全 文 ：64 草 业 科 学 24卷 8期
8/2007 PRAT ACULT URA L SCIENCE Vol.24 , No.8
苜蓿原生质培养及体细胞杂交技术的应用
马晖玲1 , 2 ,卢欣石1 , 曹致中2
(1.北京林业大学资源环境学院 ,北京 100083;2.甘肃农业大学草业学院,甘肃 兰州 730070)
摘要:阐述了植物原生质体培养和体细胞杂交技术以及苜蓿 Medicago spp.体细胞胚胎发生特性 , 综述了该
技术在苜蓿育种研究中的应用状况 ,同时介绍了我国苜蓿研究领域原生质体培养和体细胞杂交技术的研究
进展 。
关键词:原生质体培养;细胞融合;体细胞杂交;苜蓿
中图分类号:S551+.702;S551+.703 文献标识码:A 文章编号:1001-0629(2007)08-0064-05
1 苜蓿的生态价值和农艺价值＊
苜蓿 Med icago spp.属豆科多年生草本植
物 ,是世界上最重要的饲料作物。中国是亚洲最
大的苜蓿生产国 ,居世界第 5位 , 同时也是世界
苜蓿遗传资源最丰富的地区之一。卢欣石[ 1] 研究
表明 ,中国是世界苜蓿遗传资源的变异中心之一 ,
也是苜蓿遗传多样性极为丰富的国家之一。
苜蓿适口性好 ,蛋白质等营养物质含量高 ,品
质优良 ,主要用作家畜饲草;其根系发达 ,能吸收
土壤深层的水分和养分 ,还可以减少地表径流 ,减
轻冲刷 ,起到保持水土流失的作用;作为豆科植物
其具有生物固氮功能 ,可以改良土壤肥力 、性质和
结构 ,所以在栽培套种中 ,可以作为前茬来提高后
茬作物的产量和品质;还作为食用蔬菜 、蜜源植物
和干草产品 ,被应用在多个方面。正因为其广泛
的应用性和优良的农艺特性受到了世界各国学者
和研究人员的普遍关注 ,从苜蓿的形态特征 、分类
学 、细胞学 、对环境的适应性和抗逆性 、苜蓿根瘤
菌及其应用 、营养价值及其加工利用 、栽培技术 、
种质资源及育种等方面以不同层面 、采用不同的
研究手段进行全面的研究和开发。随着现代生物
科学的迅速发展 ,系统地了解和整理苜蓿种质资
源 ,利用细胞工程和基因操作技术对苜蓿的品种
进行改良和优化 ,都是目前苜蓿研究领域的热点
和新方向 。
2 苜蓿的体细胞胚胎发育特征
苜蓿不仅具有优越的生态价值和农艺特性 ,
而且在科学研究方面 ,是一种应用广泛的极好
的实验材料 ,是从遗传学角度研究体细胞胚胎
发生的常见植物种[ 2] , 是一种典型的具有体细
胞胚胎发生途径的植物材料 。苜蓿的叶片 、叶
柄 、胚轴等外植体可以直接形成体细胞胚 ,也可
以通过愈伤组织或悬浮细胞培养形成 。苜蓿的
这种发育特性是其原生质体培养和体细胞杂交
以及苜蓿转基因技术应用成败的理论基础和关
键环节 。具有良好的体细胞胚胎发育系统才能
有良好的原生质体培养再生系统和基因转化
系统 。
2.1 体细胞胚及其发生 体细胞胚是由植物
营养器官或细胞经离体培养产生的一种类似于自
然种胚(合子胚)的结构。具有明显胚根和胚芽双
极性结构 ,且萌发和再生成小植株的能力较高。
体细胞胚的发育相同于天然种子的胚。体细胞胚
的形成无需合子胚形成时所必需的受精过程 ,但
体细胞胚缺乏种皮和胚乳 。
自1958年 Reinert等[ 3] 报道体细胞胚技术后 ,
体细胞胚再生技术已广泛应用于各种植物中 ,供体
来源包括花粉 、叶肉 、叶柄 、茎 、根 、原生质体[ 4] 。
＊收稿日期:2007-05-12
基金项目:科技部国家转基因植物研究与产业化专项:苜蓿
等牧草抗旱 、耐盐碱转基因新品种培育(J00-B-
001-12);国家科技部“十五”重大科技专项:优质
饲草高效生产关键技术研究与产业化开发
(2002BA518A03)
作者简介:马晖玲(1966-),女(回族), 甘肃兰州人 , 副教授 ,
博士 , 主要从事牧草 、草坪草育种的研究。 E
m ail:m ah l@gsau.edu.cn
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植物体外再生技术(包括器官发生途径和体
