全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 4期
荔枝 DNA提取及 RAPD扩增条件优化
尤有利1 王江波 2 施维属 2 潘东明 2
( 1福建永春县农业技术推广站,泉州 362600; 2福建农林大学园艺学院福建农林大学园艺产品贮运保鲜研究所,福州 350002)
摘 要: 为应用 RAPD技术开展对荔枝种质资源的分析,以 S43 ( GTCGCCGTCA )为引物, 通过试验设计, 分别研究了退
火温度、模板浓度、引物浓度、dNTP浓度、Taq DNA聚合酶用量对荔枝 RAPDPCR反应的影响。建立并优化了适宜荔枝 RAPD
分析的扩增体系: 20 L的反应体系, 30 ng的模板 DNA度, 0. 25m ol/L RAPD引物、1. 0 U Taq DNA聚合酶, 0. 2 m o l/L dNTP
为荔枝适宜的 RAPDPCR扩增条件。
关键词: 荔枝 RAPD 优化 PCR
Extration ofGenom ic DNA ofLitchi chinensis and
Optim izationof the RAPD Reaction System
You Youli
1
W ang Jiangbo
2
ShiW eishu
2
Pan Dongm ing
2
(
1
Yongchun AgroT echinical Ex tension Station, Q uanzhou 362600; 2College of H or ticulture,
Fuj ian Agriculture and Forestry University, Institute of S torage Science and T echnology of
H orticultural Products, Fujian Agr iculture and Forestry University, Fuzhou 350002)
Abstrac:t In order to use RAPD m arkers to ana lyze the resources in Litchi, the annealing tem pera ture, tem plate, concentration of
pr im er, dNTP and theTaq DNA po lym erase dosage on RAPDPCR applications w ere tested to dete rm ine the ir optima l leve l. B esides,
the fo llow ing optim a l reaction sy stem fo rRAPD ana ly sis inL itchiwe re estab lished, inc luding PCR reaction vo lum e of 20L, 30 ng DNA
tem plate, 0. 25 mo l/L RAPD prim er, 1. 0 U Taq DNA po lym erase, and 0. 2 m o l/L dNTP in each reac tion system of 20 L.
Key words: L itchi ch inensis Sonn. RAPD Optim ize PCR
收稿日期: 20091204
基金项目:泉州市科技计划项目 ( 2009N62 ),我国台湾农业新品种、新技术引进创新研究与示范项目 ( 2007BAD07B00) ,我国台湾果树新品种
与品质控制新技术引进创新研究项目 ( 2007BAD07B01)
作者简介:尤有利,男,农艺师,从事柑桔、荔枝等园艺作物栽培管理技术研发与推广; Em ai:l yyll77@ 163. com
通讯作者:潘东明,男,教授,博士生导师,从事园艺产品采后贮运保鲜研究; Em ai:l pdm666@ 126. com
荔枝 ( L itchi ch inensis Sonn. )为亚热带常绿乔
