全 文 ：
研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 3期
诺如病毒 RT
PCR
反向斑点杂交检测方法的建立
田甜 1 董英 1 薛强 2 邹明强2 王伟2
( 1江苏大学,镇江 212013; 2中国检验检疫科学研究院,北京 100123)
  摘  要:  旨在建立诺如病毒 RT
PCR
反向斑点杂交检测方法。选取诺如病毒较为保守的 RdRp基因作为扩增对象,经
RT
PCR扩增后将目的片段克隆到 pGEM
T载体中。以重组质粒为模版, 选择合成寡核苷酸探针及生物素标记引物。生物素
标记引物的扩增产物经热变性后与固定在硝酸纤维素膜上的探针进行杂交反应,经显色后判定结果。出现明显的蓝紫色斑
点为诺如病毒阳性, 如无斑点则为阴性。对 5份临床样品进行检测, 并以 RT
PCR对比验证。结果显示, 利用反向斑点杂交法
对重组质粒的检测限为 100拷贝 /
L, 在 5例实际样品检测中有 1例为阳性, 与 RT
PCR判定结果一致。建立了诺如病毒的
RT
PCR
反向斑点杂交检测方法,该方法特异性好, 灵敏度高,操作简便, 具有重要的应用价值。
关键词:  诺如病毒 反转录
聚合酶链式反应 反向斑点杂交
Detection ofNorovirus by RT
PCR
Reverse BlotHybridization
T ian T ian
1
DongY ing
1
Xue Q iang
2
ZouM ingqiang
2
W angW ei
2
(
1
J iangsu University, Zhenjiang 212013;
2
Chinese A cademy of Insp ection and Quarantine, Beijing 100123 )
  Abstrac:t  It was to deve lop a RT
PCR
Reverse b lot hybridization m ethod fo r detecting No rov irus. O ligonuc leo tide pr im ers targe

ting theRNA
dependent RNA po lym erase conserved RdRp gene w ere used to amp lify v iral RNA. The am plicon w as c loned into vec ter
pGEM
T to form the recom b inant plasm id, based on wh ich o ligonuc leotide probes and b io tiny lated prim ers w ere designed. A fte r therm a l
denaturation, the recom binant plasm id was hybr id ized w ith the sing le
stranded DNA probe. W hen roya l purple b lo t formed, the de tection
resu lt was positive, o therw ise, its negative. De tection o f Norov irus in 5 rea l sam ples w as pe rfo rm ed, and the results w ere con firm ed by
RT
PCR. Results indicated that the me thod o f detecting Norovirus by RT
PCR
Reverse B lo tH ybrid ization has good spec ific ity and sen

sitiv ity. 100 cop ies o fNo rov irus plasm id cou ld be de tected by reverse b lo t hybridization while 1 000 copies by ge l e lec trophoresis. No ro

v irus in 1 of 5 sam ples was found by RT
PCR
Reve rse blot hybr idiza tion wh ich is in accord w ith RT
PCR. The re fo re, aNorov irus detec

