全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 7期
基因打靶技术在乳腺生物反应器中的应用
朱超 1, 2 　冯宝刚 1, 2 　张明 2 　关伟军 1 　马月辉 1
(1 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 , 北京 100193; 2 广西大学动物科学技术学院 ,南宁 530004)
　　摘 　要 : 　利用转基因动物的乳腺生产人类重组蛋白 ,可以获得安全而有效的药用蛋白。目前采用的转基因技术由于其
固有的局限性 ,未能使乳腺生物反应器的研究取得长足的进步。基因打靶克服了随机整合的盲目性和危险性 ,是一种理想的
修饰、改造生物遗传物质的方法。简述了制备乳腺生物反应器过程中靶细胞、基因打靶的策略、打靶位点及问题 ,并对其发展
方向进行了小结及展望。
关键词 : 　基因打靶 　乳腺 　生物反应器 　打靶策略 　打靶位点
The Application of Gene Targeting in the Mammary Gland Bioreactor
Zhu Chao1 　Feng Baogang1, 2 　Zhang M ing2 　Guan W eijun1 　Ma Yuehui1
(1 Institu te of B eijing Anim al Science and Veterinary, CAAS, B eijing 100193; 2 College of Anim al
Science and Technology, Guangxi University, N anning 530004)
　　Abs trac t: 　The p roduction of human recombinant p roteins in m ilk of transgenic animals offers a safe and cost2effective source of
commercially p roteins that cannot be p roduced as efficiently in adequate quantities by other methods1 But the current transgenic tech2
nologies have its lim itation, thus, resulted in p reventing the development of mammary gland bioreactor1 Gene targeting as an ideal meth2
od of modifying and modifying organism s genetic material, could overcome the risk and the blindness of the random integration1The ar2
ticle reviewed the selection of gene targeting cells, targeting strategies, targeting gene locus, aswell as p roblem s and p rospects of develo2
p ing mammary gland bioreactor of transgenic animals1
Key wo rds: 　Gene targeting　Mammary gland　B ioreactor　Targeting strategy　Target site
收稿日期 : 2009202226
基金项目 :国家“863”计划项目 (2006AA10Z198, 2007AA10Z170) ,国家自然科学基金 (30671539)
作者简介 :朱超 (19822) ,男 ,硕士 ,主要从事分子生物学研究 ; E2mail: dfgdfh2000@1261com
通讯作者 :关伟军 (19662) ,男 ,教授 ,博士生导师 ,主要从事动物细胞分子生物学方面研究
