全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 6期
差异表达基因分离技术的研究进展
高雪
(韩山师范学院生物系 ,潮州 521041)
　　摘 　要 : 　分离并克隆差异表达基因是生命科学的研究热点。近年来 ,以差示筛选、扣除杂交等基本方法为基础 ,先后出
现了抑制差减杂交 ,微阵列技术等多种分析差异表达基因的技术 , 使差异表达基因分离方法不断完善。对这些方法的优缺
点、发展趋势及应用前景进行了简要综述。
关键词 : 　差异表达基因 　差示筛选 　扣除杂交 　mRNA差异显示技术 　RNA指纹图谱技术 　代表性差异分析 　抑制
差减杂交 　微阵列技术
Recent Advances on the M ethods of Selecting
D ifferentia lly Expressed Genes
Gao Xue
(B iology Departm ent, Hanshan N orm al University, Chaozhou 521041)
　　Abs trac t: 　Cloning differential exp ressed genes has become p rime interest in molecular biology1 In recent years, a variety of
methods have been developed for analying differentially exp ressed genes, including differential disp lay reverse transcrip tion2PCR
(DDRT2PCR) , rep resentational difference analysis(RDA) , supp ression subtractive hybridization ( SSH ) and cDNA m icroarray1 This
review described the p rincip les, technical routes, imp roved methods, advantages and defects of these methods1 Moreover, A ssociated
app lications and p rospects in related studies were discussed1
Key wo rds: 　D ifferentially exp ressed gene　D ifferential screening　Subtractive hybridization　DDRT2PCR　RNA fingerp rinting
by arbitrary p rimed PCR　RDA　SSH　M icroarray
收稿日期 : 2008211211
基金项目 :韩山师范学院博士启动基金
作者简介 :高雪 (19722) ,女 ,博士 ,主要从事果蔬采后生理、植物分子生物学等研究 ; E2mail: gaoxue_1@1631com　　生命活动的各个进程伴随着不同基因的选择性开启和关闭。高等真核生物约含有 10万个基因 ,在某一类型的细胞中的特定发育阶段 ,只有 15%的基因表达。这种在生物个体发育的不同阶段、或在不同组织器官中 ,按一定时间和空间 ,基因有序表达的方式称为基因的差别表达 ( differentisl exp ressing) [ 1 ]。基因的这种差异表达不仅受生物体内在机制的调控 ,也受外界环境因素 ,如光照、温度、逆境、药物作用等影响。如何有效地分离克隆在不同发育阶段及不同细胞群体间差异表达的基因 ,成为分子生物学研究的一大热点 ,大量差异基因分离策略相继问世。1　差示筛选差示筛选 ( differential screening)是早期建立的 差异基因筛选方法 ,主要原理是通过核酸探针杂交的方法从 cDNA文库中筛选目的克隆。分别从检测样品和对照样品中提取 mRNA为模板 ,反转录合成cDNA探针 ,两种探针分别杂交同一 cDNA文库 ,仅与一种探针杂交的克隆对应于在该样品中特异表达的基因 ,然后对照杂交结果从原平板中挑出菌落鉴定目的基因 [ 2 ]。但这种方法灵敏度低 ,仅对一小部分能在一种细胞中大量表达、而在另一种细胞中不表达或是表达量极低的基因才能奏效 ,而低丰度的mRNA则难以检测到。2　扣除杂交扣除杂交 ( subtractive hybridization )最初是由Lamar和 Palmer[ 3 ]于 1984年报道的 ,用于分离老鼠
