全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2009年第 1期
收稿日期：2008-07-14
基金项目：国家“863”计划（30271372）
作者简介：蔡振荣（1981-），男，硕士，研究方向：生物工程-动物细胞培养
通讯作者：易小萍
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒 （HBV）引起的全
球性传染病。目前研究和生产中应用的重组乙型肝
炎表面抗原 HBsAg 表达系统主要有酵母表达系统
和哺乳动物细胞表达系统。 与酵母表达系统相比，
CHO 细胞表达的重组乙型肝炎表面抗原 HBsAg 更
接近天然形式，表达产物的免疫原性较酵母表达系
统为优，但目前 CHO 细胞表达系统的表达量很低，
因此，研究有效提高 HBsAg 蛋白表达水平的方法，
具有重要的实际应用价值。
PDI 是一种主要存在于内质网腔的 ，55 kD 的
多功能蛋白。其最早被认识的功能是在内质网腔中
催化二硫键的形成，从而促使新生肽链成熟成有生
物活性的蛋白质。 但随着研究深入，多家实验室提
出 PDI 既是酶，同时也具有分子伴侣的活性 [2，3]，认
为 PDI 很可能通过它的多肽结合部位与伸展的或
部分折叠的肽链结合，防止错误的折叠途径 ，促进
正确中间物的形成 。 正因为 PDI 强大的生物学功
能 ， 它已被广泛应用于基因工程外源蛋白的生产
外源 PDI基因导入 CHO细胞及其对 HBsAg分泌的影响
蔡振荣 易小萍 张元兴
（华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237）
摘 要： 在前期的研究工作中发现，当培养基中添加 1.5% DMSO（二甲基亚砜）会使 CHO细胞的 HBsAg（乙肝表
面抗原）产量提高 80%以上。 与此同时，DMSO引起了 HBsAg在细胞胞内的大量积累，其含量提高了 8 倍。 同时，DMSO
引起了 CHO细胞中 PDI（二硫键异构酶）含量降低。 由此怀疑是由于 PDI不足造成了 HBsAg的胞内积累。 根据 NCBI上
查阅到的中华仓鼠小肠中 PDI 基因序列，通过 RT-PCR 的方法，从 CHO细胞中获得了 PDI 序列，并构建重组质粒 pGFP-
PDI。 通过阳离子脂质体转染技术，导入外源 PDI，使各单克隆 CHO细胞的 PDI酶活提高 30%~90%。 但分析这些克隆在
1.5% DMSO下 HBsAg的胞内积累情况，发现没有改善，从而排除了 PDI不足而引起外源蛋白积累的可能。
关键词： 细胞培养 CHO细胞 HBsAg PDI DMSO
Study on Exogenous PDI Gene Transferred into CHO Cells to
Assist in the Secretion of HBsAg
Cai Zhenrong Yi Xiaoping Zhang Yuanxing
（The State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237）
Abstract： The productivity of hepatitis B surface antigen （HBsAg） in recombinant Chinese hamster ovary（CHO）
cells was improved by over 80% at culture medium with 1.5% dimethyl sulfoxide （DMSO） compared to the control
culture. At the same time，DMSO caused the decrease of protein disulfide isomerase （PDI） in CHO，which may be the
reason for HbsAg intracellular accumulation. According to the determined gene sequence provided in NCBI，the PDI
gene of CHO cells was amplified by RT-PCR，and then inserted into the vector. The recombinant plasmid pGFP-PDI
was then transferred into cultured CHO cells with cationic polymer transfection reagent. The PDI activity of each
monoclone was measured. The result showed PDI activity was increased by 30% to 90% compared to the control. But
the overexpression of PDI did not result in the increase of HBsAg secretion. In conclusion， intracellular HBsAg
accumulation of CHO cells by DMSO was unconcerned with the down-regulation of PDI.
