全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·技术与方法· 2008年第1期
收稿日期:2007-09-25
基金项目:国家质量监督检验检疫总局科研项目(2004QK36);留学人员科技活动项目(2006);浙江省新苗人才计划项目(2007G60G2080005)
作者简介:徐伟(1982-),男,硕士研究生,研究方向:食品分子生物学检测技术研究
通讯作者:李素芳,Tel:0571-86875627,Email:lsf@cjlu.edu.cn
单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes
以下简称单增李斯特菌)是危害公共卫生和食品行
业的一种重要人畜共患病致病菌。动物性食品是其
主要传播源,该菌在 4℃仍可以生长,对冷冻产品
和速食食品构成潜在威胁。单增李斯特菌可引起脑
膜炎、败血症和流产,孕妇、新生儿、老年人和免疫
缺陷病人是易感人群。食源性李斯特菌病发病率虽
然不高,但死亡率有时达 20%~30%。我国的香港、
福建、辽宁、云南等地有因该菌引发疾病而住院和
死亡的报道。
食品中单增李斯特菌传统的检测方法主要通
过选择性增菌培养,分离培养后的可疑菌落进行生
化反应,溶血实验,协同溶血实验(CAMP),动物实
验,典型运动等鉴定,被确定为李斯特菌后再进行
血清型分析。增菌法耗时长,灵敏度低,无法满足现
代食品工业中需要快速、灵敏和准确的检测技术。
随着分子生物学的飞速发展,PCR、核酸杂交、基因
芯片等技术被应用到检测单增李斯特菌中。本文就
单增李斯特菌应用于 PCR检测的特异性鉴别基
因、模板 DNA的制备方法及多重 PCR、巢式 PCR、
反转录 PCR与定量 PCR等技术进行综述。
1 单增李斯特菌特异性鉴别基因
单增李斯特菌属于李斯特菌属(Listeriaspp.),
与其同属的还包括英诺克李斯特菌(L.innocua),绵
羊李斯特菌(L.ivanovi),西尔李斯特菌(L.seeligeri),
威尔斯李斯特菌 (L.weshimeri),格氏李斯特菌(L.
grayi)和默氏李斯特菌(L.murayi)等 6个种。在李
斯特属的 7个种中目前普遍认为只有单增李斯特
菌可引起人畜共患李斯特菌病(listeriosis)。由于单
增李斯特菌的致病性与其产生的多个毒力因子密
PCR技术检测单核细胞增生李斯特氏菌研究进展
徐伟 李素芳 刘军
(中国计量学院生命科学学院,杭州 310018)
摘 要: 单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)是危害公共卫生和食品行业的一种重要人畜共患病致
病菌。PCR技术是近年来被广泛地运用到食源性致病菌快速检测的分子生物学方法之一。就PCR技术检测单核细胞增
生李斯特氏菌中的特异性鉴别基因、模板 DNA制备等关键因素及多重PCR、巢式 PCR、反转录 PCR与定量PCR等主
要技术进行了综述。
关键词: 单核细胞增生李斯特氏菌 PCR检测 毒力基因 模板DNA制备 多重PCR 定量PCR
TheDevelopmentofListeriamonocytogenesAssaybyPCR
XuWeiLiSufang LiuJun
(ColegeofLifeSciences,ChinaJiliangUniversity,Hangzhou310018)
Abstract: Listeriamonocytogenesisanimportantzoonoticpathogenwhichendangerspublichygieneandfood
industry.PCR isoneofthemolecularbiologicalmethodswhichhasbeenwidelyappliedforrapiddetectionfor
foodbornepathogentheseyears.ThekeyfactorsofdetectingListeriamonocytogenesbyPCR suchasthetargetgenes,
preparationoftemplateDNAaswelasthemainlyusedtechnologiessuchasMultiplexPCR,NestedPCR,RT-PCR
(reversetranscription-PCR)andQuantitativePCRwerereviewed.
