全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 2期
pcDNA3. 1( + ) VEGF165载体的
构建及表达蛋白特性分析
邱明 肖明朝 苟欣 杨钰兴
(重庆医科大学附属第一医院泌尿外科,重庆 400016 )
摘 要: 构建含人 VEGF165基因的重组真核表达质粒, 并对其表达蛋白特性进行初步分析。将合成的 VEGF165基因
序列克隆至 pCR2. 1TOPO载体, 测序鉴定证实基因碱基序列无误后, 再克隆至真核表达载体 pcDNA3. 1 ( + ), 构建成 pcD
NA3. 1( + ) VEGF165重组质粒。利用 DNAstar软件分析基因序列并翻译成氨基酸序列, 再用 ExPASy protscale和 P ro tean软件
分析其疏水特性、蛋白二级结构。经基因测序、酶切鉴定和 PCR鉴定证实 pcDNA3. 1( + ) VEGF165重组质粒构建成功。Ex
PASy protsca le和 Protean软件分析表明 VEGF165蛋白具有较好的水溶性。本研究为 VEGF165的基因治疗应用和 VEGF165
蛋白直接治疗勃起功能障碍奠定了基础。
关键词: 血管内皮生长因子 基因克隆 序列测定 基因表达
Construction of pcDNA3. 1( + ) VEGF165 and
Analysis of the Expressed Protein
Q iuM ing X iaoM ingzhao Gou X in Yang Yux ing
(D ep artment of Urology, theF irstAff iliatedH osp ital, ChongqingM edical University, Chongqing 400016)
Abstrac:t It w as to construct the pcDNA3. 1( + ) VEGF165 express ion vector and analyze the expressed prote in. VEGF165 gene
w as c loned to pCR2. 1TOPO vector and then c loned in to the vec to r pcDNA3. 1( + ) a fter sequencing. Tw o so ftwa res ExPASy pro tsca le
and Protean w ere used to ana lyze the hydrophob ic character and secondary structure o f VEGF165 prote in. Results indica ted tha t pcD
NA3. 1( + ) VEGF165 w as successfu lly construc ted and confirm ed by gene sequenc ing and PCR identification. Ana ly sis w ith ExPASy
protsca le and P rotean showed that theVEGF165 pro tein has good w aterso lubility. Indeed, th is resea rch prov ides a foundation for the ap
p lication of VEGF165 in e rectile dy sfunction.
Key words: Vascu lar endothe lia l g row th facto r Gene clon ing Gene sequenc ing Gene expression
收稿日期: 20091028
基金项目:重庆市自然科学基金计划项目 ( 2007BB5288)
作者简介:邱明,男,在读硕士,研究方向:泌尿外科基础与临床; Em ai:l q ium ing9239@ yahoo. com. cn
通讯作者:肖明朝,副教授,硕士生导师; Em ai:l xm z. 2004@ 163. com
血管内皮生长因子 ( vascular endo the lia l grow th
facto r, VEGF)是一种与血管生长有关的特异性细
胞因子, 能与内皮细胞表面的特异性受体 ( flt和
flk1 /KDR )结合, 促进血管生成与增加血管通透
性 [ 1, 2]。近些年,有关 VEGF的研究日渐增多, 研究
表明其主要是通过作用于血管内皮细胞和血管,参
与炎症的发生 [ 3]、缺血损伤的修复 [ 4, 5 ]、肿瘤发生发
展 [ 68]、改善勃起功能障碍 [ 9] 等。VEGF有 5种亚
型, VEGF165是 VEGF家族中发挥生物学效应的主
要成分,高效特异地作用于血管内皮细胞,有强烈的
促分裂和趋化作用,并可增强微血管通透性, 促进
血浆纤维蛋白外渗。可通过内皮细胞上的两个特
殊受体 flt和 f lk1 /KDR作用, 直接刺激内皮细胞
增值并产生纤维蛋白溶酶原激活剂和胶原酶, 促
进内皮细胞移动和血管生成。因此, 对 VEGF165
的研究可以阻止炎症的发生、修复缺血损伤组织、