tion m ethod by RT
PCR
Reverse b lo t hybridization w as estab lished successfu lly, wh ich show ed satisfac to ry prospec t of app lication.
Key words:  Norov irus Reverse transcr iption po lym erase cha in reaction Reve rse b lo t hybridization
收稿日期: 2009
11
10
基金项目:国际科技合作项目 ( 2009DFA32720) ,国家质检总局科技计划项目 ( 2007 IK184)
作者简介:田甜,女,在读硕士,主要从事食品安全检验研究; E
m ai:l hyesung918@ 126 com
通讯作者:邹明强, E
m ai:l m ingqiangz@ sina com
诺如病毒 ( no rov irus, NV )又称诺瓦克病毒
( no rov iruses, NV s)或小圆状结构病毒 ( sm all round
structured v irus, SRSV )
[ 1]
, 是世界范围内常见的引
起人类非菌性肠胃炎暴发和散发的病原微生物。
诺如病毒的主要传播方式是粪
口传播, 食用被病
毒污染的食物如牡蛎、鸡蛋、色拉及水等最常引起
暴发性肠胃炎流行 [ 2]。诺如病毒的潜伏期为 24 -
48 h,主要症状为腹泻、呕吐、腹痛和发热 [ 3]。该病
毒的感染性很强,感染的患者、隐性感染者及健康
携带者均可作为传染源 [ 4]。通常根据核衣壳编码
基因的不同将诺如病毒分为 类和 II类 ( G 和 G
II) ,也有以衣壳蛋白质序列为依据将其分为 -
!类的报道 [ 5]。据美国疾病控制中心统计, 1997
年 7月至 2000年 6月间,美国境内 83%的非细菌
肠胃炎暴发与诺如病毒有关, 而其中的 73%由 G
II型引起 [ 6]。在我国由 G II型诺如病毒引发的肠
胃炎疾病也屡见不鲜,主要发病人群为 6月龄至 3
岁婴幼儿 [ 2]。
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 3期
由于目前尚无合适的动物模型和细胞系用于诺
如病毒的培养和分离, 对于该病毒较为常见的检测
手段是电镜和 RT
PCR方法。但因电镜检测费用
高、劳动强度大、对检测人员的技术要求高, 需要根
据经验对病毒形态进行判别, 且常规检出限较低
( 10
5
- 10
6病毒颗粒 /mL) , 使其应用受到制约 [ 7, 8 ]。
而 RT
PCR因具有特异性强、灵敏度高等优点被喻
为诺如检测的金标准 [ 9- 12]。利用自行设计的特异
性探针与生物素标记的扩增引物建立 G II型诺如
病毒反向斑点杂交检测方法,该方法可以通过肉眼
直接进行结果判定, 为食源性病毒检测工作的开展
奠定一定基础。
1 材料和方法
11 供试材料与试剂
诺如病毒粪便悬浊液标本来自中国疾病预防控
制中心。T IAN amp V irus RNA K it病毒 RNA提取试
剂盒购自天根生化科技北京有限公司; Ge lRed Nu

cle icA cid Sta in购自 B io tium公司; illustraTM Ready
to

GoRT
PCR Beads购自 GEH ea lthcre公司。 pGEM
T
and pGEM
T Easy Vector Systems、氨苄 青霉素
(AM P)、链霉亲和素碱性磷酸酶 ( S treptav id in A lka

line Phosphatase)、氯化硝基四氮唑蓝 (NBT)和 5
溴

4
氯
3
吲哚基
磷酸盐 ( B ICP)均购自 Promega公司。
B io T trace硝酸纤维素膜 ( NC膜 ); HyBond N+尼龙
膜、硝酸纤维素膜购于 Pall公司。
12 主要仪器与设备
M astercyc ler 5333 PCR自动循环仪 ( Eppendor,f
德国 ) ; Pow erPac Basic稳压稳流电泳仪及电泳槽
( B io
R ad,美国 ); Image S tation 4000MM PRO多功能
凝胶成像系统 ( Kodak, 美国 ); HBSNSR220杂交炉
( Thermo, 美国 )。
13 病毒 RNA提取、RT
PCR与重组质粒构建
按照试剂盒说明, 向装有 560
L C arrier RNA
工作液的离心管中加入 140
L经 PBS 1倍稀释后
的诺如病毒粪便悬浊液, 涡旋振荡使其充分裂解
后室温孵育 10m in。向离心管中加入 560
L无水
乙醇涡旋振荡 15 s, 将离心管中液体转移至无
RNA酶的吸附柱中离心后弃废液。然后分别向含
有吸附柱的收集管加入 560
L无水乙醇、500
L
缓冲液及 500
L漂洗液, 每次加入液体后均离心并
弃废液。最后用 60
L无 RNA酶的洗脱溶解 RNA。
结合文献 [ 13, 14]与 GenBank中公布的序列数
据,选取 G∀型诺如病毒较为保守的 RNA依赖性的
RNA聚合酶基因 ( RdRp)作为扩增对象。利用 O ligo
软件设计特异性引物及探针 (表 1)。预期扩增片段
长度为 157 bp。RT
PCR反应体系为 50
L, 随机引
物 1
L,生物素标记上、下游引物各 1
L( 10 nmo l/
L ) ,病毒 RNA 1
L( 15 ng), DEPC水补充至总体积
50
L;扩增条件: 45# 40m in; 95# 预变性 2m in,然
后经历 35个循环,每个循环为 95# 变性 30 s, 48#
退火 30 s, 72# 延伸 30 s, 最后 72# 再延伸 5 m in。
扩增完毕取 5
L, 利用 15%琼脂糖凝胶电泳观察
结果。回收凝胶中目的片段,将回收产物与 pGEM

