全 文 ：生物杖术通报
· 研究报告 · 刀了口了百 付 口乙 《 年增刊
辽东湾斑海豹遗传多样性的 分析
赫崇波 ‘ 高祥刚 ‘ 孙凡越‘, 鹿志创 ’ 马志强 ‘ 韩家波 ,
’辽宁省海洋水产科学研究院 , 辽宁省海尖水产分子生物学重点实验室 , 大连
, 辽宁师范大学 生命科学院 , 大连
摘 要 利用 !标记技术对辽东湾斑海豹的遗传多样性进行分析 。 采用 对 ! 引物对斑海豹 个
群体按不 同采样年份分类 个个体扩增共得到 个位点 , 个群体内的多态位点比例 为 一 ,
总多态位点比例 为 。 群体的香农 多样性指数为 一 , 群体间的遗传距离在
之间 。 年群体的多态位点比例 、 多样性指数均高于 年群体 , 年群体处于中等水平。
用 软件进行个体聚类及 !∀ 方法构建的群体系统树 , 发现 个群体的个体基本随机聚到一起 , 界限不
十分明显 , 说明 年的群体差异不明显 , 甚至可 以认为它们是混合群体。 结果表明 , 斑海豹群体遗传多样性水平较
低 , 遗传结构趋于简单化 , 且存在较强的基因交流 。
关键词 斑海豹 遗传多样性 分析
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甲 ! ∀ #∃ %&#∋ (叩er. A total of 24 1 re pro dueible bands am plifi ed 板th seven A F LP pri m er eom b inat ions
w ere obtai ned 加m 43 individuals. Th e percentage of polym o甲hie loei (P ) ra nged fro m 80 .45 % to 95 .85 % wi th in th e
th re e years an d th e overall perc ent铭e of polym o甲hie loei w a s 99 .5 9 % . T h e m ean h erero zy即sity ( H ) w as 0 .3 169 , 0 .
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K e y w o rd s : Spo tted seal ( Ph oea la rg} 己a ) Ge n e t ie d iv e r s ity A F L P a n al y s i s
斑海豹(Ph oea La rgh a )属食肉目(C arn ivora ) 、
犬形亚目 (C anifo rm ia ) 、海豹科 (Phoeidae ) 、斑海豹
属(Ph oc a ) , 主要分布于北太平洋的北部和西部海
域及其沿岸和岛屿 。 在我国主要分布于渤海和黄
海 , 偶见于南海 〔’川 。 渤海辽东湾结冰区是全球斑
海豹 8个繁殖区(辽东湾 、符拉迪沃斯托克 、挞靶海
基金项 目:国家海洋908 项 目辽宁专项 (项 目编号 :LN一08 刀 1习1伪)资助 ;国际爱护动物基金会赞助项目(IF A W )
作者简介:韩家波(1962一 ) , 男 ,研究员 , 研究方向:海洋动物保护;E 一 m ail : J bh an @ s i na . C o m
健物杖术通报 B io te chn口勿舒 2008 年增刊
峡 、萨哈林岛东海岸延伸至北海道岛北部 、舍利霍夫
湾 、卡拉金湾至奥柳托尔斯基角 、阿纳德尔湾 、布里
一斯托湾至普里 比洛夫群岛)中最南的一个[’〕, 并
且斑海豹是唯一能在我国海域进行繁殖的海兽 , 它
具有较高的经济价值 , 人们为了获取海豹的皮张和
生殖品而大量捕杀 , 特别是对幼仔的猎捕 , 使资源遭
到了严重的破坏 , 数量急剧锐减 。 研究人员发现斑
海豹种群呈现出一定程度的繁殖集中 , 可能是由于