生物技术通报 B iotechnology　B u lletin 2009年第 6期
Y染色体的特异性基因 ,后经多年改进 ,已经发展为
许多基因克隆方法的基础 ,其实质是一种驱动组过
量的杂交方法。主要过程包括从来源相似而功能有
异的两种样品获得 mRNA ,含有目的基因的样品为
检测方 ( Tester) ,不含目的基因的样品称为驱动方
(D river)。检测方 mRNA反转录形成的 cDNA与过
量的驱动方 mRNA进行杂交 ,经两轮充分杂交后 ,
去除双链杂合体 ,富集目的基因 ,建立差减 cDNA文
库 ,筛选目的基因。虽然差减杂交法在理论上极具
吸引力 ,但实际操作较难 ,经过两轮杂交及经基磷灰
石柱层析后 ,所回收的 cDNA量非常有限 ,且存在重
复性差 ,灵敏度低的缺点。
3　m RNA差异显示技术
mRNA差异显示技术 (mRNA differential disp lay
reverse transcrip tion PCR, DDRT2PCR)最早由 L iang和
Pardee在 1992年报道 [4 ] ,是目前应用较广泛的进行
mRNA差异比较的技术 ,能有效检测真核细胞中特定
基因的表达模式 ,因而可以用于发现和克隆新的基因。
它以 PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳为基础 ,根据真核生
物成熟 mRNA的 3′端具有 poly(A)尾的特点 ,用含 Oli2
go (dT) 的寡聚核苷酸作为锚定引物 ,逆转录真核生物
中全部表达的 mRNA。根据 poly(A)序列 (前 2个碱基
除 AA外 )设计合成 12种下游锚定引物 ,利用 3′端锚定
引物与 5′端 20种 10 bp随机引物进行 PCR扩增 ,将
PCR产物直接显示在聚丙烯酰胺凝胶上 ,回收表现差
异的条带进一步分析鉴定。这一方法的问世为差异基
因的分离克隆提供了一个全新的思路 ,目前该技术已
广泛应用于胚胎发育、形态发生、信号传导及抗逆基因
的比较鉴定与克隆。中科院遗传所利用该技术研究盐
胁迫条件下水稻耐盐突变体基因的表达 ,克隆到了完
全受盐诱导表达的 cDNA片段 [5 ]。
DDRT2PCR能同时进行两组或两组以上样品的
分析比较 ,检测基因的上调和下调表达 ,具有周期
短、灵敏度高、操作简便等优点 ;但是它也存在一些
明显的不足 ,如假阳性高、可重复性差、扩增片段短、
倾向于分离高拷贝数 mRNA对应的 cDNA序列、检
测到的往往是 3′端出现的差异基因 ,而 5′端表现差
异的基因不易被检测到等。
4　RNA指纹图谱技术
RNA指纹图谱技术 (RNA fingerp rinting by arbi2
trary p rimed PCR)主要操作步骤包括 ,从样本中提
取总 RNA ,用随机引物合成 cDNA 第一链 ,再用同
样的引物合成 cDNA第二链 ,凝胶电泳 ,回收差异
表达的基因片段 ,基因克隆和测序。该方法采用的
随机引物不是 O ligo ( dT) ,所以可将非 poly (A )结
尾的 mRNA也转录过来 ,避免了信息的丢失 [ 6 ]。
RNA指纹图谱技术在一定的反应条件下 ,重复
性好 ,条带的亮度差异在 20%以上即可定为是差异
表达基因。但是 ,该方法需要较高的变性温度和较
低的离子浓度 ,并且随机引物可能是某一基因的保
守区或分散的基因重复序列区 ,这样有可能只扩增
这一类基因。然而 ,该技术在 RNA的多态性和不同
发育阶段 RNA表达类别的差异显示上仍有着重要
作用。
5　代表性差异分析