Keywords: Listeriamonocytogenes PCRdetection ToxicgenesPreparationoftemplate DNA
MultiplexPCR QuantitativePCR
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第1期
切相关,因此对这些毒力因子的检测一直是研究的
重点,除此之外检测的靶基因还包括 16SRNA、肠
杆菌基因间一致序列、转录调控基因等种属特异性
强的鉴别基因。
1.1 编码单增李斯特菌溶血素O(LLO)的hly基因
单增李斯特菌溶血素 O(LLO)是单增李斯特菌
最主要的毒力因子。除了单增李斯特菌,只有绵羊
李斯特菌和西尔李斯特菌两个种有该基因。LLO帮
助单增李斯特菌从吞噬溶酶体膜逃逸到胞浆中从
而在吞噬细胞中存活。大多数 PCR都选择了针对
hly基因进行检测[1,2,17~21,23,24,28,30,31]。Aznar通过比较
8对引物筛选出针对 hly基因的引物,扩增出 702bp
片段,在 72株菌株(标准菌株和食品分离株)中特
异地扩增单增李斯特菌的 hly基因,体现出了很强
的特异性[2]。
1.2 编码肌动蛋白聚集因子的 actA基因
actA基因编码肌动蛋白聚集因子,蛋白 ActA
是细菌逃离吞噬细胞吞噬体不可缺少的蛋白。绵羊
李斯特菌和西尔李斯特菌的 actA基因与单增李斯
特菌 actA基因具有同源性,但采用 actA基因设计
的引物体现出了很强的特异性[3,4]。Zhou针对 actA
基因 3端设计了引物,在单增李斯特菌中特异地
扩增出 827bp片段,具有强特异性,并成功地应用
到了猪肉和牛奶的检测中[3]。
1.3 编码转录激活因子的 prfA基因
PrfA蛋白是一种转录激活因子,多个基因由
prfA的转录激活物协同调节。prfA基因被用来检测
单增李斯特菌[5~7],Rossmanith采用 prfA基因设计的
引物和探针在生牛奶、鲑鱼肉、奶酪中特异地检测
出了单增李斯特菌[7]。
1.4 编码侵袭性蛋白 P60的 iap基因
侵袭性蛋白 P60由 iap基因编码,与侵染有
关。虽然 iap基因在李斯特菌属的所有种中都存
在,但是其序列有种特异性。P60蛋白 N端和 C端
区域都具有高度的保守性,不同种 P60的中间区域
各具特异性,这些特异性可作为 PCR鉴定所用。一
些研究人员通过该基因序列的种间差异设计引物,
能够特异地将单增李斯特菌检测出来[8~10]。
1.5 编码内化素 B的 inlB基因
内化素 B由 inlB基因编码,InlB失活会使单增
李斯特菌毒力严重下降。Kaclikova针对 inlB基因
特异地扩增出 343bp片段并成功地应用到了各种
人工污染的食品中[11]。
1.6 编码磷脂酰肌醇特异磷脂酶 C (PI-PLC)的
plcA基因
编码磷脂酰肌醇特异性磷脂酶 C(PI-PLC)的
plcA基因位于 hly基因上游,PI-PLC在感染中起到
了重要作用。在李斯特菌属中,只有单增李斯特菌
和绵羊李斯特菌分泌 PI-PLC。Rawool针对 plcA基
因特异地检测出了单增李斯特菌[6]。
1.7 16sRNA
16sRNA为构成核糖体小亚基的重要组分,
16sRNA在分类学的种间有高度的保守性,常可用
来作为特异序列鉴定菌种属。Somer根据单增李斯
特菌 16sRNA序列设计了引物,能够在食品中特异
地将单增李斯特菌检测出来[12]。
1.8 肠杆菌基因间一致序列(ERIC)
肠杆菌基因间一致序列是存在于肠道致病菌
和多种细菌基因组 DNA中的串联重复序列,具有
极强的保守性,利用这一特点,设计引物扩增并通
过酶切获得特异性的指纹图谱来鉴定单增李斯特
菌也取得了成功[13]。
1.9 转录调控基因
Liu通过分析单增李斯特菌的基因组序列,将
一个转录调节子基因(单增李斯特菌 lmo0733)作为
鉴别基因,特异地在单增李斯特菌基因组中扩增到
453bp片段[14]。
2 PCR检测中模板 DNA的制备
模板 DNA的质量是 PCR检测的关键因素,由
于不同样品成分对 PCR有抑制作用[15~20]、样品中本
身细菌数量较少[4]及增菌过程中受到杂菌的抑制等
[5,16],近年来 PCR检测单增李斯特菌的研究重点放
在了 PCR的模板 DNA制备上。