Key words： Cell culture CHO cell HBsAg PDI DMSO
2009年第 1期
中，并在大肠、真菌及酵母多种表达系统中成功提
高了外源蛋白的分泌 [4~7]。 在 CHO 细胞中，Nicole 等 [8]
证明 PDI 增量表达能提高外源蛋白的分泌。
本实验室在前期研究工作中尝试在培养基中
添加 1.5% DMSO，结果使 CHO 细胞的 HBsAg 产量
提高了 80%以上，比生产速率提高了 5 倍多。 但与
此同时，DMSO 引起了 HBsAg 在细胞胞内的大量积
累，胞内浓度达到了 982 mg/L，为对照组的 9 倍多，而
胞外 HBsAg 产量的提高远远没有胞内明显。 为深
入了解 DMSO 提高 CHO 细胞生产 HBsAg 的机理 ，
应用二维电泳技术， 比较研究了 DMSO 处理对 CHO
细胞在蛋白质组水平上发生的变化情况。试验结果
显示，在加入 DMSO 后 PDI 的表达量同对照相比发
生了下调。 同时，通过荧光素标记实验，证明小于
2.0%浓度的 DMSO 处理 CHO 时，对 CHO 细胞膜通
透性没有明显影响 [1]。
在前期工作中指出在 DMSO 提高 HBsAg 生产
中，很可能是重组蛋白质的后加工、折叠、运输和分
泌这个环节成为生产量进一步提高的限速步骤 [1]。
蛋白二硫键异构酶在蛋白的后加工修饰和分泌中
起着非常重要的作用。假如新合成的多肽不能及时
得到后加工修饰（如糖基化、形成正确二硫键和高
级结构）， 其就将无法顺利分泌到胞外， 而 HBsAg
又是具有 8 对二硫键的复杂蛋白，结合添加 DMSO
后 PDI 表达量下调的实验现象，有可能是 PDI 含量
不足造成了 HBsAg 在细胞胞内的大量积累。
通过代谢工程的方法改造 CHO 细胞， 提高细
胞内 PDI 的酶活，希望借助该酶的折叠酶及分子伴
侣活性， 提高和完善 CHO 细胞在大量生产外源蛋
白时的加工和修饰能力， 解决 HBsAg 的胞内积累
问题， 从而真正提高 CHO 生产 HBsAg 的产量 ，使
这一工艺在市场上更具备竞争力。
1 材料与方法
1.1 实验材料
表达 HBsAg 的二氢叶酸还原酶缺陷型重组
CHO 细胞，由卫生部武汉生物制品研究所提供。 大
肠杆菌株为 TOP-10 菌株，本实验室保存 。 pEGFP-
C1 质粒为本实验室保存。
1.2 RT-PCR 法合成 CHO 细胞 PDI 基因
用异硫氰酸胍-酚-氯仿法提取 CHO细胞总 RNA。
以 oligo（dT）15 为引物 ，通过反转录合成 cDNA 第
一链。然后用引物 P1：5′-ATGCTGAGCCGTTCCTGCT
GTC-3′，P2：5′-CTACAATTCGTCCTTTATAGTTT-3′，及
高保真 Pfu 酶进行 PCR 得到 1.6 kb 的片段。PCR 反
应条件 ：94℃ ，4 min；94℃ ，30 s，60℃ ，1 min，72℃ ，
100 s，
1.3 分析方法
1.3.1 HBsAg 相对浓度测定 培养液和胞内 HBsAg
的相对浓度均采用 HBsAg 酶联免疫 （ELISA）体外
诊断试剂盒（上海华美生物工程公司）测定。
1.3.2 PDI 酶活测定 不规则 RNase A（sRNase A）
的制备参考 Hillson[9]。PDI 活性分析主要依据 PDI 使
含不规则二硫键的核糖核酸酶 （sRNase A，无 RNA
降解活性 ） 还原成具有正确二硫键的核糖核酸酶
（RNase A，有 RNA 降解活性 ）的速率 ，生成 RNase
A 的速率用 RNase A 对 RNA 的降解速率表示 ，测
定的 A260 变化即可作为衡量酶活性的标准。
2 结果
2.1 CHO细胞中 PDI序列的获得及重组质粒转染
NCBI 上编号为 AF364317 的序列为 Cai 等 [10]从
中华仓鼠小肠中获得的 PDI 基因序列， 而 CHO 细
胞是从中华仓鼠卵巢中分离出的一株细胞系，有理
由相信两者的 PDI 序列具有高度的同源性。
根据 AF364317 序列的 CDS 编码区的头尾设
计上下游引物 P1、P2， 以 RT-PCR 方法用高保真
Pfu 酶扩增从 CHO 细胞中得到了一段 1 600 bp 左
右的序列， 胶回收并克隆到 pMD18-T 载体上送去
测序。 为保证序列正确性，进行重复实验。
测序结果显示基因序列同 NCBI 上中华仓鼠小
肠中获得的 PDI 基因序列相比有 6 个碱基发生了
