全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第5期
收稿日期:2008-07-11
基金项目:“十一五”国家科技支撑计划重大项目“农药、兽药抗体库建立”资助(2006BAK02A21/1)
作者简介:张海棠(1966-),女,河南偃师人,副教授,研究方向:动物营养与饲料科学;E-mail:zhanght_1966@yahoo.com.cn
通讯作者:王自良(1966-),教授,博士,研究方向:食品安全生物技术;Tel:0373-3693196,E-mail:wangzl_2008@yahoo.com.cn
克伦特罗即“瘦肉精”(clenbuterol,CL)是苯乙醇胺类 β2-肾上腺素受体激动剂,在生猪生产中使用较为
普遍,具有营养重分配作用,能改善猪的营养代谢,降低胴体脂肪,提高瘦肉率、增重效果和饲料报酬[1]。但
CL在猪肉食品中的残留对食用者具有心脏、神经等危害[2],世界各国均禁止将 CL用于生猪生产。但由于
高亲和力克伦特罗单克隆抗体的研制及免疫试纸
检测方法的建立
张海棠 1 王自良 1 刘玺 2 钟华 1 范国英 1
(1河南科技学院动物科学学院,新乡 453003;2河南科技学院食品学院,新乡 453003)
摘 要: 重氮化法将克伦特罗(CL)偶联于BSA合成免疫抗原BSA-CL,戊二醛法(GA)合成包被抗原OVA-CL,用
BSA-CL免疫Balb/C小鼠。细胞融合技术建立高亲和力CL单克隆抗体(CLmAb)杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备
CLmAb,并测定其亲和性。依据胶体金免疫层析试验(GICA)原理,应用CLmAb研制CL残留快速检测免疫试纸(CL-
Strip),并测定其性能。结果表明,筛选出 16株杂交瘤细胞,其中亲和力最高的为 3C12-6H6,亲和常数(Ka)为 1.76×1010
L/mol。CL-Strip的标准曲线呈典型的S型,符合4参数logit曲线拟合,目测检测限为0.5μg/L;其敏感性与竞争ELISA试
剂盒和GC/MS相当,符合率为100%。CL-Strip具有具有敏感、特异、快速、简便的特点,可推广应用于CL残留的快速检
测。
关键词: 克伦特罗 细胞融合 单克隆抗体 胶体金免疫层析试验 快速检测试纸
GenerationofHighAfinityMonoclonalAntibodyand
DevelopmentofColoidalGold-LabeledStripfor
RapidDetectionofClenbuterol
ZhangHaitang1 WangZiliang1 LiuXi2 ZhongHua1 FanGuoying1
(1SchoolofAnimalScience,HenanInstituteofScienceandTechnology,Xinxiang453003;2SchoolofFoodScienceand
Technology,HenanInstituteofScienceandTechnology,Xinxiang453003)
Abstract: Thediazotizationmethodwasusedtoconjugateclenbuterol(CL)tobovineserum albumin(BSA)to
prepareartificialimmunogenBSA-CL,andtheglutaraldehyde(GA)methodwasusedtocoupleCLtoovalbumin(OVA)to
preparecoatingantigenOVA-CL.Balb/CmicewereimmunizedwithBSA-CL.Hybridomalinesthatsecretehighafinity
monoclonalantibodyagainstCL(CLmAb),werefilteredwithcelfusionandtheafinityofCLmAbwerecharacterized.
Baseontheprincipleofgoldimmunochromatographyasay(GICA),astriptfordetectionCL(CL-Strip)wasdeveloped
anditstraitsweretested.Theresultsshowedthatsixteenhybridomalineswerefilteredandthebestonewas3C12-
6H6,whichhasahighafinityconstant(Ka)with1.76×1010L/mol.ThecalibrationcurveofCL-Strip,astypicalsigmoid
curve,fitedtothefourparameterlogistic,withdetectionlimit0.5μg/LandthesensitivityassameasthatofELISA-Kit
andGC/MS,thecoincidenceratewas100% comparedwithELISA-KitandGC/MS.TheCL-Stripposesedrapidity,
sensitivity,specificityandbriefnes,thusitwasprovedtobeusedfortherapidtestofCLresiduesinanimalfood.
