全 文 ：
菌物学报
jwxt@im.ac.cn 22 October 2016, 35(10): 1‐11
Http://journals.im.ac.cn Mycosystema ISSN1672‐6472 CN11‐5180/Q
Tel: +86‐10‐64807521 Copyright © 2016 Institute of Microbiology, CAS. All rights reserved.
研究论文 Research paper DOI: 10.13346/j.mycosystema.150275
基金项目：国家自然科学基金（No. 31201668）；浙江省农业新品种选育重大专项 (No. 2012C12911)
Supported by the National Natural Science Foundation of China (31201668) and Key Technologies Program of New Variety
Breeding of Zhejiang Province (2012C12911).
∆Contributed equally to this article.
*Corresponding author. E‐mail: nanyili163@163.com
Received: 2015‐12‐29, accepted: 2016‐04‐13
双孢蘑菇子实体不同发育时期的转录组分析
吴小梅 1 张昕 1 李南羿 2*
1浙江农林大学林业与生物技术学院 浙江 杭州 311300
2浙江农林大学农业与食品科学学院 浙江 杭州 311300
摘 要：双孢蘑菇是世界第一大宗栽培食用菌，具有重要经济价值。为探讨双孢蘑菇子实体不同发育时期基因表达变化，
利用高通量测序技术对双孢蘑菇原基期、采收期和开伞后期等不同发育时期进行 RNA‐Seq分析，共筛选到 6328个差异表
达基因，其中 3941个上调基因，2387个下调基因。Gene Ontology（GO）功能聚类分析表明，差异表达基因主要富集在
结合、催化分子功能组和代谢过程生物学通路中，且发育过程和有性繁殖相关的基因全部为上调表达，以利于细胞分化
发育形成成熟子实体进入生殖生长阶段。KEGG功能富集分析结果表明，差异基因参与了氨基酸代谢、碳水化合物代谢、
核苷酸代谢、脂类代谢和能量代谢这 5 大代谢通路，其中差异基因主要富集在氨基酸代谢通路中，氨基酸合成相关的多
数基因上调表达，表明双孢蘑菇子实体发育形成需要一系列代谢反应协同调控，氨基酸代谢相关基因可能在双孢蘑菇子
实体发育过程中起重要作用。本文通过全面分析双孢蘑菇子实体发育时期基因表达变化，获得了大量转录本信息，为深
入了解双孢蘑菇子实体发育调控分子机理和相关功能基因提供了重要的基因数据资源。
关键词：双孢蘑菇，高通量测序，差异表达基因，代谢途径分析，氨基酸代谢
Transcriptome analysis of the budding mushroom Agaricus bisporus fruiting
at different stages
WU Xiao‐Mei1∆ ZHANG Xin1∆ LI Nan‐Yi2*
1College of Forestry and Bio‐technology, Zhejiang Agricultural and Forestry University, Hangzhou, Zhejiang 311300, China
2College of Agricultural and Food Science, Zhejiang Agricultural and Forestry University, Hangzhou, Zhejiang 311300, China
Abstract: Agaricus bisporus, one of the most commercially cultivated mushroom in the world, has an important economic value.
To better understand the gene expression changes of fruiting body development in Agaricus bisporus, transcriptome sequencing
and gene expression analysis were adopted to investigate differentially expressed genes by using RNA sequencing approach. A
网络出版时间：2016-06-06 11:00:52
网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.5180.Q.20160606.1100.002.html
ISSN1672‐6472 CN11‐5180/Q Mycosystema October 22, 2016 Vol. 35 No. 10
http://journals‐myco.im.ac.cn
2
total of 6 328 differential expressed genes were identified at the pinhead stage, closed cup stage and flat 2 stage of fruiting body.
Among them, 3941 unigenes were up‐regulated and 2387 unigenes were down‐regulated. The Gene Ontology classification
showed that, the differentially expressed genes were mostly enriched in binding, catalytic molecular functions and metabolic
process biological pathway. All the transcripts associated with developmental and reproduction processes were up‐regulated,
which implicated that the increased gene expression lever can facilitate the cell differentiation from vegetative mycelium to
generative mycelium. KEGG pathway analysis revealed that the differential expressed genes were involved in five most
represented pathways including nucleotide metabolism, carbohydrate metabolism, energy metabolism, lipid metabolism and
amino acid metabolism. Of these, most transcripts related to amino acid synthesis were up‐regulated, suggesting that amino
acid metabolism might play an important role in the development process of fruiting. In this study, the differentially expressed
genes were obtained by analysis of transcriptional level in Agaricus bisporus at various stages of development process, and the
results provide important information in exploring the potential genes responsible for the formation of fruiting body and
revealing the molecular mechanism of the development in Agaricus bisporus.