预防肿瘤的发生发展、甚至可以治疗男性勃起功
能障碍。
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 2期
本试验利用合成的 VEGF165 cDNA (上海英俊
公司提供 ) , 构建真核表达载体 pcDNA3. 1 ( + )
VEGF165并进行鉴定, 在此基础上, 对基因表达
蛋白特性进行分析, 为今后研究基因治疗或提取
纯化蛋白直接治疗炎症、缺血损伤、肿瘤等疾病
和细胞移植促进新生血管形成提供理论依据。
1 材料和方法
1. 1 材料
VEGF165 cDNA由上海英俊公司提供; pcD
NA3. 1( + )、pCR2. 1TOPO载体、感受态大肠杆菌
DH5、DNA连接酶、DNA聚合酶 ( Inv itrogen公司 ) ,
H in d 、Xho I内切酶购自 TaKaR a公司, DNA提取
试剂盒、胶回收试剂盒购自 Omega公司。
1. 2 VEGF165 cDNA的合成
为促进目的基因在真核生物中的转录和翻译,
在目的基因 3!端加入 Kozak序列 ( GCCACC)。通过
GenBank得到人 VEGF165 cDNA 序列 (登录号:
AB021221) ,长度为 576 bp, 合成总目的基因长度
为 582 bp, 再在目的基因的两端插入酶切位点H ind
和Xho I,最后将含有酶切位点的目的基因序列装
入 pCR2. 1TOPO载体为 pCR2. 1TOPOVEGF165。
该步骤交由上海英俊公司完成,并测序。
1. 3 真核表达载体 pcDNA3. 1VEGF165的构建
将 pCR2. 1TOPOVEGF165 载体进行 H in d
、Xho I双 酶 切, 酶 切 体系: pCR2. 1TOPO
VEGF165质粒 ( 100 ng /L ) 20 L、H ind 1 L
Xho I 1 L、10 ∀ Buffer 5 L、ddH2O 23 L, 37# 酶
切 2 h后回收 580 bp片段。目的真核表达载体
pcDNA3. 1( + )也进行 H ind 、Xho I双酶切, 酶
切体系: pcDNA 3. 1 ( + ) ( 200 ng /L) 8 L、H in d
1 L、Xho I 1 L、10 ∀ Buffer 5 L、ddH 2O 35
L, 37# 酶切 2 h后凝胶电泳回收载体。对酶切
目的基因片段和酶切载体进行连接,连接体系: 酶
切目的基因片段 3 L、酶切载体 1 L、5 ∀连接酶
Buffer 2 L、连接酶 1 L、ddH 2O 3 L, 4# 连接过
夜,构建成真核表达载体 pcDNA3. 1VEGF165, 并
将重组载体转化入感受态大肠杆菌 DH 5, 扩增、
提取目的质粒。
1. 4 pcDNA3. 1VEGF165质粒的鉴定
1. 4. 1 测序鉴定 将提取的质粒提供给上海英俊
公司进行测序。
1. 4. 2 酶切鉴定 通过H in d 、Xho I对质粒进行
双酶切,将产物电泳凝胶成像。
1. 4. 3 PCR鉴定 根据目的基因设计引物, 上游
引 物: 5!AAGCTTGCCACCATGAACTTTCTGCTGT
3!; 下游引物: 5!CTCGAGTCACCGCCTCGGCTTGTC
3!。 PCR反应体系: Taq酶 ( 5 U /L ) 0. 5 L、10 ∀
PCR Buffer(M g
2+
free) 5 L、MgC l2 ( 25 mM ) 3 L、模
板质粒 DNA 1 L、dNTP M ix ture( 2. 5 mM ) 4 L、上
下游引物 ( 20 M )各 1 L、ddH 2O 34. 5 L, 产物电
泳凝胶成像。
1. 5 VEGF165蛋白特性分析
使用 DNA star软件将测序基因序列翻译为氨基
酸序列,通过在线蛋白分析软件 ExPASy protscale分
析其疏水特性,再利用 Pro tean软件对蛋白二级结构
分析。
2 结果
2. 1 目的基因 VEGF165 cDNA序列测定及序列分析
VEGF165基因 cDNA由上海英俊公司合成及
测序 (图 1), VEGF165 cDNA为 576 bp;促进真核表
达所加的 Kozak序列为 6 bp; 左右两端分别为 H ind
和 Xho I酶切位点。通过 DNAstar软件对基因序
列进行分析 (图 2), 该基因编码 191个氨基酸,前 26
个氨基酸为信号肽序列,插入位点和读框正确。
图 1 部分测序报告图
132
2010年第 2期 邱明等 : pcDNA3. 1( + ) VEGF165载体的构建及表达蛋白特性分析
划线部分为信号肽序列
图 2 人 VEGF165基因核苷酸序列与氨基酸序列
2. 2 pcDNA3. 1VEGF165质粒的鉴定
提取筛选到的阳性克隆质粒 DNA, 质粒 DNA行
H ind 、Xho I双酶切后,经琼脂糖电泳显示, 凝胶成
像可以看到 570- 600 bp之间有一光亮条带, 表明酶
切得到与 VEGF165 cDNA大小一致的片段 (图 3) ;以
抽提的重组质粒为模板,按前述条件进行 PCR,产物
电泳凝胶成像可扩增约 576 bp的条带 (图 4)。
1.H ind /Xh o I双酶切片段; M. DNA M arker