1993年 L isitsyn和 W igler[ 7 ]建立了代表性差异
分析方法 ( rep resentative differential analysis, RDA ) ,
1994年 Hubank和 Schatz[ 8 ]将其应用于克隆差别表
达基因上 ,并获得了成功。RDA的简要过程如下 :
(1)提取检测组 ( Tester)和驱动组 (D river)的 RNA
或 mRNA ,反转录为 cDNA。 (2)用同一限制性内切
酶 (如 DpnⅡ)对两组 cDNA作切割处理 ,形成长度
较短的 cDNA片段代表群 ,以保证绝大多数遗传信
息能被 PCR扩增。 (3)分别接上相同的寡核苷酸接
头。其中脱磷酸的短链以非共价键连接在 DNA粘
性末端上 ,以提高 5′端长链的连接效率。该短链可
于升高温度时解离下来 ,在 Taq酶作用下以长链为
模板填平末端后 ,以接头的长链为引物进行 PCR扩
增 ,获得代表性扩增子。 ( 4) 以同一限制性内切酶
在代表性扩增子两端切出相同的粘性末端 ,并只在
Tester片段末端接上新接头 ,然后将 Tester与过量的
D river混合杂交。 ( 5)复性、补平末端 ,以新接头序
列相对应的引物进行 PCR扩增。 (6)用 Mung Beam
Nuclase消化去除单链 DNA,完成第一次富集。 (7)
更换引物 ,对富集产物重复 (2) ～ (6)步操作。 ( 8)
对富集产物进行克隆、检测和分析。
RDA的实验设计巧妙 ,一方面通过对 cDNA群
体进行限制性酶切 ,创造合适的表现度 ( rep resenta2
tions) ,从而降低了 cDNA复杂度 ,有利于进行 PCR
扩增。另一方面 ,通过在检测子和驱动子连接不同
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2009年第 6期 高雪 :差异表达基因分离技术的研究进展
的接头 ,利用 PCR指数扩增双链模板 ,而仅以线性
形式扩增单链模板的特性 ,进行选择性扩增 ,使两组
之间的差异片段得到富集 ,有利于进行基因片段的
特异性扩增。目前 ,该方法已经在动物、人类及植物
的基因克隆中发挥作用。黄薇等 [ 9 ]采用该方法研
究植物耐盐基因 ,克隆了一个水孔蛋白基因。此技
术具有假阳性较低、重复性好的特点 ,但操作步骤繁
琐、实验周期长、费用昂贵等缺点也是不容忽视的。
6　抑制差减杂交技术
抑制差减杂交技术 ( supp ression subtractive hy2
bridization, SSH)技术是在抑制 PCR与差减杂交技
术结合的基础上 ,由 D iachenko等 [ 10 ]于 1996年建
立的。
从待比较的两类细胞中分别提取 mRNA反转
录为 cDNA作为检测子 ( Tester)和驱动子 (D river) ,
经酶切后产生大小适当的平末端 cDNA 片段 ;将
Tester等分为两份后加上不同的接头 ,之后经过两
轮杂交。第一次杂交中 ,过量 D river分别加入到连
有不同接头的 Tester中 ,热变性后退火复性 ,产生 4
类分子 ,包括单链 Tester cDNA、自身退火的 Tester
cDNA双链、Tester和 D river的异源双链和 D river
cDNA。第一次杂交的目的是实现 Tester单链 cDNA
的均等化。杂交前 ,不同目的 cDNA分子间存在丰
度差异。根据分子杂交的二级动力学原理 ,高丰度
cDNA分子复性形成双链的速度快于低丰度 cDNA,
且丰度越高 ,复性越快。因此单链 Tester cDNA 分
子群体中 ,目的 cDNA得以富集 ,而丰度差异得到均
衡。第二轮杂交中 ,两份杂交样品混合的同时 ,加入
新鲜变性的 D river cDNA。只有经差减和均衡的 ss2
cDNA s能退火复性形成 5′端带有两个不同接头的
杂交分子 ,使其在以后的 PCR中能被有效地扩增。
理论上该分子代表了丰度已趋于一致的所有差异表
达基因。之后 ,用与接头外侧序列对应的巢式引物
进行两次 PCR扩增 ,只有该型分子两端具有不同接
头 ,因此得以指数级扩增 ,差异表达 cDNA s得以
