全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2005, 32 (2) : 324～326
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2004 - 04 - 12; 修回日期 : 2004 - 07 - 063 通讯作者 Author for correspondence
马铃薯 Y病毒河北分离物外壳蛋白基因序列分析
和株系鉴定
吴志明 1 　董志茹 1, 2 　刘小娟 1 　温春秀 1 　谢晓亮 13 　张庆良 3
(1 河北省农林科学院经济作物研究所 , 石家庄 050051; 2 保定市教育局仪器站 , 保定 071000; 3 河北科润农业技术有
限公司 , 石家庄 050051)
摘 　要 : 对河北张家口感病马铃薯的一个马铃薯 Y病毒分离物 ( PXY2HBE I) 的外壳蛋白基因进行了
克隆和序列分析。以提取的 RNA为模板 , 应用 RT2PCR扩增目的基因 , 扩增产物克隆到质粒 pGEM 2T, 上
并序列分析。结果表明 , 克隆 cDNA片段由 801个核苷酸组成 , 编码 267个氨基酸。与基因库中 PVY代表
株系相比 , 它们的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为 8916% ～9818%和 9313% ～9815% , 与 PVYN 和 PVYO
株系的氨基酸序列同源性分别为 9316%和 9718% , 确定 PVY2HBE I归属于普通株系 ( PVYO株系 ) , 同时建
立了快速、灵敏、简便的 PVY RT2PCR检测方法。
关键词 : 马铃薯 Y病毒 ; 反转录 -聚合酶链式反应 ; 外壳蛋白基因 (CP) ; 序列 ; 株系鉴定
中图分类号 : S 436132; S 435132　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2005) 0220324203
Coa t Prote in Gene Sequence Ana lysis and Iden tif ica tion of a Pota to V irus Y
Hebe i Isola te
W u Zhim ing1 , Dong Zhiru1, 2 , L iu Xiaojuan1 , W en Chunxiu1 , Xie Xiaoliang13 , and Zhang Q ingliang3
(1 Insititu te of Econom ic C rop Research, Hebei A cadem y of A gricu ltural and Forestry Sciences, Shijiazhuang 050051, China;
2 Equipm ent S tation of B aoding Education B uerau, B aoding 071000, Ch ina; 3 Hebei Green A griculture Technology Co. L td. ,
Shijiazhuang 050051, Ch ina)
Abstract: A potato virus Y isolate ( PVY2HBE I) was obtained from infected potato p lants cultivated in
Zhangjiakou City of Hebei Province. The coat p rotein gene (CP) was amp lified from the extracted p lant total
RNA by using RT2PCR, and cloned into the pGEM 2T vector and sequenced. The cloned segment was 801 bp
and encodes 267 am ino acid residues. It was cpmpared with other PVY isolates reported in GenBank. It
shares 8916% - 9818% and 9313% - 9815% homology in nucleotide and the putative am ino acid sequence,
respectively, which suggested that the CP gene of PVY isolates is a relatively conserved sequence within the
PVY genome, the homology between PVY2HBE I and PVYN and PVYO were 9316% and 9718% , resepectiv2
ly, thus it was identified as an isolate of PVYO , the experiment also p rovided a rap id, sensitive and relative2
ly inexpensive methods of PVY RT - PCR detection.