马月辉 (19642) ,男 ,研究员 ,博士生导师 ,主要从事动物遗传资源保护方面研究 ; Tel: 010262813463, E2mail: yuehui2ma@2631net　　动物乳腺生物反应器是利用动物乳腺特异性启动子调空元件指导外源基因在乳腺中特异性表达 ,并从转基因动物乳汁中获取重组蛋白。基因打靶技术作为一种转基因技术 ,它是 20世纪 80年代后半期兴起的、按预期方式精细改造生物遗传信息的研究技术手段 [ 1 ] ,是建立在基因同源重组技术和胚胎干细胞技术基础上的分子生物学技术。1　基因打靶技术发展历史20世纪初 ,Morgan等 [ 2 ]通过果蝇眼色遗传分析揭示了同源染色体之间的 DNA重组是产生交换的基础。在真核生物中 ,外源 DNA与内源性染色体上的同源序列通过同源重组而进行的基因打靶首先在 酵母中得到研究 ,外源 DNA序列的特定排列决定了基因打靶的结果。1978年 H innen等 [ 3 ]首先描述了酵母中的 O型一步插入型基因打靶。自从 1981年美国的 Martin[ 4 ]和英国的 Evans等 [ 5 ]分别成功地分离培养小鼠的胚胎干细胞之后 , ES细胞基因打靶技术已被广泛地应用于建立转基因动物中。20世纪90年代后 ,这项技术得到了普遍应用和长足发展 ,不同的打靶载体策略相继出现与应用 ,确立了基因打靶技术在生命科学研究中的地位 ,成为确定新基因功能的主要手段之一。2　基因打靶技术的优势基因打靶是通过同源重组将外源基因定点整合
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2009年第 7期 朱超等 :基因打靶技术在乳腺生物反应器中的应用
入靶细胞基因组上某一确定的位点 ,以达到定点修
饰改造染色体上某一基因为目的的一项技术。这项
技术是分子生物学技术上继转基因技术后的又一革
命 ,它的发展将为发育生物学、分子遗传学、免疫学
及医学等学科提供一个全新的研究手段 ,其应用涉
及基因功能的研究、生产具有商业价值的转基因动
物和植物、异体动物器官移植和人类疾病的基因治
疗等多方面。基因打靶法制备乳腺生物反应器可以
克服传统的受精卵显微注射法的众多缺陷 ,并能对
动物内源基因进行修饰 ,这是原核显微注射法等所
无法实现的。
3　打靶细胞的选择
根据打靶细胞的不同 ,基因打靶技术分为胚胎
干细胞 ( ES)介导的基因打靶技术和体细胞介导的
基因打靶技术。利用 ES细胞的基因打靶技术 ,可
以尝试并验证基因打靶的策略 ,建立良好的乳腺生
物反应器模型 ,探讨乳蛋白基因功能及表达调控 ,为
制备真正意义上的转基因家畜做准备。体细胞核移
植克隆动物技术的发展与成功 ,促进了体细胞打靶
制备乳腺生物反应器的发展。从普通的体细胞到随
机整合有人凝血因子 Ⅸ的羊原代成纤维细胞 ,一直
到定点整合抗胰蛋白酶的打靶的羊胎儿成纤维细
胞 [ 6 ]。目前已经建立了基于体细胞基因打靶制备
乳腺生物反应器的技术平台。
4　基因打靶策略
411　完全的基因剔除策略
当研究某一非持家基因的功能时 ,通常采用完
全的基因剔除策略。即利用同源重组的原理设计置
换型载体 ,将靶基因关键的外显子破坏或将靶基因
完全缺失。采用此种策略时要考虑到基因间的代偿
效应和可能的渗漏突变对表型产生的影响。
412　大规模随机基因捕获策略
当研究许多基因的功能时可采用大规模随机基
因捕获种策略。设计启动子缺失的插入型载体 ,可
随机插入到基因组中 ,当插入到表达基因的外显子
中时 ,利用筛选标记基因即可得到众多的突变体细
胞 ,进而获得突变动物。其缺点是只能获得表达基
因的突变体 ,而且不能实现对基因的精细修饰。
413　精细突变打靶策略
在基因组中引入精细的突变可以避免在重组位
点留下外源的选择性标记 ,从而使人们可以对基因
的功能进行更为精确的研究。另外 ,基因打靶的目
的之一是要建立疾病的动物模型 ,有些疾病的发生
是由于基因的点突变引起的 ,因此就需要建立精细
点突变的动物模型。
5　乳腺生物反应器的打靶位点
为制备乳腺生物反应器 ,通常利用乳蛋白基因
调控序列与外源基因相融合从而达到调控外源基因
乳腺特异表达的目的。乳蛋白基因座自然成为基因
打靶方法制备乳腺生物反应器的候选基因座。
511　乳蛋白基因座
51111　乳清蛋白 (WAP)基因位点 　Ruker等 [ 7 ]通
过第一步打靶 ,在 ES细胞的内源乳清酸基因中引
入 LoxP位点 ,在第二步打靶中利用 Cre酶介导的
LoxP位点重组将带有 IRES新霉素抗性基因敲入内
源乳清酸基因 ORF之后 ,实现了利用内源乳蛋白启