细胞胚发生途径)是生物技术应用的基础和前提 ,
利用植物细胞的全能性 ,通过体细胞无性系变异
而产生植物的遗传变异 ,或将诱导体细胞胚发生
的技术用于植物的遗传转化 ,或进行一些优良物
种的扩繁 ,这都是非常有效的尝试和应用 。虽然
在这些方面的研究中植物器官发生也是另一条应
用途径 ,但是体细胞胚发生途径更能保证转基因
植物的遗传一致性(不形成嵌合体),外源基因再
通过花粉和配子而传递到后代中 。因此 ,体细胞
胚再生技术广泛应用于植物遗传转化 、细胞工程 、
体细胞变异系的筛选和需要高度遗传一致性的植
物的单系繁殖和扩繁中[ 5] 。
2.2 苜蓿体细胞胚发生技术的应用 现已
普遍认为紫花苜蓿M.sativa形成体细胞胚的能力
是由其基因型决定的[ 6 , 7] 。目前诱导苜蓿体细胞胚
发生的培养基已较丰富和完善[ 8 , 9] 。研究表明 ,再
生能力好的种质一般都包含有黄花苜蓿 M. fal-
cata的遗传背景 。在组织培养过程中对 Regen-2X
(来自于栽培品种 Rangelander)选育的研究发现 ,
体细胞胚再生能力的强弱是由其基因所决定的 ,如
把三倍体苜蓿中控制体细胞胚再生能力的基因通
过杂交手段转移到子代杂合体中 ,使育成的二倍体
的 Regen-2X具有高频再生的能力[ 10] 。研究表明 ,
把具有良好的体细胞胚再生能力和遗传稳定性的
品种与不具有再生能力的苜蓿品种杂交 ,使再生能
力弱的品种能够获得较高的再生性能[ 11] 。在苜蓿
中形成体细胞胚的能力是由2个独立的 、互补的显
性基因所控制的[ 12-15] 。Yu和 Pauls[ 16] 通过 RAPD
分析 ,找到了控制苜蓿体细胞胚形成的相关基因的
分子标记。如若获得与苜蓿体细胞胚形成相关的
基因 ,将控制苜蓿体细胞胚发生的相关基因进行分
离 、克隆 ,再把这样的基因与抗逆 、抗病或优质高产
的目的基因构建成双价的嵌合基因 ,一并转化到体
细胞胚较难发生 、植株再生能力弱的植物中 ,达到
品种改良的目的 ,这是一项很有理论意义和实践价
值的创新性工作。
植物原生质体能否培养成功的关键在于某个
植物品种的基因型 ,而这种基因型其体细胞胚胎
发生能力的强弱决定了该植物品种是否适宜于进
行原生质体培养技术的应用和再生出体细胞杂交
植株来。苜蓿具有突出的体外胚胎发育特征 ,因
此 ,研究其原生质体培养和体细胞杂交 ,可改良苜
蓿品种特性。
3 原生质培养和体细胞杂交技术在苜蓿
研究中的应用
3.1 原生质培养和细胞融合
3.1.1植物原生质体培养 植物原生质体是一种
具有特殊意义的生物技术 。原生质体是脱去细胞
壁的一个由质膜包裹着的裸露细胞 。由于除去了
细胞壁 ,原生质体可以摄入细胞器 、微粒体 、病毒
以及一些大分子物质 ,如 DNA 等 。这为遗传物
质的导入和表达研究提供了机会 ,易于在控制的
条件下进行准确的操作及进行转化体和重组体的
分析 。脱去细胞壁的植物原生质体仍然保留着细
胞的全能性 ,在控制条件下可再生成完整植株 ,进
行无性繁殖。这些特点对植物的转基因研究尤为
重要 ,所以说原生质体培养系统是植物基因转化
的理想的受体系统。
不同植物的原生质体可以在诱导的条件下彼
此融合 ,原生质体质膜之间可以交换信息 ,这为细
胞膜及细胞核信息传递的研究带来极大的便利 ,
成为分子水平和细胞水平上研究遗传信息动态的
结合点 ,同时也成为研究植物生长调节 、代谢及其
他植物生理过程的有利材料。
原生质体的特性使之在遗传变异的研究中发
挥着独特而有效的作用。如苜蓿等一些遗传上异
源或多倍体植物 ,其同一个个体来源的体细胞中
往往会产生无性分离的现象 ,同时培养过程中会
发生体细胞变异 ,原生质体培养为分离其中的有
用变异提供了机会。
自 1960年英国学者 Cooking 首次采用酶法
游离原生质体 , 用从疣孢漆斑菌 Myrothecium
verrucaria 中提取的粗制酶游离出番茄幼根原生
质体 。植物原生质体可在适宜的条件下再生出完
整的植株 。根据这一特性 ,植物原生质体一方面