他们来 自不同的种群 , 然而 , 斑海豹的游动能力强 ,
移动距离远 〔4〕, 尽管斑海豹遗传关系并没有被确
认 ,但可以推测斑海豹在游动过程中会发生遗传交
换[’一’] 。 因此探讨斑海豹遗传多样性和进化适应性
以及对斑海豹个体进行 DNA 指纹分析 , 建立 D NA
指纹库等工作具有重大意义 。
目前只有韩家波等「8」利用辽东湾斑海豹线粒
体 ND4 、 tR N A Ars 、 N D4 L 和 N D3 基因序列进行的系
统分化研究 , 且利用线粒体 DN A 的一段包括部分苏
氨酸和脯氨酸 tR N A 基因及部分控制区序列进行的
种群遗传学研究图 , 另有 Mi zu n。 等利用线粒体
DNA 控制区序列对 日本海斑海豹种群进行的遗传
结构的研究【’。] , 此外 Go ed m a。 用微卫星 D N A 分析
法对欧洲港海豹多态性进行了分析研究 , 研究结果
表明 , 欧洲港海豹种群存在复杂的遗传差异 [川 。
而利用 A F廿 技术对斑海豹进行遗传学方面的
研究还鲜有报道 。 A F 廿 结合了 RFLP 、 R A P D 和
PC R 三者的优点 ,但省去了 R FLP 的繁琐过程 , 同时
又克服了 RA PD 技术不稳定的缺点 , 具有分辨力高、
重复性好、信息量大 、灵敏度高等优点 , 被认为是最
为有效的分子标记方法之一 , 特别是近年来在水生
动物的遗传分析中得到了广泛应用[”) 。 利用 A F廿
分子标记技术 , 对辽东湾斑海豹进行了遗传多样性
分析 , 旨在反映其基因丰富程度及基因多样性的分
布 , 揭示不同年龄斑海豹之间的遗传相似性 、复杂性
和系统发生关系 , 为有效地研究我国斑海豹资源提
供理论依据 。
1 材料与方法
1. 1 材料
斑海豹家族平时聚集成群 , 而每到繁殖期(每
年 1月初至 2 月上旬) , 就按照严格的一夫一妻制 ,
成对产仔 , 通常是一胎产一仔。 辽东湾北部的双台
子河 口附近是斑海豹的繁殖区和聚集地 , 按照斑海
豹的生活习性 , 从2005 年起连续 3 年于每年 2 月底
到双台子河 口处采样 , 采集全身批满白色绒毛的 1
月龄斑海豹幼仔的毛发 , 用蒸馏水洗涤后放人盛有
75 % 酒精的 1.sml 离心管中 , 并按采样年份不同分
为:20 5 年群体(PZ o s ) 、 2 0 6 年群体 (咒006 )和
20 7 年群体(咒0 7) 。 如表 1所示 :
表 1 3 个群体的斑海豹样品
群体名称 采集时间 采集地点 采样数量 出生年份
、J‘U,才内乙,‘辽东湾北部的双台子河 口附近
辽东湾北部的双台子河 口 附近
辽东湾北部的双台子河 口 附近
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16
0567
,‘,乙
00咒咫
1 . 2 基因组 D N A 的提取—毛囊 DN A 提取资料显示〔”〕, 0 ℃下动物毛能保存 3 个月左右
而不影响 D N A 的提取 , 所以适用于短期 、小量的
D N A 样品的分子标记分析 , 如微卫星分析 、扩增酶
切片断多态性分析等 。
1
.
2
.
1 毛囊裂解液 的配置 :1 x PC R 缓 冲液(50
m m oF L K Cx, l o m m o F L T 五s · C I , 0 . 0 1 % 明胶 ) , 加
M gelZ至 2 m m oF L , 蛋白酶 K Zo m岁L , 每管分装
15 林l裂解液 。
1
.
2
.
2 D N A 的提取 :取 5 根含有毛囊的毛发 , 用双
蒸水洗涤 , 再用滤纸吸干毛发表面水分后 , 将毛囊浸
入裂解液中 , 65 ℃ 恒温箱中放置 30 m in , 95 ℃ 恒温
箱中放置 巧m in , 而后 4℃ 冰箱中放置 10 m in , 吸取
上层清液 , 即为所提取的毛囊基因组 D N A 。
1
.