Key words: Potato virus Y; RT - PCR; Coat p rotein gene (CP) ; Sequence analysis; Isolate identifi2
cation; Detection
1　目的、材料与方法
马铃薯 Y病毒 ( Potato V irus Y, PVY) 是马铃薯 Y病毒科 ( Potyviridae) 马铃薯 Y病毒属 ( Poty2
virus) 的重要成员 , 是危害马铃薯的世界性病毒之一。20世纪 90年代以来 , 国内外先后报道了 PVY
株系的类群和基因组序列 , 其中主要有普通株系 ( PVYO ) 和引起脉坏死的株系 ( PVYN ) 以及 PVYN
的变异株系如 PVYNTN等。作为冀中南地区产业结构调整的重要作物 , 马铃薯无病毒种苗生产中不可
忽视对脱毒种苗的检疫和检测。本文进行了河北 PVY分离物 CP基因的序列分析和株系鉴定 , 并建立
了 PVY RT - PCR分子检测应用技术体系。
　2期 吴志明等 : 马铃薯 Y病毒河北分离物外壳蛋白基因序列分析和株系鉴定 　
马铃薯田间感病株采自张家口沽源县 , 待检测的马铃薯脱毒苗由河北科润农业技术公司提供。
PVY总核酸的提取按前文〔1〕建立的方法进行。根据 PVY CP基因序列设计合成一对引物 , 由北京赛百盛
基因公司合成 , 上游引物 5H: 5pi2AGGATATGGCAAACGACACAATTGAT23pi, 下游引物 3C: 5pi2GCGAAT2
TCTACAATCACATGTTCTTGAC23pi。cDNA合成按常规操作进行。PCR扩增条件 : cDNA 1μL, 10 ×buffer
215μL, 10 mmol·L - 1 dNTPs 015μL, PCR引物 015μL (20μmol·L - 1 ) , 017μL Taq DNA聚合酶
(5 U·μL - 1 ) , 无菌水补足至 25μL。PCR扩增条件 : 88℃ 10 m in; 94℃ 45 s, 54℃ 30 s, 72℃ 1 m in,
30个循环 ; 72℃ 10 m in。取 5μL PCR产物经 5%聚丙烯酰胺凝胶电泳。大连宝生物公司的 DNA回收试
剂盒回收琼脂糖电泳的 PCR产物 , 与 Promega公司的 pGEM2T载体连接 , 转化大肠杆菌感受态 DH 5α菌
株。细菌 PCR法快速鉴定重组质粒 , 随机筛选 1～2个阳性克隆进行序列测定 , 由大连宝生物公司进行 ,
记为 PVY2HBE I。应用 DNATOOL软件将测定的 CP基因序列与 GenBank中 PVY的代表株系进行分析比
较 , 这些株系的基因库登录号分别为 : PVYO : U09509; PVYN : AY166867; PVYMN : AF463399;
PVYNTN : AY166866; PVY2CHU: U25672; PVY2ZHJ: AY512655; PVY2ZHOU: X54058, 其中 PVY2CHU、
PVY2ZHJ和 PVY2ZHOU株系为我国株系。利用建立的 PVY RT - PCR检测技术体系 , 进行马铃薯脱毒试
管苗的 PVY检测 , 为了节约成本 , PCR的反应体积缩小到 1215μL。
2　结果分析与讨论
211　PV Y C P基因 PCR检测结果
PCR产物经 5%聚丙烯酰胺凝胶电泳 , 可见
一条约 018 kb的特异性扩增带 (图 1) , 与 PV Y
CP基因大小一致 , 阴性对照无特异带扩增。
212　PV Y C P基因克隆和序列分析
序列测定表明 , 所克隆的 CP基因片段大小
为 801 bp, 编码 267氨基酸组成的外壳蛋白分子
量为 2919 kD , 其中 N端含有蚜虫传播所必需的
保守 DAG (A sp2A la2Gly) 序列。说明所克隆的基
因为 PV Y CP 基因 (国际基因库登录号 : PVY2
HBE I, AY660662)。
应用 DNATOOL分析软件将 PVY2HBE I与基
因库中代表株系的 CP基因进行序列比较 , 结果
图 1　5%的聚丙烯酰胺凝胶电泳 RT - PCR检测结果
M: 200 bp Marker (2000, 1000, 800, 600, 400 bp) ;
1, 2, 4: 样品 ; 3: 阴性对照。
F ig. 1　Results of RT - PCR detection by electrophresis
ana lysis in a 5% polyacrylam ide gel
M: 200 bp markers (2000, 1000, 800, 600, 400 bp) ;
1, 2, 4: Samp les; 3: Negative control.