可用来筛选突变体 ,进行优良品种的培育 ,另一方
面可用来进行细胞融合和基因转化[ 17] 。现有百
余种植物如小麦 Tri ticum aestivum 、玉米 Zea
mays 、水稻 Oryz a sat iva 、大豆 Glycine max 、苜
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蓿等重要农作物的原生质体再生植株成功。
3.1.2细胞融合 原生质体无细胞壁 ,在化学 、物
理或自发性作用下 ,原生质体之间可以进行细胞
的融合而获得体细胞杂种 。体细胞杂交技术给植
物不同种 、属乃至科的遗传物质的交流提供了可
行的途径和方法 ,克服杂交不亲和而导致的生殖
屏障 。应用这一技术可以获得采用传统育种方法
无法取得的杂种新植株。原生质体培养和细胞融
合技术经过几十年的发展和完善 ,已在一大批植
物上得以应用并取得了成功[ 17] 。细胞融合技术
作为一种具有极大应用潜力的生物技术 ,在创建
新材料 、克服杂交不亲和障碍 、优良品种改良重组
方面是很有实效的技术。
原生质体融合技术包括:诱导原生质体融合 、
选择杂种细胞和杂种植株的再生和鉴定 3 个环
节。原生质体融合的方法中最早采用的是硝酸钠
法 ,后发展了 PEG诱导法和电融合法。目前的研
究中普遍使用后 2种方法 。
融合后将杂种细胞与未融合的 、同源融合的
亲本细胞区分开 ,筛选的依据之一是杂种细胞显
示出隐性突变的遗传互补和体外生长需求的生理
互补 。包括叶绿素缺失互补 、营养缺陷互补和抗
性互补 , 前两种为隐性性状 , 后一种为显性性
状[ 18] 。另外物理特性差异选择法 、生长特性差异
选择法也是常用的筛选方法。
通常采用形态学鉴定法 、染色体鉴定法和同
功酶谱鉴定法进行杂种细胞的鉴定 。
3.1.3体细胞杂交技术 植物体细胞杂交是指通
过原生质体融合和异核体的培养产生体细胞杂种
的技术。
依据融合的双亲系统关系的远近 ,或融合和
杂种细胞筛选方法的不同 ,可以产生 3 种类型的
体细胞杂种:核杂种 、非对称杂种和胞质杂种 。核
杂种是由双亲完整原生质体融合 ,所有遗传物质
均匀混合和重组形成的对称杂种。他们往往可以
形成遗传稳定的异源双二倍体 ,种内和一部分种
间体细胞杂交植株常属于这种类型 。非对称杂种
是由于一方亲本染色体或胞质基因组的排除而形
成。有性不亲和的远缘种间 、属间甚至科间细胞
融合产物中常会产生这种杂种[ 19] 。
已发展出若干诱导形成“不对称杂种”的技
术 ,即通过射线或其他化学因素处理 ,使双亲一方
的核失活 ,再促使双方的原生质体融合 ,从而造成
一方的核不参与融合 ,或仅其中的一部分基因转
移到对方的情况。这类不对称杂种可以通过反复
回交和其他的育种手段 ,逐步改造成遗传上有用
的亲本材料 ,这些方法已证明在转移细胞质基因
(如细胞质雄性不育因子)、一些抗病基因以及叶
绿体编码的基因(如抗阿特拉津除草剂的基因)等
方面非常有效[ 17] 。近年来在植物生殖细胞上 ,通
过四分体原生质体与体细胞原生质体融合获得三
倍体杂种 。
体细胞杂交的主要目的在于选育出有价值
的植物新品种 。体细胞杂交应用于经济作物的
遗传改良可为农业和畜牧业生产带来显著的效
益。不同种 、属间的体细胞杂交 ,可以将双方亲
本的染色体组合在一起 ,形成杂合的二价体 ,来
自不同种 、属的亲本形成的杂种细胞如果可育 ,
并能稳定遗传 ,则可形成有价值的植物新品种 。
如若将栽培品种与抗多种病虫害的野生种作为
亲本 ,经过原生质体融合 、选择和植株的再生 ,
可获得具有优良抗病性能的体细胞杂交新品
种。原生质体培养和体细胞杂交技术在植物育
种上的有效应用以及与其他遗传育种技术的结
合 ,为未来新型农业的发展开辟了一条广阔的
途径 。
3.2 原生质体培养和体细胞杂交技术在苜
蓿遗传育种中的应用 在苜蓿中 ,应用原生
质体培养和体细胞杂交技术进行优良品种的选
育 ,美国 、加拿大 、日本 、新西兰 、荷兰 、丹麦等国
家已广泛开展着该项研究并取得了研究上的突
破 ,研究体系较完善 。在苜蓿中经原生质体培
