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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 3 期
广东省平胸龟遗传多样性的 RAPD分析
于冬梅1 彭建军1 沈梓粤2 王莹2
(1华南濒危动物研究所物种鉴定中心，广州 510260;2暨南大学生命科学技术学院，广州 510632)
摘 要: 由于栖息地的破坏和人为的滥杀滥捕，平胸龟野外资源数量急剧下降，现已处于濒危状态。将 13 条可重复的、
扩增图谱清晰的 RAPD引物用于广东省内 20 个平胸龟个体的遗传多样性分析。扩增所得的条带显示，多态性位点含量为
60． 71%，Nei’s基因多样性指数为 0． 1196，Shannon’s多样性信息指数为 0． 1966，表明平胸龟遗传多样性仍较丰富。同时，计
算 20 个个体间遗传距离为 0． 0507 － 0． 2925，并采用 UPGAM 方法绘制聚类分析树状图，20 个个体聚类较分散，主要聚为 1 个
大群体，表明广东省内的野生平胸龟并没有形成明显的种群的分化。了解平胸龟的遗传现状、种群结构，可为该物种的种质
资源保护、野生资源恢复与利用提供理论依据。
关键词: 平胸龟 遗传多样性 RAPD
Genetic Diversity Analysis of Platysternon megacephalum in
Guangdong Province by RAPD Technique
Yu Dongmei1 Peng Jianjun1 Shen Ziyue2 Wang Ying2
(1Species Identification Center，South China Institute of Endangered Animals，Guangzhou 510260;
2College of Life Sciences ＆ Technology，Jinan University，Guangzhou 510632)
Abstract: The big-headed turtle(Platysternon megacephalum)has become increasingly more endangered due to habitat loss and
poaching． Here，genetic diversity of 20 individuals sampled in Guangdong was analyzed using 13 arbitrary primers． The proportion of
polymorphic loci was 60． 71%，with the Nei’s gene diversity and the Shannon information index was 0． 1196 and 0． 1966，respectively．
The genetic distances among 20 individuals were found to be 0． 0507 to 0． 2925． The dendrogram，obtained by UPGMA analysis，showed
that 20 samples could be one group． In order to make protection measures for conservation or recovery of wild resources，the genetic di-
versity and population structure should be studied．
Key words: Platysternon megacephalum Genetic diversity RAPD
收稿日期:2010-09-03
基金项目:广东省自然科学基金项目(9151026001000003) ，广东省科学院优秀青年科技人才基金项目(200704) ，广东省野生动物保护和利用
公共实验室基金项目(200901)
作者简介:于冬梅，女，硕士，助理研究员，研究方向:动物遗传学;E-mail:yudongmei50@ 163． com
通讯作者:彭建军，博士，教授，主要从事物种司法鉴定、保护生物学和分子遗传研究;E-mail:jjpeng74@ sina． com
龟类动物正面临全球性的灭绝［1］，亚洲龟中一
半以上都已濒危或濒临灭绝［2］。平胸龟(Platyster-
non megacephalum) ，隶属平胸龟科(Platysternidae)、
平胸龟属(Platysternon) ，该属仅平胸龟 1 种［3］，是亚
洲特产龟类，主要分布于缅甸、泰国、老挝、越南及我
国南部地区［4］。由于栖息环境破坏及人类活动影
响，其数量急剧减少，现已列于《濒危野生动植物种
国际贸易公约》附录Ⅱ，属濒危保护动物［5］。若干
年来，我国对平胸龟的研究多局限于形态分类方面，
但随着平胸龟数量的急剧减少和分子生物学手段的
飞速发展，国内也逐渐开展平胸龟遗传水平的研究，
已报道的可见利用 ISSR［6］、RAPD［7］和线粒体［8］等
技术对其进行群体遗传差异及遗传多样性的研究。
了解平胸龟的遗传现状可为其资源保护、野生资源
恢复与利用提供理论依据。
RAPD(random amplified polymorphic DNA)是建
立在 PCR基础上的分子标记技术，具有灵敏度高、多
态位点丰富、简单和快速等优点［9］，被广泛应用于生
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物的遗传多样性，种群鉴定，种间或种内亲缘关系及系
统进化，遗传多样性分析，杂交育种等研究领域［10，11］。
本研究采用 RAPD技术对广东省平胸龟的遗传多样
性进行分析，以期为平胸龟的种质资源保护提供一定
的理论依据。
1 材料和方法
1． 1 样品及 DNA提取
本研究所用 21 个平胸龟个体均取自广东省野
生动物救护中心，属广东省内野生个体。剪取平胸
龟的尾尖(未至流血) ，无水乙醇浸泡，置于 － 20℃
备用。所有样品均使用 EZgeneTM Tissues gDNA Kit
(Biomiga)提取基因组 DNA，4℃保存。
1． 2 引物序列及筛选