Keywords: ClenbuterolCelfusion Monoclonalantibody Goldimmunochromatographyasay Rapidteststrip
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第5期
利益驱动和缺乏快速、简便的检测技术,致使不能及时有效监控,CL中毒事件屡有发生[3,4],鉴此,急需建立
快速、简便、敏感、特异、经济的检测方法。应用细胞融合技术在建立 CL单克隆抗体(CLmAb)杂交瘤细胞
株的基础上,根据胶体金免疫层析试验(GICA)原理,在国际范围内率先成功研制出 CL残留快速检测免疫
试纸(CL-Strip),并对其性能进行了测定。
1 材料与方法
1.1 材料
SPF级 Balb/C小鼠购自郑州大学医学院;小鼠骨髓瘤细胞株 NS0由英国国家动物健康研究院惠赠;
CL,纯度≥99.0%,Sigma公司产品;弗氏佐剂 CFA、IFA,Pierce公司产品;细胞培养基 RPMI-1640、HAT、HT
和 PEG-4000为 Gibco公司产品;氯金酸(HAuCl4·3H2O),柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O),上海化学试剂公司
生产;人工免疫原 BSA-CL(重氮化法)、包被抗原 OVA-CL(戊二醛法)、兔抗鼠 IgG(RaMIgG)、兔抗鼠酶标
二抗(RaMIgG-HRP)和酶标半抗原(HRP-CL)为本课题组制备;其它试剂市售所得,AR级。AE90硝酸纤维素
膜(NC膜)、支持板、吸水纸、玻璃棉和胶膜均为德国 S&S公司产品。
1.2 高亲和力杂交瘤细胞株的筛选
1.2.1 细胞融合备用小鼠的制备 用 BSA-CL免疫 6周龄雌性 Balb/C小鼠 2批,每批 5只,免疫剂量按
BSA-CL中 BSA的量计算,每只 50μg,体积为 0.2ml,背部皮下分点注射,免疫程序参见王自良等的报道[5]。
最后 1次免疫后第 10d断尾采血,间接 ELISA检测 CL抗体效价,阻断 ELISA检测抗 CL抗体抑制效价,选
择 CL抗体效价<1∶1600且抑制效价最低的小鼠进行细胞融合。
1.2.2 阳性杂交瘤细胞株的筛选 细胞融合按常规技术操作。融合后 10～14d用间接 ELISA、阻断 ELISA
和竞争 ELISA进行阳性杂交瘤细胞筛选,选择强阳性、抑制率高和细胞生长旺盛的孔有限稀释克隆化,而
后扩大培养、冻存并进行鉴定。
1.2.3 CLmAb的制备 体内诱生腹水法[6]。
1.2.4 CLmAb的亲和常数测定 参照 Baty[7]所述饱和 ELISA方法测定亲和常数(ka)。
1.3 CL-Strip的研制
1.3.1 胶体金的制备 柠檬酸钠还原法[8]。
1.3.2 金标抗体的制备 Mey氏系列稳定法[9]。
1.3.3 金标抗体玻璃棉的制备 裁取 20×4mm的玻璃棉,将金标抗体用 X-only单向喷点仪均匀喷洒于玻
璃棉上,37℃干燥 1h,密封,4℃保存备用。
1.3.4 NC膜的制备 将浓度为 1mg/ml的 BSA-CL放于 X-only单向喷点仪贮存池 A,浓度为 1mg/ml的
RaMIgG放于贮存池 B,开机后将 BSA-CL和 RaMIgG分别点射于膜中央,形成间距 0.5cm的检测线(T线)
和质控线(C线),自然干燥,密封,4℃保存备用。
1.3.5 试纸的组装 将支持板、NC膜、金标抗体玻璃棉、吸水纸及胶膜按一定工艺组装到一起,用 CM4000
切割机切割,密封,4℃保存备用(图 1)。
1.3.6 检测方法的建立 将浓度分别为 0、0.01、0.03、
0.09、0.27、0.81和 2.43μg/L的 CL标准品加到 CL-Strip
样品垫上,静置反应 5min,用 BioDot-TSR3000读条
仪读取 T线扫描面积光密度的相对光密度值(ROD),
以不同浓度标准品 ROD与空白标准品 ROD的百分
率(η=ROD标准品/ROD空白标准品×100%)为 y轴,以不同
标准品浓度的对数值 lg[C]为 x轴,在半对数坐标纸
上绘制标准曲线,推导回归方程,进行回归分析。根据试验结果并参照 Joon等[10]的方法,取 η=50%为目测
图 1 检测试纸组装示意图
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敏感度,即 CL-Strip的检测限。
1.4 CL-Strip的性能测定
1.4.1 敏感性 用 CL-Strip测定浓度分别为 0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0和 100μg/L的
CL标准品,每个浓度设 6个重复,根据试验结果判断其敏感性。
1.4.2 重复性 取不同批次的 6批 CL-Strip,分别在 6d对 CL浓度为 0.1、0.5、1.0和 2.0μg/L的饲料样、猪
尿样、猪肉样进行检测,每个浓度设 6个重复,检验其重复性。
1.4.3 符合试验 用 CL-Strip、竞争 ELISA试剂盒、GC/MS对浓度为 0、0.5和 1.0μg/L的饲料样、猪尿样、
猪肉样进行检测,每个浓度设 6个重复,测定其符合率。