3 A F LP 分析
AF廿实验操作程序基本参照 vos〔‘4 〕和赫崇波
年增刊 赫崇波等 :辽东湾斑海豹遗传多样性的 A FLP 分析 34 9
等[” ] , 并作了少量修改 。 所用限制酶 、接头和引物
等均购自上海生物工程有限公司。 基因组 DN A 用
Ec 0R I 和 Ms 。 I 进行双酶切 , 加人接头 , 用 T4 连接
酶连接 。 预扩增引物为加 1个碱基的 E00 一灯M00-C , 选择性扩增引物含 3 个选择碱基 (引物及接头序
列见表2) , 经引物筛选后 , 从扩增条带数 目适中 、清
晰的引物组合中选取 7 对引物「E32 M 61(Eo 一 A A C ,
M O O
一
C T G )
、
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,
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一
C
GT ) 和 E35M 58 ( E00-
AC A , M O O 一C G T ) 〕对 以上 3 个斑海 豹群体进行
AF廿 分析 。 扩增产物在 4 .5% 的变性聚丙烯酞胺
凝胶上电泳分离 , 银染后统计带型 。
表 2 用于 A FLP 分析的接头和引物序列
内切酶 接头序列 引物序列
5 ’一C T C G T A G A C T G C ( ; T A C C 一3 ‘
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G A T G A G T C C T G A G T A A N N N
一
3
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注:Eo :5’一G A C T G C G T A C C A A 竹C一 ’ ; M (X) : 5 ’ 一G A T G A G T C C T C A GT A A 一 ’ , N :选择碱基
1.4 数据整理与分析
利用分析软件Cro ss Cheekerversion 2.9 进行谱
带识别和分析 , 电泳图谱中有带记为 “ 1 ” , 无带记为
“
0
” , 缺失记 为 “ . ” , 获得 O 、 l 矩 阵。 用 p0 P-
G E NEI .32 软件计算出等位基因数 、 S ha rm on 多样性
指数(I) 、 N e i ’ s 基因多样性指数(万)和 N ei’ , [ ’6 ]遗
传距离(D ) , 根据个体间遗传距离矩阵 , 用 PH YLIP
3.62 的 Neigh bor 模型以 U p G M A 方法对群体进行
聚类分析 , 并用 NTSY S 软件进行个体聚类 。
2 实验结果
2.1 A FLP 扩增结果
7 对引物组合共扩增出 241 条清晰可辨 、可重
复的条带 , 平均每个引物组合扩增出34 .4 条带 。 片
段大小在 100 一 1 3 0 b p 之间(图 l) 。
2
.
2 群体遗传多样性
应用 Po PG EN E 数据处理软件对 3 个群体进行
遗传多样性分析 (表 3) , PZ o s 、PZ o 6 和 P2 007 共3
个群体的多态性位点比例分别为 84 .65 % 、 80 . 45 %
和 95.85% , 平均杂合度分别为 0.3169 、 0 . 2 8 3 8 和
0.3727 , S h a n n o n 多样性指数分别为 0.4090 、 0 . 3 8 1 7
和 0 .4716 。 可 以发现 , 2 0 07 年群体的多态位点比
例 、杂合度和 Shan no n 多样性指数均高于 2006 年群
体 , 2 0 05 年群体处于中等水平 。
图 1 引物对 E4 5M 58 对 3 个群体的 A FLP
扩增电泳图 (M : 100bp )
表 3 斑海豹3 个群体的遗传结构
群体 多态位点比例 基因多样性H
香农指数
I
咫0 5 84 .65 % 0 .3169 0 .4090
PZ o 6 80 .45 % 0 .2838 0.3 817
凡0 7 95 .85 % 0 .3727 0.47 16
总体 99 .59 % 0 .4 103 0.59 15
生物技术通报 B 勿te ch noto 舒 2008 年增刊
表4 斑海豹3 个群体间遗传相似度《I) 和遗传距离(D )
群体
Populat ion 咫0 7 咫0 6 咒0 5
* * * *
0 .7420
0 .8285
0.2984
* * * *
0 .1742
0 , 4 0 2 3
0
.
6 6 8 8
* * * *
根据 Nei ’ S ! ’‘〕的方法计算群体间的无偏遗传相
似性指数和遗传距离 , 结果发现 , 咫005 和 P2 007 的
遗传距离最近 , 遗传距离 和遗传相 似度分别 为
0.1742 和 0.8285 ;而 咫005 和 咫006 的遗传距离最
远 , 遗传距离和遗传相似度分别为 0.4023 和 0.