核苷酸序列与 ZHJ、CHU、O、 ZHOU、MN、N、NTN 的同源率分别为 9818%、9719%、 9713%、
9619%、9018%、9012%、8916% , 氨基酸序列的同源率分别为 9815%、9616%、9718%、9718%、
9414%、9316%、9316%。它们之间的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为 8916% ～9818%和
9313% ～9815% , 说明 PV Y CP基因具有高度的保守性 , 与国内 PVY2CHU、 PVY2ZHJ和 PVY2ZHOU
株系的氨基酸序列同源性分别为 9616%、9815%和 9718% , 与 PVYO和 PVYN 株系的氨基酸序列同源
性分别为 9718%和 9316% , 说明 PVY2HBE I与 PVYO 的亲源关系要比 PVYN 的亲源关系近 , 因此将其
归类为 PVYO 株系 ( PVY2ZHJ和 PVY2ZHOU实际上也属于 PVYO 株系 )。PV Y CP基因虽然具有高度
的保守性 , 但也存在一定的差异 , 主要表现在基因的 5pi端 , 在氨基酸序列中主要出现在 N端 , 说明
环境自然选择压力和寄主互作对 PVY的基因组变异具有一定的影响。
213　应用结果
对河北科润公司的一批马铃薯脱毒苗进行了 PVY检测 , 同时设置了阴性和阳性对照 , 结果表明
所检测的脱毒苗阳性率约 7%左右 , 所建立的 PVY RT - PCR技术体系可应用于生产中。目前病毒分
子检测主要采用分子杂交和 PCR法 , 分子杂交法操作繁琐 , 要求检测者具有较高的技术水平 , 且一
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般用放射性标记探针 , 非放射性地高辛标记探针价格较高而不易采用。由于 PCR具有灵敏度高、特
异性强、快速简便等优点 , 因此这一方法是病毒分子检测的首选方法 , 目前美国著名的 AGD IA公司
已提供了一些病毒的 PCR检测试剂盒。最近 N ie等利用 m2RT - PCR技术同时检测出复合感染的 PL2
RV、PVY、PVX、PVA、PVS和 PSTVd等病毒〔2〕, 大大降低了检测的成本和检测时间 , 并提高了检
测的速度和灵敏度 , 这是马铃薯病毒检测的重要突破 , 国内应加强这方面的研究 , 为脱毒种薯生产提
供灵敏和便宜的检测手段。
参考文献 :
1　吴志明 , 贾晓梅 , 谢晓亮. 马铃薯纺锤块茎类病毒 RT - PCR检测及全序列分析. 华北农学报 , 2003, 18: 63～65
W u ZM, J ia X M, Xie X L. Detection of potato sp indle tuber viroid by RT - PCR and analysis its comp lete sequence. Acta Agriculturae Bore2
ali2Sinica, 2003, 18: 63～65 ( in Chinese)
2　N ie X, Singh R P. A novel usage of random p rimers formultip lex RT - PCR detection of virus and viroid in aphids, leaves and tubers. Journal
of V irologicalMethods, 2001, 91: 47～57
收稿日期 : 2004 - 09 - 16; 修回日期 : 2005 - 01 - 11
光照对水培风信子根系生长的影响
韩 　鹰 1 　王 　忠 2 　朱旭东 1 　 (1 苏州农业职业技术学院 , 苏州 215008; 2 扬州大学农学院 , 扬州 225009)
The Effects of L ight on the Root Growth of Hydropon ic Hyac in th