2 结果与分析
2.1 细胞融合备用小鼠的制备
免疫的 10只小鼠血清 CL抗体效价均达到了 10-3,说明获得了较好的免疫效果,其中 2号、3号、5号
和 8号小鼠效价达到了 1∶6.4×103,且对 CL抑制效果较好。因此,选为细胞融合备用小鼠(图 2和图 3)。
图 3 小鼠多抗血清阻断 ELISA抑制效价图 2 小鼠多抗血清间接 ELISA效价
2.2 杂交瘤细胞株的筛选
经过 2次 4只小鼠的细胞融合,间接 ELISA、阻断 ELISA和竞争 ELISA筛选出 16株高价、敏感、特异
的杂交瘤细胞,经多次传代、冻存及复苏,杂交瘤细胞分泌抗体稳定。
2.3 CLmAb的亲和力测定
分别测定 16株杂交瘤细胞分泌 CLmAb的 Ka,亲和力最高的是 3C12-6H6,Ka为 1.76×1010L/mol。依
据 James等[11]的结论,3C12-6H6所分泌的 CLmAb为高亲和力抗体
(图 4)。
2.4 检测方法的建立
BioDot-TSR3000读条仪对不同 CL标准品机读结果见图 5。根据不
同浓度 CL的显色结果和对应的 ROD,绘制出 CL-Strip的标准曲线(图
6)。图 6可知,CL-Strip的标准曲线呈典型的 S型,符合 4参数 logit曲
线拟合,回归方程为 y=-32.06x+37.89,(R2=0.9896),η=50%时,曲线方
程对应的 CL浓度为 0.42μg/L,即目测灵敏度为 0.42μg/L,考虑到实际
检测工作的需要和用户操作方面的误差,其目测检测限确定为 0.5μg/L。
2.5 CL-Strip的性能测定结果
2.5.1 敏感性 由表 1可知,CL-Strip的目测检测限为 0.5μg/L。
2.5.2 重复性 由表 2可知,不同批次的 6批 CL-Strip对饲料样、猪尿样、猪肉样的检测结果完全一致,证
明不同批次生产的 CL-Strip检测结果稳定可靠,具有良好的重复性。
2.5.3 符合试验 CL-Strip与 ELISA试剂盒和 GC/MS的敏感性相当,结果完全一致,符合率为 100%
(表 3)。
图 4 CLmAb的亲和常数测定曲线
张海棠等:高亲和力克伦特罗单克隆抗体的研制及免疫试纸检测方法的建立 151
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第5期
3 讨论
3.1 CL杂交瘤细胞的筛选方法
成功筛选高质量的杂交瘤细胞需要建立可靠的筛选体系,对该体系的要求有 3点,一是能够准确测定
细胞培养上清的效价;二是能够排除存在的桥抗体;三是能够确定 mAb的特异性。为此,本研究同时采用
间接 ELISA、阻断 ELISA和竞争 ELISA筛选阳性杂交瘤,用重氮化法偶联的 OVA-CL作为包被原的间接
ELISA法测定细胞培养上清的效价,用 GA法偶联的 OVA-CL作为包被原的间接 ELISA法排除存在的桥抗
体,阻断 ELISA和竞争 ELISA确定阳性杂交瘤细胞对 CL的识别能力,从而筛选出了效价高、无桥抗体和
特异性强的杂交瘤细胞。
图 5 CL标准品机读相对光密度曲线图 图 6 检测试纸的标准曲线
表 1 检测试纸敏感度试验
表 2 不同批次检测试纸重复性试验
表 3 检测试纸与 ELISA试剂盒检出试验结果的比较
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2008年第5期
3.2 CLmAb的亲和力测定
抗体亲和力对抗原和抗体间作用最本质的描述,常以亲和常数 Ka表示,测定小分子半抗原所产生特
异性抗体的 Ka常采用的方法是平衡透析法和 Baty饱和法。平衡透析法是最经典的方法,该法的全部抗原
抗体反应过程在均一液相体系中完成,反应的动力学过程受到的干扰因素较少,基本上完全符合质量作用
定律的前提条件要求。但该法要求将反应底物进行放射性标记,反应完成后又需将抗原抗体复合物与游离
抗原抗体分开,试验过程繁琐复杂,不易广泛开展,目前已不多用[12]。Baty饱和法不受抗原分子量大小的
限制,操作简便,结果准确。本试验采用 Baty饱和法测定 CLmAb的 Ka为 1.76×1010L/mol,按照 James等[11]
的理论,所用 CLmAb为高亲和力抗体。
3.3 与其它检测方法的比较
综合评价结果见表 4。CL-Strip、ELISA试剂盒和 GC-MS均具有较高的灵敏性。加标测定试验与应用符
合实验结果表明,3种方法均具有较好的准确性。从简便性和劳动量看,CL-Strip不局限检测地点,可进行
现场检测,不需要任何附加设备与试剂,不作任何专业程度限制,人人均可操作,结果直观,只需根据颜色
深浅判定即可。ELISA试剂盒需要附加试剂和特殊的试剂保存温度,需要专业技术人员操作。GC-MS则必
须在实验室进行,需要昂贵的仪器和特殊的试剂,只有专业人员才能操作,且工作量大。从检测时间看,CL-
Strip只需 5min便可得到检测结果,ELISA试剂盒需要 3h,而 GC-MS需耗时约 72h;从检测成本看,GC-MS
是 CL-Strip的 20倍。
参考 文献
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