Key words: Agaricus bisporus, high‐throughput sequencing, differentially expressed gene, pathway analysis, amino acid
metabolism
双孢蘑菇 Agaricus bisporus (J.E. Lange) Imbach
俗称白蘑菇、双孢菇。其子实体味道鲜美、氨基酸
种类丰富、蛋白质含量高，具有很高的营养价值，
是世界上商业化栽培规模最大、普及地区最广泛的
食用菌（王泽生等 2012）。双孢蘑菇子实体发育
过程可分为 7 个时期，分别为原基期、纽扣期、
采收期、成熟早期、成熟期、开伞期、开伞后期
（Hammond & Nichols 1975）。双孢蘑菇子实体分
化形成是一个复杂的生命过程，因栽培环境温度
和 CO2浓度的改变，生长在粪草料基质中的营养
菌丝扭结形成原基，经过细胞分化、结构变化等
最终分化为成熟子实体，其间涉及到营养物质合
成及转运、细胞分裂及分化、信号转导及大量相
关基因的协同调控（Webster & Weber 2007）。子
实体分化发育相关基因是决定子实体发生、形成、
成熟的重要基因，与双孢蘑菇产量及品质关系密
切（陈美元等 2015）。因此，深入了解子实体发
育中整体基因表达情况，对发育关键功能基因的
挖掘和阐明双孢蘑菇子实体分化发育的分子机理
具有重要意义。
近年来，食用菌子实体形成以及发育的分子机
理研究已有很大进展。如在香菇 Lentinula edodes
(Berk.) Pegler 中克隆到一些与子实体发育相关的
基因，其中包括在担子菌中常见的疏水蛋白基因
（Nishizawa et al. 2002）、成熟子实体特异表达的
UDP‐CMP激酶基因 uck1（Kaneko et al. 1998）以及
漆酶基因等（ Zhao & Kwan 1999）。 Brown &
Casselton (2001) 在灰盖鬼伞 Coprinopsis cinerea
(Schaeff.) Redhead，Vilgalys & Moncalvo中发现 2
个交配型基因（Clp基因、Pcc1基因）对灰盖鬼伞
的有性发育具有重要作用。目前已发现的双孢蘑
菇的发育相关基因主要有疏水蛋白基因 hypA、
PPO基因（Li et al. 2011）、尿素与脲酶含量及脲酶
基因（De Groot et al. 1997；Wagemaker et al. 2006）
等。尽管双孢蘑菇全基因组序列测定已经完成
（Morin et al. 2012），但子实体发育分子生物学进
展仍然相对缓慢，对于双孢蘑菇发育过程中基因
表达规律尚不清楚，对参与发育相关重要功能基
因的研究也较少。
RNA测序（RNA Sequencing，RNA‐Seq）又称
转录组测序技术，该技术可以准确研究全部 mRNA
转录本的丰度信息，发掘新的转录本和可变剪接
吴小梅 等 /双孢蘑菇子实体不同发育时期的转录组分析
菌物学报
3
体，通过了解样品间转录组差异，可得到大量功能
基因，对揭示基因表达与生物学过程的关系具有重
要意义（Wang et al. 2009）。目前，高通量测序技
术已在真菌发育机理研究中被广泛应用。如利用
454高通量测序技术研究冬虫夏草 Ophiocordyceps
sinensis (Berk.) G.H. Sung，J.M. Sung，Hywel‐Jones &
Spatafora 子实体发育机制，研究发现了 4 个交配
型基因和 121 个基因可能参与了虫草子实体的发
育，尤其在信号转导和转录调控方面起重要作用
（Xiang et al. 2014）。Teichert et al.（2012）利用转
录组测序（RNA‐Seq）与激光显微切割（LM）技术
分析子囊菌有性发育过程，揭示差异基因在不育菌
丝体和初生孢子囊中表达水平显著，分析转录因子
PRO1参与性结构基因的表达。Plaza et al. （2014）
对模式真菌裂褶菌 Schizophyllum commune Fr.在
营养菌丝和原基 2 个发育阶段转录组学分析显
示，担子菌子实体发育过程中存在一条保守的转
录调控路线促使转录因子及 A Velvet结构域蛋白
基因上调表达，在担子菌有性发育中起重要作用。
由于遗传背景差异，双孢蘑菇子实体分化发育过
程与模式菌子实体发育存在差异，目前对双孢蘑
菇子实体发育转录组比较分析的相关报道还未
见到。
鉴于子实体发育机制对双孢蘑菇栽培和育种
工作的重要性，本研究选用双孢蘑菇子实体形态存
在明显差异的 3 个不同发育阶段为材料，运用
RNA‐Seq转录组测序技术进行比较分析，全面探讨
双孢蘑菇子实体原基期、采收期、开伞后期差异基
因表达情况，分析双孢蘑菇子实体发生、发展、成
熟的分子机制及发育过程中的关键基因，为今后双
孢蘑菇分子标记开发、重要性状功能基因克隆、品
质遗传工程改良等奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
选取子实体不同发育阶段作为研究材料。采样
时期分别为原基期（菌盖直径小于 5mm，菌膜未
分化）、纽扣期（菌盖直径 20–30mm，菌膜可见）、
采收期（菌盖直径 30–40mm，菌膜完整）、成熟早
期（菌盖直径 30–40mm，菌膜开始破裂）、成熟期
（菌盖直径 30–50mm，菌膜已破裂，菌褶清晰可
见）、开伞期（菌盖直径 40–60mm，菌盖张开，菌
盖表面凸起）和开伞后期（菌盖直径 50–70mm，
菌褶表面弯曲向上大开伞）7个完整的发育时期，
将采集的子实体样品迅速转移至液氮冷冻并置于
‐80℃冰箱，以备后续的 RNA提取及实时定量 PCR
分析。
1.2 总 RNA提取以及质量检测
采用 TRIzol试剂（购于 Invitrogen公司）提取
双孢蘑菇子实体总 RNA，具体操作参照产品说明
书。用 1.2%琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA的纯度及
完整性，用 Agilent 2100进一步检测 RNA的浓度和
OD260/OD280、OD260/OD230 比值。将检测合格的总
RNA 委托北京博奥生物有限公司进行 Illumina
HiSeqTM2500测序。
1.3 表达量注释以及差异表达基因的筛选
每个样品采用 FPKM（reads per kb per million
reads）（Mortazavi et al. 2008）方法计算基因的表达
量。并用倍数变化法筛选两样本之间的差异表达基
因。然后采用控制 FDR（false discovery rate）来决
定 P‐value的域值。把差异表达基因定义成 P≤0.01
且倍数差异在 2倍以上的基因，即为上调，差异倍
数在 0.5以下，则为下调。得到差异表达基因后，
对差异表达基因进行 Gene Ontology（GO）功能分
析和 KEGG Pathway分析。
1.4 GO功能的聚类分析
将筛选到的差异表达基因进行 GO功能注释。
将注释到的差异基因使用在线 GO聚类程序WEGO
（http://wego. genomics.org.cn/cgi‐bin/wego/index.pl）
对其进行聚类分析。
1.5 Pathway显著性富集分析