本试验所用 25 条 RAPD 引物购自上海生工生
物工程技术服务有限公司。随机选取 4 个个体对引
物进行筛选，共获得 13 条扩增条带清晰、重复性好
的引物，引物信息见表 1。
1． 3 PCR扩增
PCR扩增体系为 10 μL，其中模板 DNA 1 μL(约
0. 5 ng) ，引物 0． 4 μL(10 μmol /L) ，5 μL premix Ex
Taq 酶(TaKaRa) ，加灭菌水至 10 μL。反应程序:
95℃预变性 5 min;95℃变性 40 s，36℃退火 40 s，72℃
60 s，进行 45个循环;再 72℃延伸 10 min。PCR反应
结束后，取4 μL扩增产物在2%的琼脂糖凝胶中电泳
检测，分子量标记选用 DL2000，拍照保存结果。
1． 4 数据处理与统计分析
利用 Gelpro4． 5软件分析图片，将电泳图谱的条
带记为“1”，无条带的记为“0”，生成“0”和“1”原始矩
阵，采用 POPGENE 1． 32软件，计算多态位点数、多态
位点比例、Shannon 信息指数(I)、Nei’S 基因多样性
(H)及每位点有效等位基因数(Ne)。采用 NTSYSpc
(2． 10)软件计算各样品的遗传距离，UPGAM 方法绘制
聚类分析树状图。
2 结果
用 13个可重复的、扩增图谱清晰的 RAPD引物对
平胸龟的 21个个体进行 PCR扩增。结果(图 1，图 2)
显示，第一个个体在所有引物中均为扩出产物，故所有
统计实际用 20个个体。20 个个体在 13 个引物中，扩
增谱带的分子量大小在 100 －2 000 bp之间，扩增的位
点总数为 84，筛选到有多态性的引物为 12个(表 1)。
M． DL2000 Marker;22．阴性对照
图 1 引物 S103 对 21 个平胸龟 RAPD扩增的电泳图
M． DL2000 Marker;22．阴性对照
图 2 引物 S114 对 21 个平胸龟 RAPD扩增的电泳图
表 1 13 条引物序列及 RAPD扩增结果
引物
引物序列
(5 － 3)
位点
数
多态位
点数
引物
引物序列
(5 － 3)
位点
数
多态位
点数
S101 GGTCGGAGAA 8 8 S111 CTTCCGCAGT 4 2
S103 AGACGTCCAC 7 4 S112 ACGCGCATGT 13 10
S104 GGAAGTCGCC 7 5 S114 ACCAGGTTGG 10 6
S105 AGTCGTCCCC 6 3 S115 AATGGCGCAG 6 5
S107 CTGCATCGTG 9 5 S117 CACTCTCCTC 4 1
S108 GAAACACCCC 4 1 S119 CTGACCAGCC 3 0
S109 TGTAGCTGGG 3 1
2． 1 POPGENE分析结果
数据转化为“0”和“1”矩阵后，采用 POPGENE
1． 32 软件计算，结果表明，扩增产物的多态位点数
为 51 个、多态性位点占 60． 71%。平均每个位点有
效等位基因数 Ne = 1． 1798，Nei’s 基因多样性指数
H = 0． 1196，Shannon’s多样性信息指数 I = 0． 1966。
可见，广东省内平胸龟具有较高的遗传多样性。
2． 2 NTSYSpc分析结果
经 NTSYSpc(2． 10)软件计算各样品的遗传距离
(表 2) ，20个个体间遗传距离为 0． 0507 － 0． 2925，同
时采用 UPGAM 方法绘制聚类分析树状图(图 3) ，20
个个体聚类较分散，主要聚为 1个大群体。
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图 3 基于 13 个 RAPD引物构建的平胸龟 20 个个体的聚类图
3 讨论
由于栖息地的破坏和人为的滥杀滥捕，平胸龟
野外资源量急剧下降，现已处于濒危状态。一个物
种的濒危是内外因共同作用的结果，物种生境的丧
失和破坏、人类对物种的过度开发都严重威胁了物
种的生存;而物种遗传基础的强弱决定了物种适应
力的大小，遗传基础薄弱的物种适应生境变化的潜
力相对较小，更易因遭受生境改变的影响而绝灭。
在对濒危物种的研究中，有学者认为濒危物种具有
较低的遗传多样性水平［12］，同时也有学者提出濒危
物种也可保持较高的遗传变异水平［13］的观点。本
研究将 13 条可重复的、扩增图谱清晰的 RAPD引物
用于广东省内 20 个平胸龟个体的遗传多样性分析。
扩增所得的条带显示，多态性位点含量为 60． 71%，
Nei’s基因多样性指数 H = 0. 1196，Shannon’s 多样
性信息指数 I = 0． 1966，表明平胸龟遗传多样性仍较
丰富。郑光明［14］对广东和福建的平胸龟居群进行
RAPD 分析，得到的广东种群内的多态性比例为
56. 94%，福建为 47． 85%;马丽莎［7］在对福建寿宁
的 21 个平胸龟个体的 RAPD分析中，发现其多态性
比例为 55． 97%，可见，平胸龟具有较高的遗传多样
性;马丽莎［6］利用 22 个 ISSR 引物的研究平胸龟遗
传多样性也得到类似结果。濒危物种数量一定程度
的减少，并不一定影响其遗传多样性水平，然而严重
的个体数量减少必定导致遗传漂变和近亲繁殖，这
将造成物种遗传多样性水平的降低［15］，最终成为许
多物种致濒的原因。目前，平胸龟野生资源急剧减
少，虽已处于濒危状态，却仍具有较丰富的遗传多样
性，这有利于平胸龟野生资源的保护及资源恢复。
深入分析平胸龟的遗传结构及种群状况，对探
讨其濒危机制、生态适应及进化潜能非常重要。本
研究计算得到 20 个个体间遗传距离为 0． 0507 －
0. 2925，并采用 UPGAM 方法绘制聚类分析树状图，
发现 20 个个体聚类较分散，主要聚为 1 个大群体，
这表明广东省内的野生平胸龟并没有形成明显的种
群的分化。随着平胸龟资源量的减少，将逐步影响
该物种种群格局及物种遗传力，应在平胸龟仍具有
良好遗传多样性的状态下，充分了解其遗传多样性
和种群结构，制定适当的保护策略。
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(责任编辑 狄艳红
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