6688 。
2
.
3 聚类分析
用 pH Y LIp 的 Neighbor模型以 U p G M A 方法对
群体进行聚类分析 , 发现 2006 年群体单独成为一
支 , 2 0 5 年群体和 2007 年群体聚到一起 。 用 N T-
SYS 软件进行个体聚类 , 发现 3 个群体的 43 个斑海
豹不能明显聚类(图 2 ) ,但是 2006 年群体多数聚在
一起 , 2 0 05 年和 2007 年群体交互聚类 。
曰
目日
匕一州
l——州尸州匕一一一川 一一一{
07 3
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图2 斑海豹3 个群体个体聚类图
3 讨论
3.1 毛囊 D NA 提取
斑海豹是一种经济价值很高的珍贵海洋哺乳动
物 , 也是一种很好的观赏动物 , 在《国家重点保护野
生动物名录》中被列为国家二级保护动物 。 辽东湾
是我国最重要的斑海豹繁殖栖息地 , 近年来对辽东
湾斑海豹的科学研究和保护工作正不断得到重视和
加强 「8 , 9 , 17 ] 。 加强斑海豹种质资源的保护 , 借助
分子生物学手段进行遗传多样性分析是一种行之有
效的方法 , 而斑海豹 D N A 的获得则是进行分子生物
年增刊 赫崇波等:辽东湾斑海豹遗传多样性的 A FL P 分析 35 1
学研究的基本条件之一 。 提取 D NA 的方法有很多 ,
对于动物体 , 可 以从肌 肉 、肝 、 肾等组 织中提取
D NA , 也可以从血液中提取 DN A , 还可 以从毛囊中
提取 D N A 。 王庆林等在提取南阳黄牛被毛 D NA 时
采取毛囊提取法[’8 〕, 胡钮娟等曾做过大鼠毛发核酸
提取方法的比较[’9 〕, 赵春江等也曾用简易方法从
猪毛发中提取 D N A[ zo] 。 对于濒危动物东北虎 , 张
于光等考虑到采样困难 、样品稀少等原因 , 在东北虎
微卫星 D N A 遗传标记的筛选及亲子鉴定的研究中
也采用了毛发 DN A 提取法【川 。 对于生活在水中且
周身长满致密短毛的活体斑海豹 , 采集其肌肉组织
或是血液都会影响到斑海豹的生活或者会造成斑海
豹肌体感染细菌而致病 , 甚至对这种濒危动物的生
存带来威胁 , 而采集斑海豹毛发 , 从毛囊中提取
D NA 就能克服诸多不足瞬〕, 并达到保护斑海豹的
目的。 毛囊 DNA 提取法这种非损伤性 DN A 分析法
应用于海洋濒危哺乳动物 , 有利于进一步研究海洋
动物的遗传多样性 , 加强对濒危动物物种的保护 , 有
一定的推广意义 。
3
.
2 遗传多样性分析
本研究利用 A F廿 分子标记对 咫005 、咒006 和
PZ o 7 3 个斑海豹群体进行了遗传多样性研究 。 根
据分析结果 , 20 06 年群体扩增 出的位点数小于
2005 、 2 0 0 7 年群体 , 多态位点比例 、 预期杂合度和
Shannon 指数也小于 2005 、2 0 0 7 年群体 , 同时群体聚
类和个体聚类分析也表明 咫005 和 咫007 聚为一
支 , 2 0 6 年群体倾向单独聚类 , 这些结果表 明 ,
20 05
、
20 07 年群体亲缘关系更近一些 。 正常动物种
群不同年份样品不应该有明显 的遗传差异 , 辽东湾
斑海豹种群可能是由于数量较少 , 每年仅在繁殖期
间回到辽东湾结冰区 , 不同年份斑海豹都具有一定
的独立性 , 20 06 年取样个体可能来 自关系较近 的家
族或群体 , 所以 2006 年的遗传特征更相似 , 从本实
验中也可以推测出辽东湾斑海豹群体规模较小 。
但是 A FLP 标记是显性分子标记 , 不能区分杂
合和纯合位点 , 在群体遗传结构分析方面有一定局
限性 , 因此想要推测斑海豹的群体遗传多样性有必
要结合其他共显性分子标记进行深人的研究 。 尽管
本研究中分析的个体数量偏少和取样范围较狭窄 ,
但却可以在一定程度上反映出辽东湾斑海豹群体遗
传多样性水平较低 , 遗传结构趋于简单化 , 且存在较
强的基因交流等问题 。
3
.