富集。
SSH技术的优点在于 : (1)假阳性率大大降低。
SSH采用两次差减杂交和两次 PCR,保证了该方法
具有较高的特异性 ,阳性率可高达 90%以上 [ 11 ]。
(2)高敏感性。均衡化作用和目标片段的富集保证
了低丰度 mRNA也可能被检出。 (3)高效性。一次
SSH反应可同时分离成百个差异表达基因 ,速度快 ,
效率高。 (4)差减后的组织特异性 cDNA混合物能
被用作杂交筛选的探针 ,这使得该技术在克隆差异
表达基因方面更为通用。此外 , SSH技术程序相对
简单 ,操作简便易行且重复性高。
SSH技术也存在一些局限 ,如要求研究材料的
遗传背景接近 ,差异不能太大 ;起始材料相对要求较
多 ,需要 015～2μg的 mRNA ,否则低丰度的差异表
达基因的 cDNA很可能会漏检 ; Tester中带不同接头
的低丰度单链 cDNA与互补链杂交的几率仍很低 ,
不易被扩增克隆 ;加接头的过程中会有 cDNA的损
失等。
作为一种高效便捷的分离差异表达基因的方
法 , SSH技术日益受到人们的重视 ,目前主要集中应
用在缺失或突变基因的克隆、细菌基因组差异比较、
基因差异表达分析上。如刘军等 [ 12 ]用该技术 ,以水
稻茎间分生组织为对照群体 ,以幼穗分生组织为目
标群体构建了差减文库 ,筛选出 40个在目标群体中
特异表达或表达增强的克隆 ,经 Northern杂交验证 ,
至少 40%的克隆为特异表达或表达增强的基因。
7　微阵列技术
许多物种全序列测定的完成 ,对 DNA结构有了
一定了解 ,但是对基因功能进行更多、更透彻的了解
还有很长的路要走。因此 ,生命科学重心将从揭示
生命的所有遗传信息深入到在整体水平上对功能的
研究 ,微阵列技术 (m icroarray)就是一种新的、能够
系统的全面探索基因功能的有力手段。它能同时比
较不同样本的基因表达水平的差异 ,也能够提供某
一基因或某一群基因的表达模式的信息。
微阵列技术利用分子杂交的原理 ,用自动化仪
器 A rrayer把 数以百计、千计、万计的已知部分序列
的 DNA探针固定在固相支持物玻片或尼龙膜上而
成阵列 [ 13 ]。通过一次杂交 ,在大于 1 000个 cDNA /
cm
2 点阵密度的芯片可定量检测成千上万个基因表
达活性 ,两色荧光检测组合可同时快速分析不同生
物样品的差异表达基因。微阵列上的核酸探针序列
主要源于 GenBank、dbEST和 UniGene数据库。微列
阵分两类 :一类是 cDNA微列阵 ( cDNA m icroarray) ,
阵列上的核酸较长 ( > 100 nt) ,主要用于 RNA表达
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分析 [ 14 ] ;另一类是寡聚核昔酸微列阵 ,阵列上的核
酸较短 ( < 25 nt) ,既可用于 RNA表达分析 ,也可用
于序列分析。
DNA微阵列技术具有灵活和通用、快速、操作
方便、杂交反应体积小等特点 ,适于进行探索性研
究。这种方法已经被用来进行大规模、商业性基因
筛选 ,含有 55 000个 cDNA s的微阵列每个月可筛选
800 000个克隆 [ 15 ]。对于大量已知序列未知功能的
基因而言 ,微列阵技术把基因的功能、相关的遗传座
位与表型特性三者联系起来 ,并用一种系统的、全面
的策略来研究这种关联 ,使人们充分了解基因调节、
种间多态性变异、发育和疾病过程中 RNA表达的时
间和空间、细胞中蛋白产物的相互作用与亚细胞定
位等 [ 16 ]。
8　结语
实践证明 ,以上所述的差异表达基因分离技术
及方法各具优点 ,但也有自身的缺陷。研究者应该
根据自身的需要进行选择性应用。还可根据实际要
求将多种技术互相结合 ,如将 SSH与 cDNA芯片联
合使用 ,微阵列技术快速分离经 SSH得到的差异基
因。建立一种能明确识别差异表达基因 ,且适合于
检测低丰度 mRNA的方法是今后研究发展的方向。
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