变化，连续 3 次试验，碱基出现相同变化。通过蛋白
序列比较，发现碱基变化只是同义突变 ，不影响到
氨基酸。 因此获得了 CHO 细胞中 PDI 基因的序列。
通过 PCR 使 PDI 目的基因带上酶切位点 ，并
通过酶切连接反应将 PDI 基因引入 pEGFP-C1，获
得重组质粒（图 1）。 将重组质粒转染 CHO 细胞，抗
药性筛选获得单克隆株。
2.2 克隆株的 PDI 酶活增加
共挑取了 53 个单克隆 ， 其单位总蛋白质的
PDI 酶活和对照相比均有提高 ， 但提高量各不相
蔡振荣等：外源 PDI基因导入 CHO细胞及其对 HBsAg分泌的影响 73
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 1期
同。各克隆 PDI 酶活增加量从 20%~90%，大多数增
加 40%~70%。
2.3 表达外源 PDI对 CHO胞内积累 HBsAg的影响
由于不同克隆株过量表达 PDI 的量各不相同，
故选择 6 个 PDI 增加各不相同的克隆株和对照进
行试验。 这些克隆株编号分别为 3、15、18、33、47、
55，测得 PDI 酶活在 44~66 U/mg 总蛋白之间，分别
比对照细胞的 PDI 酶活提高了 25%~88%。
为了确保试验的严谨性， 在 1.5% DMSO 培养
4 d 后， 测定对照及克隆 15、18、33 的 PDI 酶活，结
果如表 1 所示 。 各克隆株及对照在 DMSO 情况下
PDI 酶活均有下降，这同实验室前期蛋白组学的结
果相一致。 同时，因为对照及单克隆的酶活同时下
降，单克隆相对于对照其 PDI 酶活还是增加的。
表 2 显示在 1.5% DMSO 培养下克隆株同对照
1~4 d 胞内和胞外 HBsAg 浓度。 6 个克隆和对照相
似，在 1.5% DMSO 换液后 2~4 d 后，胞内的 HBsAg
大量增加，而胞外的外源蛋白增加量不多。
图 1 pEGFP-C1 内融合表达 PDI 策略
表 1 添加 1.5%DMSO 对克隆株及对照 PDI 酶活影响

1 d
2 d
3 d
4 d
       
 96 44 289 47 456 63 614 80
 3 90. 50 300 45 477 62 599 82
 15 100 46 280 45 430 70 617 82
 18 80 37 381 53 440 61 527 66
 33 88 41 292 49 400 60 533 75
 47 109 57 315 49 498 67 623 82
 55 104 52 373 57 435 59 603 84

表 2 在 1.5% DMSO 培养下细胞的 HBsAg 生产
图 2 显示了各克隆株的 HBsAg 的胞内积累情
况， 即基本相同的曲线趋势显示了 CHO 细胞中表
达外源 PDI 并不能解决 HBsAg 的胞内积累问题。
3 讨论
试验证明在 DMSO 培养条件下，HBsAg 的胞内
积累并非由于 PDI 不足，而是由其他原因造成。
Raymond [11]等及 Nicole [8]等试图通过提高 CHO
细胞中 PDI 含量来提高蛋白的分泌。 PDI 的增量表
达不仅没有提高蛋白的分泌，对一个蛋白甚至带来
了反效果。 对此，Raymond 等认为 PDI 增量表达促
进蛋白分泌之所以在细菌、酵母、昆虫细胞中获得 成功， 是因为这些外源蛋白生产宿主相对低等，折
10
8
6
4
2
0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5
HB
sA
g，
胞
内
浓
度
/胞
外
浓
度
时间（Day）
图 2 单克隆及对照 HBsAg 胞内积累
◆. 对照 ; ■. 单克隆 3; ▲. 单克隆 15; ×. 单克隆 18;
□. 单克隆 33; －. 单克隆 47; ＋. 单克隆 55
CHO

 PDI
 (U/mg )
1.5%DMSO PDI
 (U /mg )
 35 15
555 15 44 22
555 18 53 24
555 33 66 27

HBsAg 浓度=（OD 值 /细胞数）×106
74
2009年第 1期
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
（ 上接第 71页）
10 胡薛英，谷长勤，程国富，等 .中国预防兽医报，2006，28（3）：
320~322.