养阶段获得再生植株的报道比较多[ 20-24] 。在近
缘种之间的体细胞杂交方面 ,也有大量的研究
报道 ,研究者试图将抗性性状从野生种中转移
到栽培种中 。Damiani等[ 25] 用电激法诱导苜蓿
和木本苜蓿(即树苜蓿 M.arborea)的原生质体
融合 ,产生了 9%的异核体 ,经培养后发育成愈
伤组织;Gilmour 等[ 2 6] 通过苜蓿和北方苜蓿
M.borealis原生质体的融合得到了体细胞杂种
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愈伤组织;Deak等[ 27] 从抗卡那霉素的杂花苜蓿
M.varia植株无菌苗分离到原生质体 ,并将其与
抗PPT 的苜蓿培养细胞的原生质体进行融合 ,
后者带一扩增的谷氨酰胺合成酶基因 ,结果在
杂种细胞中测到扩增的谷氨酰胺合成酶基因和
NPT Ⅱ基因 ,二者均得到表达;在 Téoulé 的研究
中得到了苜蓿和黄花苜蓿体细胞杂种植株的
组合[ 28] 。
综观文献报道 ,可以说在苜蓿的原生质体培
养和体细胞杂交方面 ,国内外有着非常成功的研
究基础 ,苜蓿是一种极好的供试材料。
3.3 中国苜蓿原生质体培养和体细胞杂交
技术的应用状况 苜蓿原生质体培养与体细
胞杂交的研究 70年代在我国蓬勃兴起 ,以原生质
体培养为前提的体细胞杂交技术在作物育种中发
挥着重要的作用 。我国苜蓿原生质体培养虽起步
较晚 ,但取得了长足进展 。黄绍兴 、吕德扬等用电
激法将含有GUS基因的质粒直接导入苜蓿原生
质体并得到了转基因植株[ 29 , 30] ;许智宏[ 31] 得到苜
蓿根原生质体的再生植株;白静仁等[ 32] 用黄花苜
蓿叶肉原生质体培养和再生植株成功;在随后的
十几年里 ,研究成果不断出现[ 23 , 24 , 33-36]
据徐子勤和贾敬芬[ 35] 的研究报道 ,通过对苜
蓿与红豆草 Onobrychis viciaef olia 的原生质体
进行融合 ,得到了属间体细胞杂种植株 。红豆草
叶片含有凝缩单宁物质(CT),它对防止反刍类家
畜的臌胀病有重要作用 ,而苜蓿属的植物叶中均
不含 CT 。通过细胞融合 ,把红豆草中合成 CT 的
基因转移到苜蓿中 ,已获得不引起反刍类家畜发
生臌胀病的优良苜蓿 。
金红等[ 36] 以豆科牧草沙打旺 Astragalus ad-
surgens为一亲本 ,用碘乙酰胺处理的紫花苜蓿发
根农杆菌 A -4 菌株转化系为另一亲本 , 通过
PEG-高 pH ,高钙法诱导原生质体融合。在不
加外源激素的 DPD 培养基上有效地筛选了杂种
细胞 。经培养首次得到沙打旺与苜蓿的属间体细
胞杂种。
以上这些工作和研究成果促进了我国苜蓿原
生质体培养和体细胞杂交的研究进程 ,并为苜蓿
育种提供了新的途径 。
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Abstract:The applicat ions of protoplasts culture and somatic hybridization in Medicago spp.breeding
w as review ed by summarizing somatic embryogenesis in somat ic embryos development , pro toplasts
culture and somatic hybridiza tion.The research prog ress o f protoplast culture and somatic hybridiza-
tion in alfalfa in china w as illust rated as wel l in this paper.
Key words:Medicago spp.;somatic embryogenesis;protoplasts culture;cell fusion;somatic hybridization