动子指导外源基因表达的构想。该研究开创了“第
二代动物生物反应器模型 ”研究的先河。Ballester
等 [ 8 ]在小鼠的乳腺上皮细胞中研究 WAP的分布 ,
认为 WAP受激素的影响以及核基因的调节作用。
51112　β2酪蛋白基因位点 　β2酪蛋白是一种高效
表达的乳蛋白 ,其含量在牛乳中是 913 g/L,占牛乳
蛋白总量的 2812%以上 ,仅次于αs2酪蛋白 ,且其启
动子的组织特异性较好 ,表达稳定 ,不会造成异位表
达。研究表明 ,靶向失活的β2酪蛋白基因的小鼠本
身没有任何负面影响 ,也不影响它们的泌乳和哺乳
后代的能力。此外 ,β2酪蛋白在酪蛋白家族分子量
最小 ,结构相对简单 ,也是研究较多的蛋白之一。
Shen等 [ 9 ]在羊的乳腺上皮组织细胞中的β2酪蛋白
基因位点打靶成功的制作出转基因的核供体 ,因此 ,
β2酪蛋白基因位点是一个比较理想的后选靶基因。
51113　αs12酪蛋白基因位点 　αs12酪蛋白基因调
控序列已经成功地指导外源基因在动物的乳腺中高
表达。αs12酪蛋白与其他酪蛋白在粗面型内质网中
相互作用 ,形成复合物有利于它们转送到高尔基体 ,
缺少αs12酪蛋白的乳汁不能高效分泌。αs12酪蛋白
基因位点作为基因打靶位点时 ,必须保证打靶敲入
序列不影响αs12酪蛋白基因的表达。 Shen[ 10 ]在体
细胞的αs12酪蛋白位点打靶获得转基因羊。
51114　β2乳球蛋白 (BLG)基因位点 　BLG占乳清
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 7期
蛋白的 50% ,因其能与κ2酪蛋白形成分子间二硫键
而抑制 renin活性 ,从而使奶酪制作过程效率大大降
低。包括人在内的大多数哺乳动物乳汁中不含这种
蛋白 ,推断它可能与一些过敏反应有关。至今 , BLG
在乳汁合成及分泌过程中的关键作用尚未阐明。
L in[ 11 ]在胎儿细胞的 BLG位点定向打靶 ,通过细胞
DNA水平甲基化的变化来研究基因的表达。
51115　α2乳清白蛋白基因位点　剔除小鼠α2乳白蛋
白基因后 ,小鼠的泌乳能力及其乳汁成分受到影响 ,
乳汁黏稠 ,乳糖含量降低 ,使之不能哺育后代 [ 12, 13 ]。
利用基因打靶方法把小鼠α2乳白蛋白基因置换为人
的α2乳白蛋白基因后 ,人的α2乳白蛋白得以表达 ,小
鼠的泌乳恢复正常。α2乳白蛋白在乳房上皮细胞中
也有表达 , Sakamoto[ 14 ]通过对α2乳白蛋白分泌来研
究生长激素对乳房上皮机能的影响。
512　非乳蛋白基因座
动物基因组中存在一些许可位点 ,由于缺乏一
些基因表达阻遏序列 ,而包含一些非特异的增强子 /
活化子序列 ,或者染色体区域是一种允许基因表达
的构象 ,从而允许基因表达 ,这就为基因打靶位点提
供了更多选择。
51211　候选基因座 　 (1) HPRT位点 :最早应用的
基因打靶位点是 HPRT位点 ,这个位点是一个看家
基因 ,能对打靶进行直接筛选 ,无组织特异性和发育
阶段特异性。Cvetkovic等 [ 15 ]通过同源重组将人的
血管紧张素原基因定位敲入 HPRT位点上游 ,在打
靶小鼠中以生理水平表达并呈现正常的组织和细胞
特异性。Palais等 [ 16 ]在小鼠胚胎干细胞 HPRT位点
定向插入一个单拷贝的四环素 ,可诱导糖皮质激素
受体 ( GR )和β2半乳糖表达 ,结果显示在 HPRT位
点有 GR的表达 ,在干细胞中刚没有。这些实验结
果显示出定位敲入方法的优势 ,为受到位点效应困
扰的动物乳腺生物反应器的制备提供了宝贵的指导
作用。 (2) Ⅰ型原胶原基因位点 : Ⅰ型原胶原蛋白
在成纤维细胞中高效表达 ,可以采用启动子捕获富
集基因打靶的中靶细胞克隆。McCreath等 [ 6 ]成功
在此位点敲入 BLG2AAT表达框架 , AAT获得了 650
mg/L的表达量 ,远远高于显微注射 BLG2AAT转基
因羊的最高表达水平 (18 mg/L)。同时 ,证明了 I型
原胶原基因尽管在乳腺上皮中不活跃表达 ,但仍能
保证转基因在乳腺的表达 ,为其他非乳蛋白基因位
点打靶制备乳腺生物反应器提供了实验依据。 ( 3)
成纤维细胞生长因子受体 Ⅳ基因 ( fgfr4 )位点 : fgfr4
位于小鼠的第 13号染色体上 ,是一个看家基因 ,在
肺、骨骼肌、乳腺、肾、肝、胰、脑等各种组织中都有表