本研究将两样本间获得的差异表达基因使用
ISSN1672‐6472 CN11‐5180/Q Mycosystema October 22, 2016 Vol. 35 No. 10
http://journals‐myco.im.ac.cn
4
在线分析程序 KAAS（http://www.genome.jp/kaas‐bin/
kaas_main），选取真菌中的大部分模式生物为代表
集，分别在 KEGG数据库中进行注释，以此来研究
差异表达基因所在的代谢通路。
1.6 荧光定量 PCR分析
不同样品的总 RNA 利用 PrimeScript® RT
reagent Kit（Perfect real time）（购于 TaKaRa公司）
反转录试剂盒合成 cDNA 第一链。利用 SYBR®
Premix Ex TaqTM（With ROX）试剂盒（购于 TaKaRa
公司）在 ABI 7500 荧光定量 PCR 仪上采用 SYBR
greenⅠ荧光染料法进行 Real‐time PCR分析。以双
孢蘑菇 Ab28s基因为内参，采用相对定量 2–ΔΔCt法
进行结果分析。利用 Primer Express v3.0 软件
（Singh & Pandey 2015）设计基因的引物序列
gene133083 (F：5’‐CCTCTGGACCTCCGTATGTT‐3’，R：
5’‐AATCCGCCAATTTCAGAGTC‐3’)，gene223689 (F：
TGAAGACAA CCTGGACAAGC，R：5’‐GGAGAGGTGGCA
TAGGGTAA‐3’)，委托上海生工公司合成引物。
2 结果与分析
2.1 RNA提取
用 Agilent 2100对 RNA各项指标进行检测（表
1），结果表明所提取的 RNA 质量较好，可以进行
测序文库构建及 Illumina HiSeqTM2500测序分析。
2.2 差异表达基因筛选与 GO功能聚类分析
本研究对双孢蘑菇子实体发育 3 个典型时期
—原基期、采收期及开伞后期进行转录组测序分
析，双孢蘑菇 H97 基因组（http://genome.jgi.doe.
gov/Agabi_varbisH97_2/Agabi_varbis H97_2home.
html）为参考基因组，得到 10438个转录本。以双
孢蘑菇子实体原基期为对照，共筛选出 6328个差
异表达基因，其中 3941个上调基因，2387个下调
基因（表 2）。利用公共数据库 NR、Swiss‐Prot 等
对获得的 10438个转录本进行 Blast比对，结果显
示：74.7%（7797个）的转录本有功能注释，为差
异基因后期的功能分析提供了重要的参考价值。
表 1 双孢蘑菇子实体不同发育阶段 RNA质量检测
Table 1 The total RNA detection of fruiting body from different development stage of Agaricus bisporus
时期
Stage
RNA浓度（µg/µL）
RNA concentration
A260/280 A260/230 rRNA比率（23s/16s）
rRNA ratio（23s/16s）
RNA完整性
RNA Integrity Number(RIN)
原基期
Pinhead stage
2.096 2.10 1.92 2.8 9.8
采收期
Closed cup stage
2.091 2.10 2.28 2.2 9.9
开伞后期
Flat 2 stage
2.328 2.10 1.22 2.2 9.7
表 2 采收期和开伞后期与原基期相比的差异基因数量
Table2 The number of differentially expressed genes in “closed cup” and “flat 2” stages relative to “pinhead” stage
样品名
Sample name
差异基因
Differential expression
gene
上调基因
Up‐regulated gene
下调基因
Down‐regulated gene
特异基因
Specifically
expression gene
采收期 vs原基期
Closed cup stage vs pinhead stage
3008 1971 1037 82
开伞后期 vs原基期
Flat 2 stage vs pinhead stage
3320 1970 1350 88
吴小梅 等 /双孢蘑菇子实体不同发育时期的转录组分析
菌物学报
5
对差异表达基因的 GO 功能注释分类结果进
行统计（图 1），发现分子功能（molecular function）、
细胞组分（ cellular component）、生物学过程
（biological process）三大功能分类分别包含了 7、
8和 12个功能分类。在细胞组分分组中差异表达基
因在细胞（cell）、细胞组分（cell part）类型所占比
例最高，分别为 19.8%和 19.4%，包膜（envelope）
的含量最低，仅有 8个基因。在分子功能分组中，
结合（binding）、催化活性（catalytic activity）类
型中差异表达基因所占比例最高，均为 38.0%，分
子转导（molecular transducer）中包含的差异表达
基因数最少，仅有 1 个基因下调表达；在结构分
子（structure molecular）亚组中，上调基因数目
明显多于下调基因。在生物学过程分组中，细胞过
程（cellular process）和代谢过程（metabolic process）
所占比例最高，分别为 32.5%和 31.8%。其中，在
子实体分化（reproduction）和发育过程（development
process）条目下的差异基因全部为上调表达，符
合双孢蘑菇子实体分化发育基本规律，而胁迫响
应（response to stimulus）条目下的基因也具有显
著性的富集，有利于提高双孢蘑菇发育过程中对
外界环境变化的适应能力，对子实体良好发育起
到正向调控作用。差异表达基因显著性富集结果
显示，在生物学过程分组中，氨基酸代谢是显著
富集的类型，说明差异表达基因参与的主要生物
学过程是细胞内进行的各种氨基酸的代谢。
对双孢蘑菇 3 个不同发育阶段显著差异表达
的（FPKM>15）18 个基因进行 GO 注释（表 3），
结果发现：大量的氨基酸合成相关酶具有明显的高
表达，如天冬氨酸氨基转移酶、乙酰谷氨酸激酶、
谷氨酰胺合成酶胍基激酶、天冬氨酸转氨酶、吡咯
啉‐5‐羧化还原酶、精氨基琥珀酸裂解酶、鸟氨酸
图 1 双孢蘑菇 3 个不同发育时期子实体中的差异表达基因 GO 分类图 3vs1：采收期 vs 原基期；7vs1：开伞后期 vs 原
基期．
Fig. 1 GO annotation of differentially‐expressed genes of Agaricus bisporus fruiting at the three different stages. 3vs1: “Closed
cup” stage vs “pinhead” stage; 7vs1: “Flat 2” stage vs “pinhead” stage.