2.1 常规法制备 DNA
常规法制备 DNA主要通过物理(煮沸、超声、
碾磨等)、化学 (表面活性剂 SDS、TritonX-100、
Tween-20,高盐等)或者酶解(溶菌酶、蛋白酶 K等)
等方法来裂解细胞释放 DNA,一些情况再用有机
溶剂(酚、氯仿)进行提取。寇运同利用高盐法提取
DNA,在冻肉中检测低限达到 4~8CFU/10g。他发现
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CTAB-酚氯仿法与高盐法对检测结果没有区别,而
直接裂解法和浓缩裂解法由于裂解不充分而导致
灵敏度降低[21]。Amagliani采用酚-氯仿法直接从全
脂牛奶中提取 DNA,检测低限达到 10CFU/ml,但缺
点是其过程加入了有毒试剂[17]。Wang将菌体重悬
于 1%TritonX-100中煮沸裂解,菌液检测低限达
到了2~20CFU,污染的食品为4~40CFU[22]。Rossmanith
通过检测生牛奶比较了多种不同的 DNA提取方法
后认为 Tween-20煮沸法比用链霉蛋白酶、溶菌酶、
蛋白酶 K处理的水煮法效果好,其简便、快速的特
点符合增菌后的 PCR检测[7]。
2.2 磁珠吸附法制备 DNA
磁珠吸附法利用磁珠吸附 DNA或者直接吸附
细胞,然后进行裂解释放 DNA,最后洗脱得到
DNA。Nogva比较了 DynabeadDNADirectI(Dynal
AS)、前者稍做修改的方法、BB(Bacterium-binding)
beads(GenpointAS)及 Dynabeadanti-Listeriabeads
(DynalAS)这四种方法,直接从脱脂牛奶和未经巴
氏消毒的全脂牛奶中提取 DNA,发现 BBbeads能
高效地提取 DNA,检测限为 6CFU/PCR;Dynabead
anti-Listeriabeads在脱脂牛奶中检测限为 6000CFU/
PCR,在未经巴氏消毒的全脂牛奶中为 60CFU/
PCR;其他两种方法效果不好[23]。Amagliani比较了酚-
氯仿法加上硅磁珠纯化、DNeasytissuekit(qiagen)、硅
磁珠分离法及 DEAE琼脂糖微球分离法直接从全
脂牛奶中提取 DNA,硅磁珠分离法与 DEAE琼脂
糖微球分离法这两种方法灵敏度高,并且有效地去
除了牛奶中蛋白质、脂肪及钙离子等 PCR抑制物,
检测限达到了 10CFU/ml[17]。
2.3 螯合树脂法制备 DNA
螯合树脂法主要利用螯合树脂能够有效地去
除非核酸物质从而得到 DNA。研究者报道了以螯
合树脂为基础提取DNA的方法[5,24]。Rodriguez-Lazaro
以 Chelex-100作为金属离子鳌合剂结合尼龙膜过
滤的方法,从肉产品中直接提取 DNA[24]。在 Chelex-
100悬液中煮沸,细胞膜破裂释放出 DNA,同时与
二价金属离子鳌合,从而避免样品中存在的金属离
子在高温和低离子强度条件下作为催化剂使 DNA
降解。
2.4 玻璃粉法制备 DNA
玻璃粉法主要通过在高盐条件下吸附 DNA的
特性来制备 DNA。Deneer比较了玻璃粉法(Glass-
milk)、酶法(溶菌酶、蛋白酶 K)及直接裂解法,发
现虽然玻璃粉法和酶法的效果相同,都能满足 PCR
要求,但玻璃粉法更加快速,同时避免了有害溶剂[1]。
3 不同 PCR技术应用于单增李斯特菌检测
新进展
聚合酶链式反应 (PolymeraseChainReaction,
PCR)是体外扩增 DNA序列的技术,一般包括变
性、退火和延伸三个阶段。PCR具有特异性强,灵敏
度高,操作简单,快速的特点。PCR技术能检测到传
统增菌方法不能检出的“活的非可培养”的单增李
斯特菌[15,25]。表 1列举了各种不同 PCR技术。
3.1 多重 PCR
多重 PCR反应中包括 2对或者 2对以上的引
物,同时扩增多个目的基因,具有快速方便,效率
高,节约试剂等优点。
3.1.1 单增李斯特菌的多毒力因子检测 单增李
斯特菌中含有多个毒力因子,如果仅以单个基因作
为检测指标,可能会由于检测的毒力因子的丢失而
造成 PCR结果为假阴性[6,9],采用多个毒力因子的
同步检测更能确认样品中单增李斯特菌的确实存
在与否[9]。“食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验方