木,是我国华南名、特、优亚热带果树,因其色、香、味
均为国内外人士所喜爱, 被称为中华之珍品。中国
是荔枝的发源地, 种质资源丰富, 福建作为其中的
一个重要产区,主栽品种较多, 目前主要有兰竹、黑
叶、元红、陈紫、状元红、下番枝、元香等。荔枝在国
内外市场上声誉很高, 在对外贸易中占有一定的位
置,福建省的荔枝生产规模越来越大。然而,在荔枝
的生产中,仍存在较多问题, 如丰产、稳产且又优质
的品种欠缺, 成熟期过于集中, 适宜罐藏的品种不
多,抗寒性不强等。这些问题严重影响福建省荔枝
生产的进一步发展。因此, 荔枝的选育工作刻不
容缓。
在培育荔枝新品种的过程中,目前最常用的是
实生选种和芽变选种。由于对现有荔枝种质的遗传
背景研究较少,加上杂交育种周期长,荔枝杂交育种
一直很少被采用。而要想从更深层次上对荔枝进行
种质分析, 则需要应用 DNA分子标记进行分子评
价。RAPD ( random amplified po lymorphic DNA )标记
是一种操作简单、快捷且成本经济的分子标记技术。
它是由 W illiam s和 W elsh[ 1, 2] 领导的研究小组于
1990年同时分别建立起来的,是一种基于 PCR的技
术, 以一个 (有时用两个 )随机的寡核营酸 (一般 8-
10个碱基 )为引物,对基因组 DNA进行非定点的扩
2010年第 4期 尤有利等:荔枝 DNA提取及 RAPD扩增条件优化
增,从而获得 DNA的多态性。其特点包括,设计引
物不需要知道序列信息, 用一个引物就可扩增出许
多片段 (一般一个引物可扩增 6- 12条片段 ) , 因此
RAPD是一种快捷的遗传多样性检测方法。技术简
单,安全性高, 因为 RAPD分析不涉及 Southern杂
交、放射自显影等复杂或存在放射污染的技术。
RAPD分析只需少量 DNA样品, 随机引物可在许多
公司买到, 价格不高。RAPD标记一般是显性遗传
(极少数是共显性遗传的 ) ,不能鉴别杂合子和纯合
子。此外,在 PCR反应中条件的变化会引起一些扩
增产物的改变, 因此重复性不太高。由于凝胶电泳
只能区分分子量大小不同的片段, 而不能区分碱基
序列不同但大小相同的片段,因此存在共迁移问题,
即在不同个体中出现相同分子量的带后, 并不能保
证这些个体拥有同一条 (同源 ) DNA片段。
RAPD是较早应用在植物遗传多样性研究中的
一种分子标记。许多研究 [ 3- 6 ]证明, RAPD技术简
便多态性高,在植物品种鉴定以及种质的收集、分析
与物种起源进化研究中是一种有效的手段。
RAPD技术虽然具有重复性高、原理简单的优
点,但 PCR条件不同, 会出现不同的扩增结果。为
了确保 RAPD分析结果的可靠性和重复性, 本试验
以福建农林大学校园的 元红 !荔枝的新梢嫩叶所
提取的总 DNA为材料,比较研究了影响 RAPDPCR
反应的多个因素,建立了荔枝 RAPDPCR最佳反应
体系, 为 RAPD技术应用于荔枝种质资源相关方面
的研究奠定了良好的基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
DNA提取样品取自永春县岵山镇。引物为上
海生工公司 Primer Name: S43, dNTP为 Prom ega公
司产品, Taq酶和 DNA M arker为 TaK aRa公司产品,
其余为国产分析纯试剂。
1. 2 DNA的提取
( 1)称取剔除主叶脉的新鲜幼嫩叶片 1. 0 g, 加
入 0. 1 g PVPP于冰冷的研钵中用液氮研磨成细粉,
装入 10mL离心管中; ( 2)迅速加入 65∀ 预热的 CTAB
Buffer( 100 mmol /L T risHC;l 20 mmol /L EDTA; 1. 4
mo l/LN aC l) 4mL,加入 100 L 巯基乙醇,混匀,在
65∀ 水浴锅中裂解 45m in,期间不断摇匀; ( 3)加入
等体积氯仿 -异戊醇 ( 24#1)抽提, 上下颠倒混匀,