ISSN1672‐6472 CN11‐5180/Q Mycosystema October 22, 2016 Vol. 35 No. 10
http://journals‐myco.im.ac.cn
6
表 3 双孢蘑菇在 3个不同发育时期显著差异表达的 18个基因
Table 3 The eighteen most differentially expressed genes of Agaricus bisporus in three different development stages
基因编号
Gene ID
原基期 FPKM
Pinhead stage FPKM
采收期 FPKM
Closed cup stage FPKM
开伞后期 FPKM
Flat 2 stage FPKM
Nr‐注释
Nr‐annotation
210981 91.95 226.98 232.92 乙酰谷氨酸激酶
Acetylglutamate kinase arg6
190498 303.25 667.66 799.9 谷氨酰胺合成酶胍基激酶
Glutamine synthetase guanido kinase
190572 345.85 712.14 527.71 天冬氨酸转氨酶
Aspartate aminotransferase
181641 17.31 42.39 58.67 乙醛脱氢酶
Aldehyde dehydrogenase
63236 1168.81 2525.79 1134.24 吡咯啉‐5‐羧化还原酶
Pyrroline‐5‐carboxylate reductase
190575 221.46 1166.4 2205.02 精氨琥珀酸裂解酶
Argininosuccinate lyase
195978 269.87 571.04 412.96 鸟氨酸氨甲酰基转移酶
Ornithine carbamoyltransferase
213491 209.83 464.87 300.17 过氧化物铜胺氧化酶
Peroxisomal copper amine oxidase
66116 16.78 75.02 60.35 GTP结合蛋白
Gtpase binding protein rid1
139664 518.81 213.56 140.51 转录因子类似蛋白质增强子
Enhancer of yellow 2 transcription
factor‐like protein
133370 364.02 743.72 741.59 细胞分裂控制三磷酸鸟苷结合蛋白
Cell division control gtp binding protein
191507 1630.1 7088.42 9439.56 酪氨酸酶
Tyrosinase
122941 90.2 295.85 102.04 C2H2型转录因子
C2H2 transcription factor
41003 230.67 679.34 793.41 细胞分裂素活化蛋白激酶
Mitogen activated protein kinase
138567 144.86 294.49 323.31 ace1转录因子
ace1 transcription factor
154135 42.75 100.52 145.03 fst3转录因子
fst3 transcription factor
119147 114.72 355.11 244.05 gata转录因子
gata transcription factor
191917 55 158.25 78.37 bzip转录因子
bzip transcription factor
吴小梅 等 /双孢蘑菇子实体不同发育时期的转录组分析
菌物学报
7
氨甲酰基转移酶、过氧化物酶铜胺氧化酶、酪氨酸
酶等。其中也包括 GTP 结合蛋白和一些转录因子
如 C2H2、bzip 和 fst3 等转录因子在子实体整个发
育阶段具有明显的高表达，推测这些差异基因可能
在子实体生长发育中起重要调控作用。
2.3 Pathway富集分析
对 3样本间的差异表达基因进行 Pathway富集
分析发现：837 个差异表达基因成功注释到 98 条
Pathway 上，选取差异基因富集数目较多的前 30
个 Pathway进行整理分析得到五大代谢通路，分别
为核苷酸代谢（涉及 30个差异基因）、碳水化合物
代谢（涉及 45 个差异基因）、能量代谢（涉及 24
个差异基因）、脂类代谢（涉及 16个差异基因）和
氨基酸代谢（涉及 178个差异基因）。涉及的氨基
酸代谢分别包括精氨酸、脯氨酸、鸟氨酸、半胱氨
酸、甲硫氨酸和酪氨酸代谢。参与半胱氨酸和甲硫
氨酸代谢的所有差异基因均为上调（表 3），另外，
大多数氨基酸代谢中的酶类蛋白如天冬氨酸氨基
转移酶、精氨基琥珀酸裂解酶、过氧化物铜胺氧化
酶以及鸟氨酸氨甲酰基转移酶在子实体不同发育
阶段具有明显的高表达，酪氨酸代谢中的关键酶酪
氨酸酶在双孢蘑菇子实体采收期和开伞后期具有
活跃的上调表达。
2.4 通过 RT‐qPCR验证转录组测序表达模式
本研究通过 RNA‐Seq 技术揭示了上千个差异
基因的表达情况，为了进一步证实转录组测序的准
确性，挑取 2 个差异表达基因通过 Real‐time PCR
分析其在 7个子实体不同发育时期的表达情况（图
2）。Gene148258（Rsc复合蛋白基因）在子实体发
育纽扣期至半茶杯期表达量均较高，在茶杯期表达
量达到最高，而在子实体发育后期（开伞期至大开
伞期）表达量逐渐降低。Gene223689（脯氨酸富
集蛋白基因）在子实体不同发育时期的表达量逐渐
升高然后降低，茶杯期达到最高点，开伞期后逐渐
下降。结果显示 2 个差异基因具有相似的表达模
式，与转录组测序结果具有一致性。
图 2 Gene148258（A）、gene223689（B）的实时荧光定量
PCR检测 1：原基期；2：纽扣期；3：采收期；4：成熟
早期；5：成熟期；6：开伞期；7：开伞后期.