法第二部分:多重 PCR方法”(SN/T0184.2-2006)通
过单增李斯特菌的 hly和 iap基因进行检测[26]。
3.1.2 单增李斯特菌与其他致病菌的同步检测
用多重 PCR不仅可以同步检测单增李斯特菌的多
个基因,还可以同步检测其它的致病菌。Jofre根据
单增李斯特菌 prfA和沙门氏菌 invA(侵袭素 A)基
因设计的引物进行多重 PCR检测,48h增菌后,在
烤肠中检测低限达到了 10CFU/g[5]。Kim利用大肠
杆菌 GADA/B(谷氨酸脱羧酶)、单增李斯特菌 hly
和鼠伤寒沙门氏菌 invA基因设计的引物从小麦中
同时检测出这三种致病菌[18]。Bhagwat在新鲜蔬菜
中同时检测了大肠杆菌 O157:H7、沙门氏菌和单增
李斯特菌[16]。
3.2 (巢式)套式 PCR
巢式 PCR由两轮 PCR扩增和两套引物对组
成,首先对目的 DNA进行第一次扩增,然后从第一
次的反应产物中取出少量产物作为下一次扩增的
徐伟等:PCR技术检测单核细胞增生李斯特氏菌研究进展 97
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第1期
模板,第二次的产物即为目的产物,其特点是提高
了特异性和灵敏度。马保华根据 iap基因设计了外
侧扩增引物和内侧扩增引物,分别得到 1500bp和
500bp片段,在猪肉中检测限达到了 103CFU/ml[27]。
3.3 反转录 PCR(RT-PCR)
反转录 PCR通过反转录酶将 RNA反转录成
cDNA后,再进行 PCR扩增。PCR检测单增李斯特
菌过程中,可能由于样品中存在死菌而造成 PCR
假阳性。细菌 mRNA不稳定,在细胞死亡后很快被
降解,因此通过 RT-PCR检测 mRNA可区分死活
表 1 各种 PCR技术比较
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菌[3,10,23,28]。Burtscher运用 RT-PCR检测了有机污泥
中的单增李斯特菌,但他认为经过两次增菌培养
后,原样品中的死菌不可能再引起假阳性,也就没
有必要做 RT-PCR来区别死活菌了[10]。
3.4 定量 PCR
定量 PCR主要以内参或者外参为标准,通过
对 PCR终产物的分析或者 PCR过程的监测,达到
对起始模板定量的目的。
3.4.1 竞争性 PCR 竞争性 PCR,其原理利用缺
失突变,竞争性片段比需要扩增的靶基因小一些,
提纯后的 DNA进行逐级稀释,加入恒量的竞争性
片段,PCR完成后,原始样品中的细菌数就可以通
过标准曲线比较凝胶上目标 DNA产物的信号强度
和竞争性片段的强度来得出。Choi利用竞争性
PCR,竞争性模板为缺失 EcoRI位点的 hly片段,它
可以通过 hly特异的引物扩增,在 PCR扩增后,用
EcoRI消化,通过比较两个不同片段的相对强度来
推算出初始的目标 DNA量[28]。
3.4.2 实时荧光定量 PCR 实时荧光定量 PCR是
近年来发展备受关注的 PCR技术,可即时检测荧
光强度并通过标准曲线对未知模板进行定量,没有
复杂的产物后处理过程,具有快速灵敏的优点。
许多研究者将实时荧光定量 PCR检测单增
李斯特菌运用到了各种不同样品中[4,15,19,20,23,24,29~31]。
Guilbaud用荧光定量 PCR(SYBRGreenI)检测了在
人工生物膜中的单增李斯特菌,检测低限为
600CFU/cm2,这个灵敏度比 TaqMan探针法略低,可
能是由于引物二聚体和非特异性产物的影响[31]。
Rodriguez-Lazaro用荧光定量 PCR(TaqMan)检测了
肉产品中单增李斯特菌,检测低限为 100CFU/g,他
还通过多重荧光定量 PCR同时检测了单增李斯特
菌(hly)和李斯特菌属(23SrRNA),检测低限为 30基
因组/PCR,在 5个动力学范围内可同时定量[24,29]。
Oravcova根据 actA基因建立了荧光定量 PCR检测
方法,检测低限为 100CFU/ml,其线性范围为 102~
109CFU/ml[4]。
4 存在的问题与展望
常规 PCR及其衍生出来的许多 PCR技术广泛
地应用到单增李斯特菌检测中。其中绝大数都是通
过检测 hly基因来判断单增李斯特菌存在与否,但