常温 12 000 ∃ g离心 10 m in,取上清; ( 4)加入等体
积酚 -氯仿 - 异戊醇 ( 25#24#1) 12 000 ∃ g离心 10
m in, 取上清;再重复步骤 ( 3); ( 5)加入等体积的 -
20∀ 预冷的异丙醇, 轻轻摇动, 使其充分混匀, 可见
絮状沉淀, 即为 DNA沉淀, 用牙签挑出, 装入 0. 5
mL离心管; ( 6)用 75%乙醇洗两遍, 吹干, 加入 200
L TE Buffer ( 10 mmo l /L TrisHC ,l pH8. 0的 10
mmo l/L EDTA)溶解,放置在 - 20∀ 冰箱中保存。
1. 3 扩增反应程序
RAPD反应体系的基本条件: 采用 20 L PCR
反应体系, PCR反应在热循环仪 B iometra Tg radient
上进行, 94∀ 预变性 4 m in; 94∀ 变性 1 m in; 38∀ 复
性 90 s; 72∀ 延伸 2 m in; 循环 45次; 然后 72∀ 延伸
7m in;最后置 4∀ 保存,电泳检测。
1. 4 RAPD反应体系的优化
针对模板 ( 20 ng /L)、dNTP ( 10 mmo l/L )、Taq
酶 ( 5 U /L )与引物 ( 10 mo l/L ) 4种因素,选用 L9
( 3
4
)设计 PCR各反应成分的因素水平的正交
表 (表 1)。
表 1 荔枝 RAPD正交试验设计
序号 DNA
( L)
dNTP
(L)
T aq酶
( L)
引物
( L )
Buffer
( L)
H2O
( L)
1 1. 5 0. 4 0. 15 1. 0 2 14. 95
2 1. 5 0. 4 0. 20 0. 5 2 14. 40
3 1. 5 0. 4 0. 25 1. 5 2 13. 85
4 2. 0 0. 7 0. 20 1. 5 2 13. 10
5 2. 0 0. 7 0. 25 1. 0 2 14. 05
6 2. 0 0. 7 0. 15 0. 5 2 13. 65
7 2. 5 1. 0 0. 25 0. 5 2 12. 75
8 2. 5 1. 0 0. 15 1. 5 2 12. 35
9 2. 5 1. 0 0. 20 1. 0 2 13. 30
2 结果与分析
2. 1 DNA检测结果
用 1%琼脂糖凝胶电泳, 检测其完整性, 从图 1
的结果可以看到一条整齐的条带, 无弥散的荧光出
现,加样孔清晰,表明所提取的 DNA样品较纯,基本
没有多糖等杂质,无降解和 RNA污染。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 4期
M. 2 000 bpm arker; 1- 7.荔枝叶样品
图 1 荔枝 DNA电泳图
2. 2 RAPD反应体系的优化结果
根据正交优化结果如图 2所示。图 2中的第
2、4、5、6、9条带比较清晰,并且条带数较多, 所以从
这几条条带中进行筛选。
1- 9.不同体系的 RAPD扩增产物; M. 2 000 bpDNA Marker
图 2 荔枝 RAPD正交试验设计的电泳结果
2. 2. 1 引物浓度对 RAPD反应的影响 引物浓度
偏高或偏低所得到的 PCR结果均不可靠。引物浓
度偏高会引起错配和非特异性产物扩增, 且可增加
引物之间形成二聚体的几率;浓度过低则无法测出
所有 RAPD位点 [ 7- 12 ]。图 2中的第 2、6泳道均为
0. 5 L, 而第 1、5泳道均为 1. 0 L, 出现模糊的条
带,所以引物的合适范围可定为 0. 5 L。本研究选
定引物量为 0. 5 L,得终浓度为 0. 25 mo l/L。
2. 2. 2 dNTP浓度对 RAPD反应的影响 dNTP是
RAPDPCR反应的原料, dNTP浓度过高, 会导致
PCR错配,从而使扩增出现非特异性扩增; 过低影
响合成效率,甚至会因过早的消耗而使产物单链化,
影响扩增效果 [ 8]。结合图 2中的第 1、2泳道为 0. 4
L,第 6泳道为 0. 7 L, dNTP的合适范围可初步定