Fig. 2 Quantitative expression analysis of the genes 148258
(A) and 223689 (B) at different fruiting stages in Agaricus
bisporus. 1: “Pinhead” stage; 2: “Button” stage; 3: “Closed
cup” stage; 4: “Cup 1” stage; 5: “Cup 2” stage; 6: “Flat 1”
stage; 7: “Flat 2” stage.
3 讨论
与灰盖鬼伞、裂褶菌等模式菌相比，双孢蘑菇
分子理论基础研究薄弱，遗传背景了解相对不足，
近年来基于 Illumina测序平台的 RNA‐Seq转录组测
序技术为全面高效地了解双孢蘑菇生物学过程中
ISSN1672‐6472 CN11‐5180/Q Mycosystema October 22, 2016 Vol. 35 No. 10
http://journals‐myco.im.ac.cn
8
基因表达情况提供了强大的技术支持。
大型真菌子实体分化发育是一个复杂的生命
过程，营养菌丝体扭结形成原基是子实体形成的初
级阶段，从原基进一步分化为幼菇期至成熟的子实
体，其中涉及到基础代谢、细胞伸长、细胞结构的
变化、信号转导和胁迫响应。双孢蘑菇发育过程中
的原基期为子实体形成初级阶段，是菌丝营养生长
转向生殖生长、子实体分化发育的启动期；采收期
是商品菇采摘时期，子实体发育中处于幼菇阶段，
是细胞分化、伸长、细胞结构变化最明显的时期，
也是影响子实体品质和产量的关键时期。开伞后期
为子实体成熟期，是担孢子成熟弹射的最佳时期，
为双孢蘑菇有性生殖阶段。本研究选用原基期、采
收期和开伞后期的子实体进行转录组测序，通过差
异比较分析筛选出与双孢蘑菇子实体发育相关的
关键基因，发现差异表达基因中存在多种氨基酸合
成酶、转录因子、GTP结合蛋白等。转录因子基因
是一类具有分子开关作用的蛋白，本研究发现
fst3、C2H2型锌指蛋白等转录因子在子实体整个发
育阶段具有明显的高表达。fst3基因属于真菌转录
因子 MHR超基因家族，在子实体形成中具有调控
作用，裂褶菌 fst3基因可抑制原基的形成（Ohm et
al. 2011），糙皮侧耳 fst3基因表达量在子实体成熟
期达到最强（申进文等 2015）。本文中双孢蘑菇 fst3
基因在原基期、采收期、开伞后期中表达量逐渐
增强，与申进文等（2015）的研究结果一致，这
说明转录因子 fst3 在双孢蘑菇、糙皮侧耳的子实
体发育过程中可能具有相似的功能。C2H2 锌指蛋
白在丝状真菌中广泛参与碳代谢调控，参与纤维
素降解相关的纤维素酶和半纤维素酶的表达调控
（杨帆和王娟 2014），如里氏木霉 Trichoderma
reesei E.G. Simmons纤维素酶调控因子 CRE1、ACE1
（Antoniêtoa et al. 2014；Martinez et al. 2008）和
粗糙脉孢菌 Neurospora crassa Shear & B.O. Dodge
半纤维素酶调控因子 XLR‐1（Sun et al. 2012）。本
研究得到的 C2H2型锌指蛋白在双孢蘑菇发育原基
期至采收期的表达量急剧上升之后至子实体成熟
期表达量下降，在双孢蘑菇发育的早期和中期，需
要碳水化合物代谢产生大量能量，以满足子实体生
物量的快速增长，推测该锌指蛋白基因主要参与调
控子实体分化、形成过程中碳水化合物的代谢。
GTP结合蛋白（GTP binding protein，G蛋白）为信
号调控蛋白，在细胞信号跨膜传导和细胞分化发育
中具有重要作用。在模式真菌如构巢曲霉 Aspergillus
nidulans (Eidam) G. Winter FlbA蛋白对上游菌丝的
生殖、发育、次生代谢物的合成具有重要作用（Yu
& Keller 2005），RgsC蛋白参与菌丝伸长、核定位及
膜泡运输（Han et al. 2004）。稻瘟病菌Magnaporthe
oryzae B.C. Couch MoRgs4蛋白调控漆酶、过氧化
物酶活性及有性发育产孢过程（Zhang et al. 2011）。
本研究中 GTP 结合蛋白基因在双孢蘑菇子实体幼
菇期至成熟期呈下调表达，与陈美元等（2013）
利用蛋白质双向电泳对双孢蘑菇发育后期 GTP 结
合蛋白研究结果一致，这可能由于在成熟后期子实
体发育基本完成，各种代谢相关酶活性的降低致使
GTP结合蛋白在转录和翻译水平的表达均为下调。
本文所获得的大量差异表达基因可以为后续的子
实体发育相关基因的挖掘提供理论参考。
我们将所有差异表达基因进行 GO 条目的注
释，并将这些基因的功能进行 GO功能聚类分析，
以期来了解样本之间差异表达基因所处的功能分
类。从 GO功能聚类分析结果可以看出，本研究的
差异表达基因主要富集在分子功能分组中的结合、
催化活性区域。重要的是，在发育过程和有性繁殖
单元中的差异基因全部为上调表达，其中包括 Rsc
复合蛋白（gene 148258）和脯氨酸富集蛋白（gene
223689）基因。Rsc复合蛋白是一类重要的依赖 ATP
合成酶的染色体重塑复合物，至少包含 16个亚单
位，在酿酒酵母染色质结构的改变、细胞周期发展
方面扮演着重要的角色（Kadonaga 1998；Kingston
& Narlikar 1999）。Damelin et al.（2002）研究发现