是在某些情况下,单独检测一个毒力因子可能是不
够的,因为可能由于环境、来源地等原因使得某一
个毒力因子丢失或者没有转录,进而不能检测出,
但是其仍然存在潜在危害。因此,同时检测多个毒
力因子是很有必要的。实际样品中单增李斯特菌数
量很少,这给检测带来了很大的难度,增菌虽然可
以提高灵敏度,在一定程度上稀释了样品中对 PCR
产生抑制作用的物质,但是其增加了检测时间,很
难满足快速检测的要求。因此,高效率提取核酸的
方法是研究的重点。PCR还存在假阴性问题,在
PCR反应体系中加入扩增内标是一种好方法[11,19]。
区分死活菌也一直是研究的一个方向,虽然可以用
RT-PCR来区分,但是存在较容易污染、基因表达
量,mRNA容易降解的问题。Rudi在 PCR前加入
EMA(ethidiummonozidebromide),该染料可选择性
的进入损伤的细胞膜中,结合 DNA和 RNA,而被
结合的 DNA和 RNA在 PCR中将不被扩增,这样就
可以只检测到活菌[25]。但是不足之处是细胞壁损伤
的细菌可能在培养中修复恢复过来,成为可致病
菌,从而造成潜在的危害。未来 PCR技术在解决上
面的问题同时,会向着集样品处理、检测于一体的
自动化仪器方向发展[20],不需要专业性很强的人员
也能操作,同时满足高通量的检测,达到快速、特
异、节约及高灵敏度的要求。
参考 文献
1 DeneerHG,BoychukI.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,
1991,57(2):606~609.
2 AznarR,AlarconB.SystematicandAppliedMicrobiology,2002,25
(1):109~119.
3 ZhouXH,JiaoXN.FoodControl,2005,16(2):125~130.
4 OravcovaK,KaclikovaE,KrascsenicsovaK,etal.LetersinApplied
Microbiology,2006,42(1):15~18.
5 JofreA,etal.FoodMicrobiology,2005,22(1):109~115.
6 RawoolDB,MalikSVS,ShakuntalaI,etal.InternationalJournalof
FoodMicrobiology,2007,113(2):201~207.
7 RossmanithP,KrassnigM,WagnerM,etal.ResearchinMicrobio
logy,2006,157(8):763~771.
8 KleinPG,JunejaVK.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,1997,
63(11):4441~4448.
9 张晓峰,等.中华检验医学杂志,2003,26(2):93~95.
10 BurtscherC,WuertzS.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,
2003,69(8):4618~4627.
(下转第112页)
徐伟等:PCR技术检测单核细胞增生李斯特氏菌研究进展 99
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第1期
11 KaclikovaE,etal.FoodControl,2003,14(3):175~179.
12 SomerL,KashiY.JournalofFoodProtection,2003,66(9):1658~
1665.
13 王芳,金莉莉,等.辽宁大学学报,2002,29(2):155~158.
14 LiuDY,AinsworthAJ,AustinFW,etal.InternationalJournalof
FoodMicrobiology,2004,91(3):297~304.
15 WeryN,PourcherAM,StanV,etal.LetersinAppliedMicrobiology,
2006,43(2):131~136.
16 BhagwatAA.InternationalJournalofFoodMicrobiology,2003,84
(2):217~224.