为 0. 4- 0. 7 L,从节约药品考虑,本研究选定 0. 4
L,为 0. 20 mol/L。
2. 2. 3 Taq酶对 RAPD反应的影响 Taq酶使用量
直接影响扩增反应的成功与否, 使用高浓度的 Taq
酶不仅提高了成本,而且也容易产生非特异扩增产
物;而 Taq酶浓度过低时,则会导致产物的合成效率
下降。从图 2中发现第 1泳道条带较少,第 2泳道
条带较多且清晰,分析可能是 Taq酶的浓度太低, 所
以 Taq酶定为 0. 20 L( 1. 0 U )。
2. 2. 4 模板 DNA浓度对 RAPD反应的影响 PCR
反应中对模板 DNA浓度要求的范围通常较宽,但最
佳的 DNA模板浓度范围取决于研究的物种类群以
及 DNA模板纯度。本研究对不同量的模板 DNA分
别进行了 PCR扩增, 发现 1. 5 L ( 30 ng)的模板
DNA浓度用于荔枝 RAPDPCR扩增为最佳选择。
2. 3 优化反应体系的确定
综合上述研究结果, 最终确定在终体积 20 L
的反应体系中模板 1. 5 L( 30 ng )、dNTP为 0. 4 L
( 0. 20 mo l/L )、Taq酶为 0. 20 L( 1. 0 U )、引物为
0. 5 L( 0. 25 mo l/L )。利用此优化系统, 在 38∀
的退火温度下,对荔枝进行 RAPDPCR扩增得到清
晰、稳定的 RAPD谱带, 并具有较多条带 (图 3)。
图 3 引物 S209( CACCCCTGAG)对荔枝
6个样品的 RAPD扩增结果
3 讨论
荔枝的叶片中含有丰富的多糖、色素及酚类物
质,因此提取荔枝叶片中的基因组总 DNA较难。陈
义挺 [ 13]的 SDS法虽能较好地提取枇杷基因组总
DNA, 但步骤繁杂,耗时长, 效率低;李明芳等 [ 14]的
改良 CTAB法虽能有效提取荔枝基因组总 DNA, 但
试验过程中需过夜处理, 耗时长。姚庆荣等 [ 15]的
CTAB法所提取的荔枝基因组总 DNA虽无降解和
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2010年第 4期 尤有利等:荔枝 DNA提取及 RAPD扩增条件优化
RNA污染, 但含有少量多糖等杂质, 且耗时较长。
钟凤林 [ 16]的改良 CTAB法所提取的龙眼基因组总
DNA样品较纯, 基本没有多糖等杂质, 无降解和
RNA污染,且试验步骤简短,成本低、效率高。本试
验在参考以上研究的基础上,结合荔枝特性,并加以
修改, 得到适合荔枝基因组 DNA提取的高效快速
方法。
与微卫星 ( SSR )相比, RAPD不要求已知基因
组序列信息,大大减少多态分析的前期工作,引物具
有广泛的通用性。尽管 RAPD是一种显性遗传标
记,不能检测显性纯合基因型和杂合基因型,但作为
种或品种鉴定的分子标记,并不受其影响。
在 RAPD反应体系中, PCR扩增结果除了不受
退火温度影响外,受到很多其他因素的影响,如模板
质量浓度与纯度、TaqDNA聚合酶用量、引物浓度、
dNTP浓度等。为了得到较高的稳定性、可重复性和
可靠性的试验结果。本研究对模板 ( 20 ng /L )、
dNTP( 10 mmo l/L )、Taq 酶 ( 5 U /L )与引物 ( 10
mo l/L ) 4种因素进行了正交试验设计,可同时研究
几个因素几个水平的影响, 比单一因素更有效地分
析不同因素的互相作用。用筛选出的荔枝最适宜的
RAPDPCR反应体系, 以 S209为引物, 对荔枝 6个
样品进行 RAPDPCR扩增, 得到清晰、多态性高的
RAPD谱带。并具有较好的重复性。
本研究经试验确定新的 RAPD反应体系可以
为荔枝的 RAPD试验的后续工作提供参考, 特别
是可为运用 RAPD技术进行荔枝遗传多样性研
究奠定一定的基础。此外, 对探讨影响 RAPD反
应的影响因子及进行有关试验研究具有一定的
参考价值。
参 考 文 献
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