RSC的突变影响参与细胞壁合成基因的表达、核糖
吴小梅 等 /双孢蘑菇子实体不同发育时期的转录组分析
菌物学报
9
体的合成、碳源的利用以及 TOR信号通路。Wilson
（2006）研究表明 RSC 复合物为重要的真菌特异
蛋白，缺失 RSC7 的酿酒酵母 Saccharomyces
cerevisiae Meyen ex E.C. Hansen菌株对温度和药物
敏感，容易导致 DNA 破坏、微管解聚、细胞壁负
担加剧。脯氨酸富集蛋白是植物生命活动中一种特
殊的蛋白家族，在植物组织器官中特异性表达及对
不同刺激因素作出反应，表明它们参与植物细胞多
种生理功能。Seitz et al.（1996）对脯氨酸富集蛋
白 rad9 基因进行研究发现，在灰盖鬼伞中该基因
参与了减数分裂过程，并在子实体形成过程中起重
要作用。灰盖鬼伞 rad9 突变体担孢子产量减少、
孢子存活率低且不能进行完整的减数分裂过程
（Zolan et al. 1988；Valentine et al. 1995）。本文通
过分析基因时空表达差异发现，RSC蛋白基因在子
实体发育不同阶段都有明显的表达，其中在子实体
发育纽扣期至成熟早期表达量均较高，在成熟期表
达量达到最高，而在子实体发育后期（成熟期至开
伞后期）表达量逐渐降低；脯氨酸富集蛋白基因的
表达具有先升高后降低的趋势，在成熟期达到最
高，而在子实体分化的早期和成熟的晚期表达量均
较低，可能对双孢蘑菇子实体的发育起到负调控作
用，其功能需要进一步研究验证。
KEGG是生物有机体内代谢分析和代谢调控网
络研究的强有力工具，能够找到差异表达基因中具
有显著性富集特点的 Pathway（Kanehisa et al.
2006）。本研究中发现大量差异基因富集在氨基酸
代谢通路中，其中包括多种具有生理活性的氨基酸
如精氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、酪氨酸、半胱氨酸
等，表明在子实体发育过程中氨基酸代谢在蛋白质
的积累及多种生物过程中具有重要功能。精氨酸酶
将精氨酸分解为鸟氨酸和尿素，鸟氨酸是合成多胺
类物质的前体（Shah & Swiatlo 2008），而多胺为脂
肪族类化合物，能为生物体提供氮源，并在细胞分
化、细胞膜稳定性的维持及植物的感知及生理应激
方面起着重要作用（姚响文等 2014；杨洪强和高
华君 2007）。本研究中参与精氨酸与鸟氨酸代谢相
关的酶如精氨琥珀酸裂解酶、鸟氨酸氨甲酰基转移
酶等在子实体不同时期表达量均较高，在子实体中
氨基酸的含量不仅是构成蛋白质的组分，也是其生
命活动中氮代谢的原料，推测这 2种氨基酸主要参
与调控子实体中氮代谢过程，为细胞提供充足的氮
源。甲硫氨酸在细胞代谢中也占据重要地位，参与
甲基转移、转硫作用及多胺的合成。本研究中合成
甲硫氨酸相关的酶在双孢蘑菇原基和成熟子实体
中上调基因数目均大于下调基因数，推测甲硫氨酸
的含量可影响子实体细胞内的生化反应。酪氨酸酶
是一种含铜的多酚氧化酶，主要参与酪氨酸的代
谢，在双孢蘑菇子实体不同 3个发育阶段中具有明
显的高表达。Li et al.（2011）利用半定量 RT‐PCR
分析双孢蘑菇子实体的不同发育阶段 PPO 基因的
表达量变化，结果显示 PPO3基因在原基期表达量
很低，之后随着子实体的成熟表达量均上调，推测
酪氨酸酶可能参与了双孢蘑菇子实体的成熟过程。
Zhao & Kwan（1999）从香菇中克隆出降解木质素
的漆酶基因 lac1，结果表明漆酶基因对香菇子实体
的形态建成有一定的作用。
综上所述，通过 RNA‐Seq技术的应用，初步明
确了双孢蘑菇子实体 3个发育阶段基因表达变化情
况、差异表达基因的种类和数量、部分基因的功能、
GO 分类及代谢过程，研究结果为进一步分析双孢
蘑菇子实体发育相关基因的表达模式，探讨差异表
达基因与子实体发育的调控关系，揭示双孢蘑菇子
实体形成的相关分子机制，积累了部分科学数据。
致谢：感谢浙江省林业科学院李海波研究员在荧光定量方
面的指导。感谢福建省农业科学院陈美元博士在双孢蘑菇
发育时期术语翻译方面的指导。
[REFERENCES]
Antoniêto ACC, dos Santos Castro L, Silva‐Rocha R, Persinoti
GF, Silva RN, 2014. Defining the genome‐wide role of
CRE1 during carbon catabolite repression in Trichoderma
ISSN1672‐6472 CN11‐5180/Q Mycosystema October 22, 2016 Vol. 35 No. 10
http://journals‐myco.im.ac.cn
10
reesei using RNA‐Seq analysis. Fungal Genetics and
Biology, 73: 93‐103
Brown AJ, Casselton LA, 2001. Mating in mushrooms:
increasing the chances but prolonging the affair. Trend in
Genetics, 17(7): 393‐400
Chen MY, Liao JH, Li HR, Cai ZX, Guo ZJ, Wang ZS, 2013.