T载体连接, 然后转化至 JM 109感受态细胞, 在含有
氨苄青霉素、X
Gal和 IPTG的 LB培养基上进行蓝
白斑筛选。挑白斑到含有氨苄青霉素的液体 LB /
AMP培养基中 37# 培养 8 h。收集菌液,提取质粒。
质粒经 PCR鉴定后测序。
表 1 G∀型诺如病毒引物及探针
引物及探针 序列
 NVR  B iot in
5
AGC CTG TAT GAT GTC TGG GGA
CA
3
 NVS  B iot in
5
AGC GTG GTG GAT GTG GGT G
3
 NV
P robe  5
AGC AGC TGC CAG CAC GGC
3
14 反向斑点杂交法的建立及优化
141 假杂交试验 [ 15] 在尼龙膜和硝酸纤维素膜
上不点探针, 于预杂交液 ( 5 ∃ SSC, 05% SDS, 1%
PVP
40)中 42# 预杂交 2 h后,放入质粒 pGEM
NV的
PCR产物量分别为 20
L /mL、10
L /mL、5
L/mL的
杂交液 ( 5 ∃ SSC, 05% SDS, 1% PVP
40)中进行 42# 杂
交 2 h。杂交后洗液 I ( 2 ∃ SSC, 01% SDS)、II( 02 ∃
SSC, 01% SDS)分别洗两次, 每次 1 h; 酶联缓冲液
( pH75, 100mm Tris
C ,l 150 mm NaC,l 2mm M gC l2,
005% Triton
100)漂洗后,酶的稀释度分别为1 /1 000、
1/2 000、1/5 000时 37# 作用 30m in;酶反应后底物缓
冲液 洗涤 ( pH90, 100mm T ris
C ,l 150mm NaC,l
1mm MgC l2 )两次,每次1 h;加入底物 (每 10mL底物
缓冲液中加入66
L NBT, 33
L BICP)室温避光显色
174
2010年第 3期 田甜等:诺如病毒 RT
PCR
反向斑点杂交检测方法的建立
30m in。
142 为了得到最佳紫外交联时间, 以 141所获
得的最佳本底, 在膜上点上探针 ( 100
mo l/L ), 并
以杂交缓冲液做空白, UV交联时间 45 s、1 m in、
3 m in, 5 m in交联后用 6 ∃ SSC洗膜除去未结合探
针, 42# 预杂交 2 h,杂交 2 h。
143 以 142所获得的最佳条件, 改进以下条
件。杂交后洗涤温度:室温、42# ;杂交后洗涤时间:
2 m in /次、15 m in /次、30 m in /次、1 h /次; 酶反应时
间: 15 m in、30 m in、1 h、2 h;底物缓冲液洗涤时间:
2 m in /次、15m in /次、30 m in /次、1 h /次。
144 以 142所获得的最佳条件, 进行杂交反
应,探索不同预杂交时间 ( 0 h、1 /2 h、1 h、2 h)、杂交
时间 ( 1 h、2 h、过夜 )和杂交温度 ( 42# 、50# 、55# )
对探针灵敏度的影响。
15 特异性检测
151 灵敏性试验  取质粒 pGEM
NV母液 5
L,
100倍稀释测定 OD 260值, 计算质粒的拷贝数。质粒
倍比稀释 ( 100 - 1011 ) ,每个稀释度取 1
L为模版,
PCR扩增后取 10
L进行 15%琼脂糖凝胶电泳,
剩余 PCR产物变性, 以 10
L /mL加入杂交液中进
行反应。
152 特异性试验  硝酸纤维素膜上固定诺如探
针及经本实验室验证的特异的轮状病毒 ( RV )和甲
型肝炎病毒 ( HAV )探针, 与未经稀释的质粒 RV、
NV及 HAV的 PCR产物杂交。
153 稳定性试验  取当日、保存 1个月、3个月
及 6个月的固定过探针的膜条, 相同条件下杂交。
154 临床样品检测  将采集于北京中日友好
医院的 5份临床表现为腹泻、腹痛和呕吐的粪便
样本以上述方法进行 RT
PCR
反向斑点杂交检
测。并将检测结果与 RT
PCR及临床检测结果
对比。
2 结果与分析
21 RT
PCR扩增及重组质粒构建
诺如病毒为 RNA病毒, 变异性强、不同毒株序
列差异大是这类病毒的特点。本研究利用自行设计
的引物特异性扩增诺如病毒较保守的 RdRp基因片
段如图 1所示。重组质粒测序结果利用 BLAST对
比,与毒株 Norov irus Hu /G II. 4 ( GenBank登录号:
FJ7492551)同源性达 99%。由于诺如病毒粒子在
粪便悬浊液中感染量少, 所以优化过程中使用质粒
pGEM
NV替代病毒进行试验。
M. M arker2000; 1. NV(模版 10
L ) ; 2. NV (模版 5
L ); 3.
NV(模版 2. 5
L) ; 4. NV(模版 125
L) ; 5.阴性对照
图 1 诺如病毒 RNA RT- PCR电泳图
22 反向斑点杂交方法的建立及优化
通过条件优化试验,反向斑点杂交优化流程如
下:探针 ( 100
mo l/L )点在 NC膜上, 并以杂交缓冲
液为阴性对照,紫外交联 3m in(图 2
b) ; 用 6 ∃ SSC
洗膜除去未结合探针,预杂交 2 h;取变性的 PCR产
物 10
L加入杂交液中 42# 振荡杂交 2 h;以洗液 I
和洗液 II各洗涤 2次, 2 m in /次;酶联缓冲液漂洗后
与 2 000倍稀释的链霉亲和素碱性磷酸酶 37# 作用
30m in;以底物缓冲液洗膜 2次, 2 m in /次;室温显色
30 m in, 最后灭菌去离子水终止显色反应并判定
结果。
通过对诺如病毒杂交过程中步骤的优化,发现硝
酸纤维素膜的本底显著优于尼龙膜,且杂交液中变性
PCR产物量为 10
L /mL,酶的稀释度为1 /2 000时本
底最低 (图 2
a); 随着预杂交和杂交时间的加长, 探
针的灵敏度也越来越高,但当杂交时间超过 2 h后,
探针的灵敏度没有显著改变 (图 2
,f图 2
g )。这可
能是由于 2 h内杂交缓冲液中的分子运动完全可以
满足杂交的需要, 所以无须杂交更长时间。杂交温
度的变化对于探针灵敏度的影响极为显著, 随着温
度的升高,探针灵敏度逐渐降低 (图 2
h)。这与探
针的 Tm值有关。根据文献报道, 通常情况下探针
的最适复性温度为 Tm 25# [ 16] , 本研究中探针 NV