3 辽东湾斑海豹群体的现状和今后我们的工作
目标
在渤海辽东湾 , 斑海豹的资源量曾经十分丰富 ,
在 1930 一 1 9 4 0 年的普查时有7 000 一 5 0 0 头〔‘, , , , ] ,
目前资源数量仅有 1 00 头左右 , 补充世代逐年减
少 , 危及了种群的延续能力 , 实属濒危物种[’4 ] , 从而
导致了辽东湾斑海豹的遗传多样性水平相对较低 。
分析主要原因有以下两点 , 首先是过度捕猎;其次是
辽东湾是斑海豹边缘分布区 , 加上渤海海域污染的
加剧 , 使得斑海豹的生存和繁殖环境受到严重破
坏[’〕。 为下一步进行深人地分析辽东湾海域斑海
豹的资源状况奠定了基础 。
参 考 文 献
1 王者茂 , 王巫烈. 斑海豹 · 动物学杂志.北京:海洋出版社 ,
1 9 9 0
.
2 王巫烈. 海洋学报 , 1 9 8 5 , 7 ( 2 ) : 2 0 5 一 2 1 1 .
3 D a vi d J R
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4 肠w ry LF , e t al . Po l ar B i o , 1 9 9 8 , 1 9 : 2 2 1 一 2 3 0 .
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7 F e d o se e v G A
.
N O A A T e e h R e P N M F S , 1 9 8 4 , 1 2 : 4 9 一 5 4
.
8 韩家波 , 赫崇波 , 等. 水产科学 , 2 0 6 , 25 ( 10 ) : 5 0 一 5 04 .
9 韩家波 , 赫崇波 , 等. 水产科学 , 2 (X) 7 , 2 6 ( 2 ) : 74 一 78 .
1 0 M iz u n o A W , e t al
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2
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1 1 C o o d m a n S J
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M o l B io l E vo l
,
1 9 9 8
,
1 5
(
2 )
:
1
04
一 1 1 8
.
12 王伟继 , 岳志芹 , 等.海洋水产研究 , 2 0 0 5 , 2 6 ( 1 ) : 8 08 一 8 1 .
1 3 郑冬. 野生动物 , 1 9 9 8 ( 2 ) : 2 4 一 2 6 .
1 4 V o s P , et al
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N
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,
2 3
(
2 1 )
:
4
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一
4 1 4
.
1 5 赫崇波 ,丛林林 , 等. 中国水产科学 , 2 0 5 , 1 5 ( 2 ) : 2 1 5 一 2 2 1 .
1 6 N e i M , L i W H
.
P
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N
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A
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,
1 9 7 9
,
7 6 ( 1 0 )
:
5 2 6 9
一 5 2 7 3
.
17 董金海 , 沈峰. 海洋科学 , 1 9 9 1 ( 3 ) : 27 一 31 .
18 王庆林 , 梁子安 , 等.河南农业科学 , 2 0 5 ( 7 ) : 95 一 % .
19 胡饪娟 , 等. 临床耳鼻咽喉科杂志 , 2 0 5 ( 5 ) : 2 8 一 2 90 .
2 0 赵春江 , 李宁. 遗传 , 2 0 3 , 2 5 ( 1 ) : 69 ~ 70 .
21 张于光 , 李迪强 , 等. 动物学报 , 2 0 0 3 , 4 9( 1 ) : 1 18 一 12 3 .
2 王庆林 , 梁子安 , 等. 河南农业科学 , 2 0 5 ( 7 ) : 95 一 % .
23 王王烈.水产科学 , 1 9 93 , 12 ( 1 ) : 4 一 7 .
2 4 韩家波 , 王炜 , 等.海洋环境科学 , 2 0 5 , 2 4( 1 ) : 5 1 ~ 53 .