11 王晓艳，高宏雷，高玉龙，等.农业生物技术学报，2007，15（4）：
557~561.
12 朱建中，董国维，李俊宝. 江苏农学院学报，1998，19（3）：49~
52.
13 朱红.动物科学与动物医学，2000，17（5）：51~52.
14 鲁会军，金宁一，韩松，等 .中国预防兽医学报，2005，25（5）：
494~496.
15 Starick E，Werner O，Schirrmeier H，et a1. J Vet Med B Infect Dis
Vet Public Health，2006，53（8）：370~375.
16 廖志勇，王压娣，温坤，等.免疫学杂志，2007，23（3）：339~343.
17 李娜，秦爱建，邵红霞，等 . 扬州大学学报（农业与生命科学
版），2007，28（1）：9~12.
18 汪招雄，何启盖，刘丽娜，等 .中国预防兽医学报，2006，28
（2）：220~225.
19 薛琳，夏咸柱，高明华，等. 中国兽医学报，2007，27（3）：343~
346.
20 Russell PH. J Gen Virol，1984，65（4）：795~798.
21 徐建生，李俊宝，董国雄. 中国畜禽传染病，1997，5：17~20.
22 金山，倪龙根，王永坤.中国畜禽传染病，1997，19（6）：57~58.
23 孙志峰，钱永清，闻人楚，等.中国兽医报，1998，18（3）：221~
223.
24 贾强，秦卓明，李莉，等.家禽科学，2005，4：12~14.
25 陈金山，吴玉苹，陈俊杰. 贵州农业科学，2007，35（5）：90~91.
26 汪恭富，杨沈，朱燕，等.中国兽医杂志，2007，43（3）：46~46.
叠复杂蛋白的能力不足， 而 CHO 细胞由于是高等
哺乳动物细胞，因此不存在这个问题。 但 Nicole 等
却在试验中证明 PDI 增量表达确实能在 CHO 细胞
提高外源蛋白的分泌 。 结合 Raymond 等的试验结
果 ，Nicole 等认为 PDI 增量表达在 CHO 细胞是否
能提高外源蛋白的分泌， 存在蛋白特异性的情况，
要根据具体的蛋白及细胞的初始状态进行具体分
析。
分析 HBsAg 在 CHO 细胞胞内大量积累的真正
原因。 首先，李俊辉等 [1]的蛋白质组学研究结果显
示，随着培养基中添加 DMSO 而下调的分子伴侣除
了 PDI 外还有 HSP70、ERP57 等，因此在 CHO 细胞
生产 HBsAg 过程中， 有可能是其他伴侣蛋白的不
足造成了 HBsAg 的胞内积累；其次，错误的蛋白糖
基化或糖基化不足也可能造成蛋白质积累在胞内[12]。
参考文献
1 Li J，Huang Zhang Y. Enzyme Microb Technol，2006，38：372~380.
2 Wang CC，Tsou CL. FASEB J，1993，7：1515~1517.
3 Puig A，Gillbert HF. J Biol Chem，1994，271：33664~33669.
4 Ostermeier M，De Sutter K，Georgiou G. J Biol Chem，1996，271：
10616~10622.
5 Wunderlich M，Glockshuber R. J Biol Chem，1993，268：24547~
24550.
6 Shusta EV，Raines RT，Pluckthun A，Wittrup KD. Nat Biotechnol，
1998，16：773~777.
7 Hsu TA，Watson S，Eiden J，Betenbaugh MJ. Protein Expr Purif，
1996，7：281~288.
8 Borth N，Mattanovich D. Biotechnol Prog，2005，21：106~111.
9 Hillson DA，Lambert N，Freedman R. Methods Enzymol，1984，107：
281~294.
10 Cai TQ，Guo Q，Wong B. Biochimica et Biophysica Acta，2002，
1581：100~108.
11 Raymond D，Schooley K. Biotechnol Prog，2000，16：736~743.
12 Marquardt T，Helenius A. J Cell Biol，1992，177：505~513.
蔡振荣等：外源 PDI基因导入 CHO细胞及其对 HBsAg分泌的影响 75