probe的 Tm值根据软件 Tm V13计算得 6856# ,
所以杂交温度选择为 42# 。
175
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 3期
a为假杂交试验: 1.硝酸纤维素膜; 2.尼龙膜; b为紫外交联时间优化试验: 1. 30 s; 2. m in; 3. 3m in; 4. 5m in; c为杂交后洗膜温度及
时间确定试验: 1 - 4.室温温度,时间分别为 2m in /次, 15m in /次, 30m in /次, 1 h /次; 5.温度为 42# ,时间为 15m in /次; d为酶促反
应时间检测试验: 1. 15 m in; 2. 30 m in; 4. 1 h; 4. 2 h; e为酶促反应后洗膜时间优化试验: 1. 2m in /次; 2. 15 m in /次; 3. 30 m in /次; 4. 1
h /次; f为预杂交时间对探针灵敏度的影响检测试验, 其中 1、3、5、7为 NC膜, 2、4、6、8为尼龙膜: 1- 20 h; 3- 4. 30 m in; 5- 6. 1 h;
7- 8. 2 h; g为杂交时间对探针灵敏度的影响检测试验, 其中 1、3、5为 NC膜, 2、4、6为尼龙膜: 1- 2. 1 h; 3 - 4. 2 h; 5 - 6.过夜; h为
杂交温度对探针灵敏度的影响检测试验,其中其中 1、3、5为 NC膜, 2、4、6为尼龙膜: 1 - 2. 42# ; 3- 4. 50# ; 5 - 6. 55#
图 2 斑点杂交优化结果
23 反向斑点杂交的灵敏度
利用紫外分光光度计测量质粒 pGEM
NV母液
稀释 100倍后的 OD260值为 0014, 计算得质粒
pGEM
NV母液拷贝数为 20 ∃ 1010 (拷贝 /
L) =
602 ∃ 1023 ∃ A 260 ∃稀释倍数 ∃ 50 ∃ 109 /L ∃ 660,
A 260为待测样品的吸光度值; L为质粒的长度。由图
3可以看出,当母液中质粒数为 102拷贝 /
L时, 电
泳条带已经非常模糊,而杂交信号清晰明显。说明
杂交可有效将灵敏度提高 10倍。
由于电泳的原理为不同分子量、构型的带电粒子
在电场中迁移速度的不同而对核酸进行区分, 利用
GelRed染色后经紫外照射显色, 而本杂交的原理为
生物素标记的核酸分子复性,利用碱性磷酸酶
BC IP