图 3 pcDNA3. 1VEGF165质粒酶 PCR鉴定
2. 3 VEGF165蛋白亲、疏水性分析
VEGF165基因表达蛋白的亲、疏水性的预测表
明,氨基酸分值最大值为 1. 978, 最小值为 - 3. 222;
在 10- 20位之间有个强的疏水区, 疏水值介于 1 -
2,在 30- 40、100- 120和 130- 140位具有 3个强
的亲水区,亲水值分别介于 - 2至 - 3、- 2至 - 2. 5
和 - 3至 - 3. 5范围内 (图 5)。
1, 2, 3.插入的 VEGF165扩增产物; M. DNA Marker
图 4 pcDNA3. 1VEGF165质粒的切鉴定
133
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 2期
图 5 VEGF165蛋白亲、疏水特性分析
2. 4 VEGF165蛋白二级结构分析
应用 Pro tean软件对 VEGF165蛋白二级结构进
行分析,结果表明, VEGF165蛋白 螺旋区域有 11
个区段, 折叠区域仅一个区段, 转角区域分布较
广,有 15个区段, 无规则卷曲共 10个区段 (图 6)。
A. 螺旋区段; B. 折叠区段; T. 折叠区段; C.无
规则卷曲区段分析
图 6 VEGF165蛋白 Gam ierRobson二级结构分析
3 讨论
VEGF165在促进血管通透性增加、介导血管内
皮细胞分裂、增殖方面均具有强烈效应 [ 10 ] ,其在临
床中的研究日渐增多。目前,主要集中在心血管缺
血疾病、骨折缺血损伤、移植整形美容等方面, 而在
治疗男性勃起功能障碍方面的报道十分少见。在导
致男性勃起功能障碍中一个最主要的因素就是血管
病变 [ 11] , 因此,应用 VEGF165进行基因治疗和提取
纯化 VEGF165蛋白直接治疗勃起功能障碍都具有
重要意义。
本试验组将重组的质粒进行 DNA序列测定、酶
切鉴定和 PCR鉴定, 结果表明已将包含 KOZAK序
列的 VEGF165基因成功插入 pcDNA3. 1( + )质粒,
成功构建了 真核表 达载体 pcDNA3. 1 ( + )
VEGF165。Kozak通过研究起始密码子 ATG周边碱
基定点突变后对转录和翻译所造成的影响, 结果表
明,在真核生物中起始密码子两端序列为 G /N - C /
N - C /N - ANNATGG时 (如 GCCACCATGG、GC
CATGATGG ), 基因转录和翻译效率最高, 特别是
- 3位的 A对翻译效率较重要,该序列被称为 Kozak
序列 [ 12] ,并广泛用于真核表达载体的构建中。Da i
等 [ 13]在构建增强型绿色荧光真核表达载体时插入
Kozak序列后, 研究表明可以促进增强型绿色荧光
蛋白的表达。本试验根据目的基因的序列和促进基
因表达而特意设计加入了提高 VEGF165表达的
Kozak序列。通过对表达蛋白亲、疏水性分析, 结果
提示 VEGF165蛋白有一个较强的疏水区和 3个很
强的亲水区,表明其水溶性较好。蛋白二级结构分
析提示其含有较多的 螺旋, 蛋白质中肽键上的酰
胺氢和羰基氧既能形成内部 ( 螺旋内 )的氢键, 也
能与水分子形成氢键, 与蛋白亲、疏水性分析相
一致。
虽然, 近些年基因治疗技术和蛋白纯化技术得
到很快发展和日渐成熟,但要想将 VEGF165基因和
蛋白治疗应用于临床男性勃起功能障碍,还需要进
一步注意基因导入的安全性、基因表达时间、表达精
确调控和广泛的动物试验研究等问题。
参 考 文 献
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(下转第 161页 )
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2010年第 2期 王五姐等:莱茵衣藻血红素加氧酶 1过表达载体的构建和遗传转化
粒。在现有衣藻核转化中常用的有玻璃珠法或基因
枪法等,这些方法虽在衣藻转化中成功的得到应用,
但也有很多缺点,如转化效率不高, 且需去细胞壁,
或使用细胞壁缺陷型,而缺壁细胞不易培养,容易死
亡。本试验采用农杆菌介导衣藻核转化法在国内尚
属首次,且成功使重组质粒导入野生型莱茵衣藻细
胞内,并获得了能稳定遗传的转化子。此方法易操
作,不需要去细胞壁,可直接转化野生型细胞, 且转
化效率也很高,约是是玻璃珠法的 50倍。
用 GUS染色观察细胞变蓝,说明重组质粒已成
功导入细胞。用 CTAB法提取抗性藻 DNA, 用野生
型藻 DNA做阴性对照, 以质粒 DNA为阳性对照,
PCR扩增大小约为 05 kb的潮霉素磷酸转移酶
HPT基因, 电泳检测后发现, 抗性藻能扩出与质粒
DNA大小一致的条带, 而阴性对照扩不出任何条
带,说明重组质粒已整合到衣藻基因组中,表达水平
分析发现,抗性藻 HO1基因表达量明显高于正常
藻,说明重组质粒能在细胞中过量表达 HO1。从以
上结果可得出本试验已成功构建 HO1过表达载
体,且获得能稳定遗传的转化子,为后续进一步试验
奠定了基础。
参 考 文 献
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