Han Ying1 , W ang Zhong2 , and Zhu Xudong1 (1 Suzhou Polytechn ica l Institu te of A gricu lture, Suzhou 215008, China;
2A griculture College, Yangzhou U niversity, Yangzhou 225009, Ch ina)
关键词 : 风信子 ; 水培 ; 负向光性 ; 光照 ; 根
中图分类号 : S 68212 + 9　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2005) 0220326201
水培花卉的根系常在有光条件下生长 , 但有关光照对植物根系生长影响的研究很少 , 本文观察了水培风信子根系
在定向光条件下的生长特性 , 研究了不同光强、光质对根系生长发育的影响 , 旨在为水培风信子的栽培技术及产品开
发提供实践指导 , 同时为根系的向光性研究提供理论依据。
材料与方法
2003年 11月下旬将风信子 (Hyacinthus orientalis L. blue daft) 的种球 (周径 16 cm左右 ) 水培 , 温度 10～15℃,
每 3 d换 1次水。将水培的种球置于 9个黑色纸箱内 , 每箱 3个 , 待根长至 3 cm左右开始光照处理。在纸箱的一侧开圆
孔 , 使小孔正对着水培玻璃瓶 , 用聚光灯照射 , 在纸箱内形成单侧光照射环境。设 25、40、60、80μmol·m - 2 ·s- 1 4个
光强处理 , 在 25μmol·m - 2 ·s- 1下设 44116、488、532、632、670 nm 5种光质处理。在水培玻璃瓶上套上黑色塑料袋作
为暗处理对照。用塑料皮线套套住选定根的根尖 , 作为根尖遮光处理。每种球上分别选取 5条根进行根尖处理 , 包括
去根尖、去根冠 (高倍解剖镜下进行 )、根尖分开、根尖遮光。另选 5条根每 2～3 d测量其根长、根粗、根数 (3个
种球的平均数 )。同时用数码相机拍摄记录根生长弯曲情况 , 在数码图像上测量根生长倾斜角度 (根处理前生长方向
与处理后生长方向的夹角 )。配制不同浓度的 IAA溶液作为培养液 , 观察 IAA对光照处理后根生长的影响。
结果与讨论
试验结果表明 , 光照处理 3 d, 水培风信子根开始作出负向光性反应 , 一周后负向光性生长最明显 , 以后随着根
的伸长 , 负向光性弯曲角度又逐渐变小。而暗处理对照、去根尖及根尖分开均没有负向光性生长表现 , 去根尖只有少
量伸长生长 , 根尖分开则有不规则扭曲生长。值得注意的是 , 去根冠后 , 根开始只有垂直生长 , 待根冠修复后又能表
现负向光性生长 ; 同样 , 根尖遮光后 , 开始保持垂直生长 , 在根尖伸出皮线套 2～3 mm以后 , 又可观察到根的负向光
性表现。通过根尖处理研究 , 可以基本确定水培风信子根负向光性反应的作用部位在根冠。另外 , 我们将已出现负向
光性生长的水培风信子根 , 反向照光 , 结果发现 3 d后原来弯曲的根逐渐扭转角度 , 一周后表现另一方向的负向光性
生长 , 使根出现 “S”型形状。利用这个生长特性 , 可以对水培风信子根系进行弯曲造型 , 提高其观赏价值。
不同光强处理后表明 , 随着光强的增加 , 水培风信子根的伸长生长受到抑制 , 根数减少 , 但根粗增加 , 根的负向
光性倾斜角度也增加。在相同光强条件下 , 不同光质对水培风信子的根长、根粗及根数无明显影响 , 但蓝光 (44116
nm, 488 nm) 对根负向光性诱导最明显 , 绿光 (532 nm) 也有效 , 橙红光 (632 nm, 670 nm) 则无效。不同浓度 IAA
溶液培养风信子 , 结果表明 , 01001 mg·L - 1 IAA可以明显抑制根的伸长而使根的负向光性倾斜角明显 , 而且在根尖
弯曲处有明显的球状膨大现象。0100001 mg·L - 1 IAA可以明显促进根的伸长 , 而使负向光性倾斜角度减小 , 并使发
根数明显增加 , 但根稍细。
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