Analysis of differentially expressed proteins in later
developing stage fruitbody of Agaricus bisporus.
Mycosystema, 32(5): 855‐861 (in Chinese)
Chen MY, Liao JH, Li HR, Cai ZX, Guo ZJ, Wang ZS, 2015.
Developmental proteomics analysis of the button
mushroom Agaricus bisporus. Mycosystema, 34(6):
1153‐1164 (in Chinese)
Damelin M, Simon I, Moy TI, Wilson B, Komili S, Tempst P, Roth
FP, Young RA, Cairns BR, Silver PA, 2002. The genome‐wide
localization of Rsc9, a component of the RSC
chromatin‐remodeling complex, changes in response to
stress. Molecular Cell, 9(3): 563‐573
De Groot PWJ, Schaap PJ, Van Griensven LJLD, Visser J, 1997.
Isolation of developmentally regulated genes from the
edible mushroom Agaricus bisporus. Microbiology, 143(6):
1993‐2001
Hammond JBW, Nichols R, 1975. Changes in respiration and
soluble carbohydrates during the post‐harvest storage of
mushrooms (Agaricus bisporus). Journal of the Science of
Food and Agriculture, 26(6): 835‐842
Han KH, Seo JA, Yu JH, 2004. Regulators of G‐protein signalling
in Aspergillus nidulans: RgsA downregulates stress
response and stimulates asexual sporulation through
attenuation of GanB (Gα) signalling. Molecular
Microbiology, 53(2): 529‐540
Kadonaga JT, 1998. Eukaryotic transcription: an interlaced
network of transcription factors and chromatin‐modifying
machines. Cell, 92(3): 307‐313
Kanehisa M, Goto S, Hattori M, Aoki‐Kinoshita KF, Itoh M,
Kawashima S, Katayama T, Araki M, Hirakawa M, 2006.
From genomics to chemical genomics: new developments
in KEGG. Nucleic Acids Research, 34(S1): D354‐D357
Kaneko S, Miyazaki Y, Yasuda T, Shishido K, 1998. Cloning,
sequence analysis and expression of the basidiomycete
Lentinus edodes gene uck1, encoding UMP‐CMP kinase,
the homologue of Saccharomyces cerevisae URA6 gene.
Gene, 211(2): 259‐266
Kingston RE, Narlikar GJ, 1999. ATP‐dependent remodeling and
acetylation as regulators of chromatin fluidity. Genes &
Development, 13(18): 2339‐2352
Li NY, Liu C, Cai WM, Jin QL, Qin QP, Ran FL, 2011. Molecular
cloning and expression of polyphenoloxidase genes from
the mushroom, Agaricus bisporus. Agricultural Sciences in
China, 10(2): 185‐194
Martinez D, Berka RM, Henrissat B et al, 2008. Genome
sequencing and analysis of the biomass‐degrading fungus
Trichoderma reesei (syn. Hypocrea jecorina). Nature
Biotechnology, 26(5): 553‐560
Morin E, Kohler A, Baker AR et al, 2012. Genome sequence of
the button mushroom Agaricus bisporus reveals
mechanisms governing adaptation to a humic‐rich
ecological niche. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America, 109(43):
17501‐17506
Mortazavi A, Williams BA, McCue K, Schaeffer L, Wold B, 2008.
Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by
RNA‐Seq. Nature Methods, 5(7): 621‐628
Nishizawa H, Miyazaki Y, Kaneko S, Shishido K, 2002.
Distribution of hydrophobin 1 gene transcript in
developing fruiting bodies of Lentinula edodes. Bioscience,
Biotechnology, and Biochemistry, 66(9): 1951‐1954
Ohm RA , de Jong JF, de Bekker C, Wösten HAB, Lugones LG,
2011. Transcription factor genes of Schizophyllum
commune involved in regulation of mushroom formation.
Molecular Microbiology, 81(6): 1433‐1445
Plaza DF, Lin CW, van der Velden NSJ, Aebi M, Künzler M, 2014.