NBT显色体系得到肉眼可辨的结果。由试验结果
可见,当固定 PCR产物的加入量, 电泳中核酸区分
图 3 反向斑点杂交灵敏度试验
明显且核酸杂交效率达到最大时 (图 2
f至 2
h), 碱
性磷酸酶
BC IP
NBT体系显色能力或显色可辨度高
于 Ge lR ed体系。
24 反向斑点杂交的特异性
由图 4看出, 探针 NV
probe只与其对应 PCR产
物反应产生清晰信号, 与其他两种食源性病毒的
PCR产物无交叉反应,引物与探针的特异性良好。
176
2010年第 3期 田甜等:诺如病毒 RT
PCR
反向斑点杂交检测方法的建立
25 杂交稳定性试验结果
保存条件为 4# 干燥保存时,取将当日、保存 1
个月、3个月及 6个月的固定过探针的膜条以相同
条件杂交,当日及保存 1个月的杂交信号清晰明显,
保存 3个月的膜条杂交信号较弱, 6个月的膜条无
杂交信号 (图 5)。这可能与硝酸纤维素膜的持水性
能有关。由本试验可知, 经紫外交联固定过探针的
硝酸纤维素膜最长保存期为 1个月。
图 4 杂交特异性试验结果
图 5 稳定性试验结果
26 临床样品检测
将采集到的 5份疑似诺如病毒样品使用上述方法
进行 RT
PCR
反向斑点杂交检测,结果如图 6所示。
其中,检出 1份诺如病毒 G∀型阳性, 4份诺如病毒 G∀
  M. DL2000; 1.阴性对照; 2.阳性对照; 3 - 7.临床样品
图 6 样品检测结果
型阴性,与 RT
PCR及临床诊断结果一致。该结果
表明, RT
PCR
反向斑点杂交检测方法切实可行。
3 讨论
本研究通过自行设计的引物特异性扩增 G∀型
诺如病毒较保守的 RNA依赖性的 RNA聚合酶基因
( RdRp)。对目的片段进行克隆后, 以重组质粒
pGEM
NV为模版建立了反向斑点杂交检测 G∀型
诺如病毒的方法。该方法对重组质粒的检测限为
100拷贝 /
L,灵敏度高于凝胶电泳 10倍,且操作简
便, 肉眼即可判定结果。同时,通过特异性探针的杂
交反应能有效排除在 RT
PCR扩增中由非特异性扩
增所造成的假阳性,特异性良好。
作为食源性病毒,诺如病毒致病后的临床表现
为腹泻、恶心等症状,而引起此类症状的还有诸如轮
状病毒、肠腺病毒等。因此, 建立一种可以同时检测
多种病毒引起相似临床病症的方法将具有更大的应
用价值。本研究为开发快速、同步检测多种食源性
病毒方法的研究奠定了基础。
参 考 文 献
[ 1] Green J, V in je J, Gallim ore C I, et a.l Cap sid protein d ivers ity among
Norw alk
l ike viruses. V irus Genes, 2000, 20( 3 ) : 227
236.
[ 2] 柳增善. 食品病原微生物学 [M ] . 北京:中国轻工业出版社,
2007, 289.
[ 3] Sh arp TW, H yam sKC, WattsD, et a.l Ep idem iology ofN orw alk virus
du ring an ou tb reak of acu te gast roen terit is aboard aUS aircraftC arri