17 AmaglianiG,etal.FoodMicrobiology,2004,21(5):597~603.
18 KimJ,DemekeT,ClearRM,etal.InternationalJournalofFood
Microbiology,2006,111(1):21~25.
19 Rodriguez-LazaroD,PlaM,ScortiM,etal.AppliedandEnvironmental
Microbiology,2005,71(12):9008~9012.
20 CadyNC,StelickS,KunnavakkamMV,etal.SensorsandActuators
B:Chemical,2005,107(1):332~341.
21 寇运同,马洪明,刘晨光.食品科学,2001,22(5):52~55.
22 WangRF,CaoWW,JohnsonMG.AppliedandEnvironmental
Microbiology,1992,58(9):2827~2831.
23 NogvaHK,RudiK,NaterstadK,etal.AppliedandEnvironmental
Microbiology,2000,66(10):4266~4271.
24 Rodriguez-LazaroD,JofreA,AymerichT,etal.AppliedandEnvi
ronmentalMicrobiology,2004,70(10):6299~6301.
25 RudiK,NaterstadK,Dr#mtorpSM,etal.LetersinApplied
Microbiology,2005,40(4):301~306.
26 程洁,张晓峰,施伟良,等.SN/T0184.2-2006.北京:中国标准
出版社,2006.
27 马保华,张辉华,等.动物医学进展,2005,26(11):57~60.
28 ChioWS,HongHC.InternationalJournalofFoodMicrobiology,
2003,84(1):79~85.
29 Rodriguez-LazaroD,HernandezM,PlaM.FEMSMicrobiology
Leters,2004,233(2):257~267.
30 Rodriguez-LazaroD,HernandezM,ScortiM,etal.Appliedand
EnvironmentalMicrobiology,2004,70(3):1366~1377.
31 GuilbaudM,deCoppetP,BourionF,etal.AppliedandEnvironm
entalMicrobiology,2005,71(4):2190~2194.
质质量变化对折射率变化不明显,这给小分子物质
的分析带来一定的困难和影响。
4 结束语
SPR技术作为研究生物分子相互作用的新技
术,已经逐渐地应用于分子间相互作用的众多领域
的研究,探索分子间有无结合以及相互作用的亲和
力、结合/解离的快慢,分析结合位点和结合顺序,
寻找受体、配体、底物、疾病靶点、分析目标组分的
浓度等。因此,其在蛋白质组学、信号转导、药物研
发、遗传学分析等生命科学领域的应用发展迅速,
其作用也日益重要。随着 SPR仪器和传感芯片技
术的不断发展和完善,结合各个领域研究的拓展,
SPR技术的应用将更加趋向多样化,具有广阔的发
展前景。
参考 文献
1 李秀丽,韦天新.化学进展,2007,19(1):193~199.
2 陈媛媛,李永进,毕利军.生物物理学报,2006,22(2):82~88.
3 HeutmekersTH,BremerMG,HaasnootW.AnalChimActa,2007,
586(1~2):239~45.
4 崔小强,裴仁军,杨秀荣.分析化学,2000,28(8):950~955.
5 HradetzkyD,MuelerC,ReineckeHJ.OptA:PureApplOpt,2006,
8:S360~S364.
6 deMeloAJ.TotalInternalReflectionFluorescenceSpectroscopy,in
bookofSurfaceAnalyticalTechniquesforProbingBiomaterialPro-
cesses,Davies,J,Ed,CRCPress[M].BocaRaton,NewYork,1996.
7 BiacoreAB,BIAtechnologyHandbook[M].versionAB,Sweden,1998.
8 RoosH,KarlssonR,NilshansH.JMolRecogn,1998,11:204~210.
9 NagataK,HandaH.(Eds.)Real-TimeAnalysisofBiomolecularIn-
teractions:ApplicationsofBIACORE[M].Springer-Verlag:Tokyo,
2000,35~71.
10 MathewACooper.NatRevDrugDiscov,2002,1(7):515~528.
11 RichR,DayL,MortonYS.AnalBiochem,2001,296:197~207.
12 黄汉昌,姜招峰,等.北京联合大学学报 (自然科学版),
2007,21(3):63~67.
13 WilsonTM,etal.JMedChem,2000,43(4):527~50.
(上接第99页)
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
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