶促反应, 测定
酶活,得到反应的最适温度。
162 最适反应 pH 将突变前后菌株诱导表达
后稀释的粗酶液分别在 pH20、pH26、pH36、
pH 46、pH46、pH 66和 pH7. 6的乙酸缓冲液体系
内稀释并直接加底物, 在 37! 进行酶促反应, 测定
酶活,得到反应的最适 pH。
163 热稳定性测定 将突变前后菌株诱导表达
后稀释的粗酶液分别置于 37! 、75! 、85! 和 95!
热处理 10 m in, 在 37! 加底物植酸钠进行酶促反
应, 测定剩余酶活。
2 结果
21 基因扩增和突变体文库的构建及突变株的筛选
本研究前期通过对易错 PCR条件的优化,确定
了最佳 Mg2+ 和 Mn2 +的浓度, 分别为 7 mmo l/L和
01 mmo l/L。在优化的易错 PCR条件下扩增植酸
酶基因,扩增结果见图 1,产物经纯化双酶切后连接
到经同样酶切的表达载体 pET32a ( + )上, 转化
BL21超级感受态细胞。获得转化子约 3 000株, 所
有转化子构成突变体文库。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 10期
M. DNA MarkerIII; 1.易错 PCR扩增产物
图 1 易错 PCR扩增结果电泳图
经过多轮筛选及酶活力测定,表明黑曲霉 N25植
酸酶在大肠杆菌 BL21中得到了很好的表达, 同时筛
选得到一株最佳植酸酶突变株。通过对 pETphyA和
易错突变株 pETphyAep裂解液用钼钒酸铵法进行酶
活力测定, 1 mL pETphyA菌体裂解液中酶活力为
1038U,同条件突变菌株 pETphyAep酶活力为 147. 2
U。结果表明,通过易错 PCR对植酸酶进行改造, 获
得酶活力提高了 418%的突变菌株。
22 重组植酸酶的诱导表达
将筛选获得的突变菌株和原始菌株分别进行培
养,利用 IPTG诱导重组基因表达, 结果见图 2。结
果表明,植酸酶 phyA在大肠杆菌中得到了融合表
达,分子量为 7245 kD,与预期结果一致。
1, 10.蛋白质分子量标准; 25.被 IPTG诱导的重组质
粒 pETphyA; 6, 7.空质粒 pET32a; 8, 9.未被 IPTG诱
导的重组质粒 pETphyA和空质粒
图 2 植酸酶基因表达产物的 SDSPAGE分析
23 酶学性质分析
231 最适反应温度 在不同温度下测定酶活力,
结果见图 3, 由图可知突变前后植酸酶的最适温度
未发生改变,酶的最适反应温度为 55! 。
图 3 植酸酶最适反应温度曲线
232 最适 pH 在 pH20- 66范围内测定酶活
力,结果见图 4, 由图可知该酶在 pH36- 66范围
内均具较高的酶活性, 其最适反应 pH为 46, 突变
前后最适 pH未发生较大改变。
图 4 植酸酶最适反应 pH曲线
233 热稳定性 粗酶液分别置于 37! 、75! 、
85! 和 95! 热处理 10 m in测酶活,结果见图 5, 由
图可知该酶在高温处理后酶活残留 60%- 44%, 突
变前后热稳定性变化趋势一致。
3 讨论
定向进化可行性的一个前提就是合理的控制突
变文库的大小。易错 PCR过程中突变率一般为 1. 5
- 5个碱基每个基因 [ 7, 8] , 易错 PCR主要通过调整
Mn
2+和 Mg2+的浓度, 和使用不平衡的四种碱基浓
度来控制突变频率。MnC l2的作用是降低聚合酶对
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2010年第 10期 冯慧玲等:易错 PCR技术提高黑曲霉 N25植酸酶活力的研究
图 5 植酸酶热稳定性曲线图
模板的特异性,其浓度的增加是为了稳定非互补的
碱基对。所以, 在摸索适合的易错 PCR条件时, 条
件的变化幅度要尽量小一些,在本试验中确定的浓
度为 0. 1 mmo l/L M nC l2和 7mmo l/L M gC l2。
定向进化是改造蛋白质分子的一种有效的新策
略,但其构建的文库非常大, 同时在目的酶筛选中,
至关重要的是找到高灵敏度、高选择性和高通量的
筛选方法。本研究采用试管筛选与摇瓶筛选相结合
对高活力菌株进行定向选择,试管筛选既节约资源
又方便快捷,是实验室定向进化筛选可行的方法,通
过初筛后进行摇瓶培养复筛,最终确定最佳突变株。
另外, 钒钼磷法测定植酸酶活力与分光光度计和酶
标仪结合后可以批量的对各克隆子的酶活进行定量
的比较测定,且准确可靠 [ 9, 10]。
植酸酶主要应用于饲料加工行业,制粒温度一
般为 65- 90! , 因此为了满足工业要求, 我们需要
通过蛋白质工程等手段对其进行改造, 得到酶活力
或者热稳定性显著提高的突变株。定向进化技术成
为改造酶分子的一种有效策略,在农业、工业和医药
等领域都展现了其巨大的潜力。黄瑛等 [ 11]通过易
错 PCR方法使突变后的短小芽孢杆菌 YZ02脂肪酶
的比活力比野生型脂肪酶提高了 131倍。孔荣
等 [ 12]通过易错 PCR技术对 D海因酶进行定向进
化,进化酶催化底物海因水解的活性为亲本重组酶
的 13倍, 催化底物对羟基苯海因水解的活性为亲
本重组酶的 24倍。 Jones等 [ 13 ]结合易错 PCR和
DNA改组技术对芽孢杆菌 TS25的 淀粉酶进行
改造, 获得了在低 pH环境下 ( pH45)热稳定性提
高大于 10! 的突变体。K im[ 14]通过连续易错和交
错延伸 PCR方法定向进化来自于假单胞菌属的酯
酶,使得催化活力提高了 12倍,且进化酶更能耐受
更高的底物浓度。Mchunu等 [ 15]通过易错 PCR技
术提高了茶毒菌属木聚糖酶耐碱能力,在 pH 10. 0,
60! 环境下保温 1 h后, 变异体 NC38的剩余酶活
力为 84%,而野生酶在同样条件下的剩余酶活力仅
为 22%。本试验通过易错 PCR技术对黑曲霉 N25
植酸酶基因进行定向改造, 得到了酶活力有较大幅
度提高的突变体, 为进一步通过定向进化改造植酸
酶奠定了基础。
参 考 文 献
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#植物遗传资源学报 ∃征订启事
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