er. JV irolM ethod s, 1995, 45 ( 1) : 61
67.
[ 4] Rockx B, W itMD, Vennem a H, et a.l Natural h istory of hum an cali

civirus in fection: a prospective coh ort study. C lin In fectD is, 2002, 35
( 3) : 246
253.
[ 5 ] Zheng D, Andoa T, FankhauserRL, et a.l N orovirus class ificat ion and
proposed stra in nom enclature. V iro logy, 2006, 346 ( 2) : 312
323.
[ 6] Fankhau ser RL, M on roe SS, Noel JS, et a.l Ep idem iologic andm olec

u lar trends of " Norw alk
like viruses" associated w ith outbreaks of
gastroenterit is in the Un ited S tates. The Journ al of In fection D isea

ses, 2002, 186( 1 ) : 1
7.
[ 7] R ichards AF, Lopm an B, Gunn A, et a.l Eva luation of a comm ercial
ELISA for detecting N orw alk
like viru s an tigen in faeces. JC l inV ir

o,l 2003, 26 ( 1) : 109
115.
[ 8] M ead PS, S lutsker L, D ietzV, et a.l Food
related illn ess and death in
the Un ited S tates. Em erg In fectD is, 1999, 5 ( 5) : 607
625.
(下转第 180页 )
177
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 3期
表 1 大鼠肝脏、MT粗品中金属元素
含量比较 ( x% & s,
g/ g)
Zn C u Zn / Cu Cd
肝脏 11546+ 2270 2212+ 0606 5353+ 1435 0013+ 0003
MT 0176+ 0035 0093+ 0026 1934+ 0519 0012+ 0001
P 0013 0004 0018 0742
3 讨论
按照经典方法提取 MT条件温和,但周期较长,
以中空纤维超滤代替经典方法中的透析浓缩, 能够
去除杂蛋白同时更换缓冲液,使蛋白处于较温和稳
定的环境中, 比有关文献介绍的利用 G
25除乙醇
要好 [ 7] , 因后者要求样品量依据柱体积来定, 若样
品无颜色在除乙醇时需进行监测, 而采用中空纤维
柱则无样品量要求, 节省时间同时利于层析分离。
确定最佳的离子浓度、洗脱速度:采用洗脱体积 600
mL,浓度 002 - 03 mol /L Tris
HC ,l流速 08 mL /
m in。电泳结果表明可能有二聚体形成,与文献报道
的金属硫蛋白在溶液中易形成二聚体现象一致,因
此大量制备时应注意及时冻干粗品。
通过测定,肝中天然 MT结合 Zn、Cu、Cd 3种金
属,以 Zn元素为主。很多研究表明可以以 MT的量
作为微量元素代谢、肿瘤诊断治疗、环境污染水平等
的评估手段之一,但是,除了量上的差异, 其结构的
改变与天然 MT的差异是否存在具体的关联,还需
进一步研究。本研究发现,大鼠肝脏 MT中 Cd含量
与肝脏的本底值无统计学差异, 提示肝中金属镉是
否以结合态形式存在, 这种结合是否使其在一定
范围内不发挥毒作用, 同时使肝脏成为镉的蓄积
器官之一。另外提示, 镉的中毒剂量标准除了以
其浓度值为单纯的依据, 应同时考虑其存在的
状态。
本研究建立的 MT纯化及亚基分型方法也适用
于牛心,将为 MT的大量纯化奠定试验基础, 可以提
供充足的具有天然结构的 MT进行与之有相互作用
的天然产物的高通量筛选,进而为 MT相关疾病的
分子机制研究提供物质保障。
参 考 文 献
[ 1] Dz ieg iel P, Jele
M, Muszczy
ska B, et a.l Role of m etalloth ionein
exp ress ion in non
sm all cell lung carcinom as. RoczAk adM ed B ia