Comparative transcriptomics of the model mushroom
Coprinopsis cinerea reveals tissue‐specific armories and a
conserved circuitry for sexual development. BMC
Genomics, 15(1): 492‐509
Seitz LC, Tang KL, Jason Cummings W, Zolan ME, 1996. The
rad9 Gene of Coprinus cinereus encodes a proline‐rich
protein required for meiotic chromosome condensation
and synapsis. Genetics, 142(4): 1105‐1117
Shah P, Swiatlo E, 2008. A multifaceted role for polyamines in
bacterial pathogens. Molecular Microbiology, 68(1): 4‐16
Shen JW, Liang SS, Qiu LY, Qi YC, 2015. Cloning and expression
of a fst3 gene from Pleurotus ostreatus. Acta Edulis Fungi,
22(1): 15‐20 (in Chinese)
Singh A, Pandey GK, 2015. Primer design using primer express®
吴小梅 等 /双孢蘑菇子实体不同发育时期的转录组分析
菌物学报
11
for SYBR Green‐based quantitative PCR methods. Methods
in Molecular Biology, 1275: 153‐164
Sun JP, Tian CG, Diamond S, Glass NL, 2012. Deciphering
transcriptional regulatory mechanisms associated with
hemicellulose degradation in Neurospora crassa.
Eukaryotic Cell, 11(4): 482‐493
Teichert I, Wolff G, Kück U, Nowrousian M, 2012. Combining
laser microdissection and RNA‐seq to chart the
transcriptional landscape of fungal development. BMC
Genomics, 13(1): 511‐529
Valentine G, Wallace YJ, Rudolf Turner F, Zolan ME, 1995.
Pathway analysis of radiation‐sensitive meiotic mutants of
Coprinus cinereus. Molecular and General Genetics MGG,
247(2): 169‐179
Wagemaker MJM, Eastwood DC, van der Drift C, Jetten MSM,
Burton K, Van Griensven LJLD, Op den Camp HJM, 2006.
Expression of the urease gene of Agaricus bisporus: a tool
for studying fruit body formation and post‐harvest
development. Applied Microbiology and Biotechnology,
71(4): 486‐492
Wang Z, Gerstein M, Snyder M, 2009. RNA‐Seq: a revolutionary
tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics, 10(1):
57‐63
Wang ZS, Liao JH, Chen MY, Cai ZX, 2012. Breeding and
industrial development of Agaricus bisporus. Acta Edulis
Fungi, 19(3): 1‐14 (in Chinese)
Webster J, Weber RWS, 2007. Introduction to Fungi. 3rd editon.
Cambridge University Press, Cambridge, London, United
Kingdom. 1‐841
Wilson B, Erdjument‐Bromage H, Tempst P, Cairns BR, 2006.
The RSC chromatin remodeling complex bears an essential
fungal‐specific protein module with broad functional roles.
Genetics, 172(2): 795‐809
Xiang L, Li Y, Zhu Y, Luo HM, Li CF, Xu XL, Sun C, Song JY, Shi LC,
He L, Sun W, Chen SL, 2014. Transcriptome analysis of the
Ophiocordyceps sinensis fruiting body reveals putative
genes involved in fruiting body development and
cordycepin biosynthesis. Genomics, 103(1): 154‐159
Yang F, Wang J, 2014. Progress of study on zinc finger protein in
the filamentous fungi’s cellulase enzyme gene expression
regulation. Journal of Cellulose Science and Technology,
22(4): 75‐81, 64 (in Chinese)
Yang HQ, Gao HJ, 2007. Physiological function of arginine and
its metabolites in plants. Journal of Plant Physiology and
Molecular Biology, 33(1): 1‐8 (in Chinese)
Yao XW, Zhou M, Cao YY, Jiang YY, 2014. Recent progress of
polyamines in microorganisms. Chinese Journal of
Mycology, 9(2): 114‐118 (in Chinese)
Yu JH, Keller N, 2005. Regulation of secondary metabolism in
filamentous fungi. Annual Review of Phytopathology,
43(1): 437‐458
Zhang HF, Tang W, Liu KY, Huang Q, Zhang X, Yan X, Chen Y,
Wang JS, Qi ZQ, Wang ZY, Zheng XB, Wang P, Zhang ZG,
2011. Eight RGS and RGS‐like proteins orchestrate growth,
differentiation, and pathogenicity of Magnaporthe oryzae.
PLoS Pathogens, 7(12): e1002450
Zhao J, Kwan HS, 1999. Characterization, molecular cloning,
and differential expression analysis of laccase genes from
the edible mushroom Lentinula edodes. Applied and
Environmental Microbiology, 65(11): 4908‐4913
Zolan ME, Tremel CJ, Pukkila PJ, 1988. Production and
characterization of radiation‐sensitive meiotic mutants of
Coprinus cinereus. Genetics, 120(2): 379‐387
[附中文参考文献]
陈美元，廖剑华，李洪荣，蔡志欣，郭仲杰，王泽生，2013.
双孢蘑菇子实体发育后期差异表达蛋白质分析. 菌物
学报，32(5): 855‐861
陈美元，廖剑华，李洪荣，蔡志欣，郭仲杰，王泽生，2015.
双孢蘑菇子实体发育不同阶段蛋白质组分析. 菌物学
报，34(6): 1153‐1164
申进文，粱思思，邱立友，戚元成，2015. 糙皮侧耳子实
体发育相关基因 fst3 的克隆及分析. 食用菌学报，
22(1): 15‐20
王泽生，廖剑华，陈美元，蔡志欣，2012. 双孢蘑菇遗传
育种和产业发展. 食用菌学报，19(3): 1‐14
杨帆，王娟，2014. 锌指蛋白在丝状真菌纤维素酶基因表
达调控中的研究进展 . 纤维素科学与技术，22(4):
75‐81，64
杨洪强，高华君，2007. 植物精氨酸及其代谢产物的生理
功能. 植物生理与分子生物学学报，33(1): 1‐8
姚响文，周密，曹颖瑛，姜远英，2014. 多胺在微生物中
的研究进展. 中国真菌学杂志，9(2): 114‐118
（本文责编：王敏）