达 ,它能确保外源基因插入后处于一个开放和活跃
转录的状态。北京生物科技研究院对在小鼠的乳腺
中进行 t2PA的定向打靶 ,在打靶的乳腺的细胞中均
有 t2PA的表达 [ 17 ]。因此 ,可以应用此基因位点进
行基因打靶。
51212　中性基因座 　中性基因座是可用于多种转
基因广泛表达的基因座 ,能为不同启动子调控下的
各转基因非依赖性高表达提供一个良好的染色体环
境。W allace等 [ 18 ]构建了 Oct4启动子指导 L acZ基
因表达框架 ,将该表达框架随机插入 ES细胞染色
体组中 ,在 ES细胞水平上筛选 L acZ染色深的克隆。
这些位点经过有利于外源基因表达的改造 ,可以用
于打靶制备乳腺生物反应器。基因诱捕研究是一种
高通量的筛选基因位点的方法。在体细胞基因打靶
中 ,常采用无启动子诱捕打靶载体。当选择标记基
因整合到一个活跃转录的基因下游并符合其阅读框
架 ,选择标记基因才能表达 ,由此可以获得大量的允
许基因表达位点。因此 ,为制备乳腺生物反应器 ,需
要在乳腺上皮细胞中进行这种启动子诱捕。
51213　随机高表达基因座 　研究表明 ,一些基因座
能保证转基因的高效表达。寻找并克隆这些基因位
点的基因座 ,然后应用这些基因座进行基因打靶 ,可
以预见外源基因能获得良好的表达水平。Schubeler
等 [ 19 ]首先应用逆转录病毒载体随机整合 ,比较报告
基因的表达水平和稳定性 ,筛选出高表达位点。
W allace等 [ 18 ]证明 815 kb Oct4启动子调控 L acZ基
因表达比 119 kb Oct4启动子更为有效。B ronson
等 [ 20 ]证明同一位点打靶的小鼠 ,人肌动蛋白启动子
调控 bcl22基因表达比鸡肌动蛋白启动子调控 bcl22
基因表达量高 ,说明启动子序列与打靶基因位点之
间存在相互作用 ,并影响外源基因的表达。在某一
位点基因打靶时 ,应考虑基因座与乳蛋白基因启动
子之间的相互作用。目前 ,这种基因打靶敲入策略
技术尚未成熟 ,还不能完全摆脱困扰乳腺生物反应
器表达载体制备的一些难题 [ 21 ]。
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2009年第 7期 朱超等 :基因打靶技术在乳腺生物反应器中的应用
6　展望
胚胎干细胞途径的基因打靶技术给现代生物学
和医学研究带来了革命性的变化 ,成为后期基因组
研究基因功能最直接和最有效的方法。利用 ES细
胞的基因打靶技术 ,可以尝试并验证基因打靶的策
略 ,建立良好的乳腺生物反应器模型 ,探讨乳蛋白基
因功能及表达调控 ,为制备真正意义上的转基因家
畜做准备。“体细胞打靶 2克隆技术体系 ”的建立为
制备乳腺生物反应器的应用增添了新的活力 ,体细
胞打靶技术绕过了需要 ES细胞打靶的障碍 ,直接
在体细胞中进行基因同源重组 ,体外筛选中靶细胞。
目前成功的实例说明体细胞打靶和核移植相结合制
备乳腺生物反应器是发展的重要趋势。
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2003, 23 (2) : 2～5
中国粮食与农业综合生产能力科技支撑研究
翟虎渠 　刘 　旭主编
97827203202365826　　  129. 00　　　　　2009年 6月出版
本书是科技部科研院所社会公益研究专项 "粮食与农业综合生产能
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果的系统概括和总结。第 2章是对本研究使用的主要计量方法———科
技进步贡献率测定方法的理论探讨。第 3章到第 5章 , 分别从全国、区
域和重点农产品三个层次 , 主要从科技进步贡献率计量的角度 , 对各自
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主要从生产技术、生产区域和未来技术需求三大内容 , 做了定性的研究
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本书可供从事农业科研、教学、推广、管理人员 , 以及大专院校相
关专业的师生阅读参考。
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