lym st, 2004, 49( 1 ) : 43
45.
[ 2] Nordb erg GF, NordbergM, PiscatorM , et a.l S eparation of tw o form s
of rabbitm etalloth ione in by isoelectric focu sing. B iochem, 1972, 126
( 3) : 491
498.
[ 3 ] H enry RB, L iu J, Ch oudhu riS, KlaassenCD. Species variat ion in he

p at ic m eta lloth ionein. Toxico,l 1994, 74( 1 ) : 23
33.
[ 4] 武汉大学化学系.仪器分析 [M ] ,北京:高等教育出版社, 2001,
358
359.
[ 5] 刘成梅,熊勇华,杨晓浪,等.锌金属硫蛋白的初步研究.食品科
学, 2003, 24( 3 ): 53
56.
[ 6] 潘爱华,茹炳根,李令媛,等.锌诱导家兔肝脏金属硫蛋白的纯化
及鉴定.生物化学与生物物理学报, 1992, 24( 6) : 509
515.
[ 7] 杨海荣,罗坚,董爱华,等.疏水层析结合冷乙醇沉淀纯化人血清
白蛋白.生物工程学报, 2004, 20 ( 6) : 943
947.
(上接第 177页 )
[ 9] Kou XX, Wu QP, Zh ang JM , et a.l R ap id Detection of noroviruses in
fecal samp les and sh ellfish by nucleic acid sequence
based am p lifica

tion. J, M icrob io,l 2006, 44( 4) : 403
408.
[ 10 ] Roh ayem J, Berger S, Juretzek T, et a.l A sim p le and rap id sing le

step mu ltiplex RT
PCR to detect norovirus, astroviru s and adenovirus
in clin ical stool sam ples. Jou rnal ofV irologicalM ethods, 2004, 118:
49
59.
[ 11 ] V in je J, Vennem a H, M aunu la L, et a.l In ternational collaborat ive
study to com pare reverse transcriptase PCR assays for detection and
genotyping of noroviruses. J C lin M icrob io,l 2003, 41 ( 4 ) : 1423

1433. 
[ 12 ] J iang X, W ang JX, David Y, et a.l Detect ion ofn orw alk virus in stoo l
by polym erase chain reaction. J C l in M icrob io,l 1992, 30 ( 10 ):
2529
2534.
[ 13 ] J iang X, WangM, Wang K, et a.l Sequen ce and genom ic organ ization
ofN orw alk v iru s. V irology, 1993, 195( 1) : 51
61.
[ 14 ] Lam bden PR, Caul EO, Ash ley CR, et a.l Sequen ce and genom e or

ganization of a hum an sm all round
stru ctured (N orw alkl ike ) virus.
Science, 1993, 259( 5094) : 516
519.
[ 15 ] 邵雪君,吴士良.基于尼龙膜的点杂交的建立及优化.实用医技
杂志, 2006, 13( 4) : 509
511.
[ 16 ] 马文丽,郑文岭,等,核酸分子杂交技术 [M ] .北京:化学工业出
版社, 2007, 52
53.
180