全 文 ：南京农业大学学报 9 9 3 1, 一6 (增刊 ) : 一9一 2刁
·触口恤越 of 肠执夕卿 月尹妇边功侧 l俪钾目勿
芒柄花素的促乳腺发育作用及其机理探讨
王伟群 ’ 韩 正康 陈伟华 陈 杰
(动物医学系 , 2 10 0 t 4 )
摘要 小白鼠双侧卵巢切除后皮 卜注射芒柄花素 ,每口 0 . 刁 m g / gk , 连续 s d ,观察测定其乳腺发育情况 。结果表
明 ,试验组乳腺相对重星和 R N A 含星均较对照组显著增加 ,乳腺导管发育明显 。经放射受休竞争分析 ,发现芒
柄花素可竞争结合乳腺胞浆雌二醇受休 ( E R C ) , I C 5。二 ! . 7 ! 士 0 . 3 3 义 1 0 了 m ol L/ , 幻 = 1 . 6 1义 1 0 了 m ol / L 。 试验组
乳腺胞浆 E R c 结合容星和血浆催乳素 (P RL )浓度也极显著高于对照组 。
关链词 芒柄花素 ;异黄酮植物雌激素 ;乳腺发育 ;乳腺胞浆雌二醇受休 ;小白鼠
中图分类号 5 8 5 9 · 7
T H E E N H A N C IN C E F F E C I , O F F O R M O N O N E T IN O N T H E D E V E L O P M E N T
O F M A M h I A R Y C L A N D IN M I C E A N D E X P L O R A T IO N O F IT S M E C H A N I S氏I
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H a n z [l e n s k a n s
,
e 卜i e n w e i rl u a a n d C h e n J i e
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e t e r i n a r y M de i e in e
,
N a n j in g A g r ie t j n i v
,
N a n j in g 2 10 0 14 )
A庄汀 R A C T 刀 I c d e v e l o P n祀 : I t o f m a n l n 砚 r y gl a 「、 d s w韶 d e l e r n l i r lde i n fo r m o r l o n e t i ,卜 tcar tde o v a r ie e t o m i刁川 n l i伪
.
OF
r n。 ,沁 rl e t i , 1 ( F O ) , i r l笋 e rcd s u 比 u t a ro o us l y ( S C ) a r d a i ly d o 、 o f 0 . 4 m g / kg fo r 5 d a y s , 5 19川 f i e a n r l y i n c r c a s司 rh e
cr 协 t i v e cw ig h t s a n d R N A e o n te n t o f m a m n l a r y s al rl ds
. 刀 l e m a m am r y d u e t s cw cr cw l d e v o lu 详川
.
B y m ca
n s o f
r a d i o r c C c p tor a`台a y , i t w as f o u n d th a t F O e ou ld e o n l pe t e w i t l l es t r a d i o l f or 留 t r a d i o l r民 c P t o r ( E R c ) o f m a m m a r y 以a 闻
以 t、 15 . I C。。二 1 . 7 1士 0 . 3 3 义 10 ? n 、 0 1/ L , jK = 1 . 6 4 又 10 ’ m o l / L . F u r th e r m o r e , obt t l r lcl ` n d i n g ca 即 e i ry o f E R e
a n d t lxe P r ol a e t in e o r祀 e n t r a t io r、 o f P las n l a w cr e n 、a r k cd l y e l e v a t司 a f r e r a d n l i r、 i s t r a t i o l一 o f F o i ,一 o v a r i理 t帕 112以」 m i邝 .
n 〕c s c csr
u i rs s u路 cs red t l z a t F O e r l h a , 1邝 t l l e d e v e l o P n 、 e : I t o f n l a m n l a r y gl a r记 5 b y tw o 冈 th w a y s . O r一e 15 d i r民 r ly b i n d i n g
才0 ER e o f n 、a n 、 n u r y ig a ,、 d e y t渭u ls , a ,记 t!犯 o th e r 15 P t o n l o t i r一9 r l l e 眠 r e t i o ;、 o f P r o la e t in f r o m P i ru i ra r y .
K即 w .万山 fo r mo , 10 n e t i l l ; i s o f la v o r , j e P tl yt 恻 t r o g e ,、 s ; n l a n l r l l a r y g la r记 d e v e lo P n l e , I t ; cs t r a d io l 佗 e印 t o r of n l a m n 飞a r y
以a r记 e y t o , 0 1; n l i代
已f、尹
黄蔑 、 甘草 、 紫草 、 紫首楷 、 紫槐和红车轴草等植物中都含有异黄酮化合物— 芒柄花素
( f o r m o n o n
e t i n
,
F o )〔 ’ , 2二. 艺柄 花 素具 有雌 激 素 活性 〔3二, 属 于 异黄 酮植 物 雌 激 素 ( i s o f la v o n ie
ltP yt oe str go en
s )4[ 二。 近年国外报道 ,异黄酮植物雌激素具有抗癌活性匡 ,并发现膳食中所含的异
黄酮植物雌激素是预防乳腺癌 、 冠心病等疾病的保护因素 :6[ 。 作 者研究芒柄花素对小白鼠乳腺
发育的影响 , 并对其机理进行初探 , 旨在为研究 芒柄花素与乳腺癌的关系 , 及其在医疗实践中
的应用前景提供参考 。
, 巧cs e n 亡 a d d r姗 : 12 3 6 x1[ 万飞! 一a al S T . H o r 10 l u lu , 川 9 6 8 13 . U S A
收稿口期 19 , 3一 0 4一 18
南 京 农 业 大 学 学 报 1 6卷
材料与方法
1
.
1 药物
F o 由本教研室从红三 叶草 (外承汀乞脚 n 芦。如 , L . )中制备纯 品 , 并经光谱 鉴定川 。 雌二醇
( E
Z ) 系德 国 M er ck 产品 ,使用前以适量橄榄油 (北京化工 J ’ 产品 , 化学纯 )溶解 ,再配成所需浓
度 。橄榄油作为对照 。
1
.
2 试验动物
昆明种处女小白鼠 ,体重 15 一 20 8 , 分别在乙醚麻醉下背部切开 ,摘除双侧卵巢及输卵管 。
手术后逐只作阴道涂 片检查 ,一周 内未出现动情期反应者随机分组 。
1
.
3 试验设计
去卵巢小 白鼠分为 3组 , F o 组 12只 , E : 及对照组各 10只 。 每 日分别皮下注射 F o ( 0 . 刁 m g /
k8 )
、
F Z (0
.
0 } 。 g / k g) 和对照液 ,连续 s d 。 第 d6 各组小 白鼠分别断头采血 ,制成血浆 , 并分别切
卜腹部第一对乳腺 。
1
.
4 乳腺切片
乳腺组织用均 % 中性福尔马林液固定 ,常规石蜡切片 (厚度 5 o m ) , H E 染色匡 。
1
.
5 测定项 目及方法 乳腺 D N A 和 R N A 的含量测定参见文献 :.[ 。乳腺胞浆蛋白质浓度测定
按 Br ad fo dr 法 l0[ 弓。 血浆 P R L 浓度应用 w H O 提供的 ,、 P R L放免药盒 , 按说明书操作程序测定 。
1
.
6 乳腺胞浆液制备
每 对乳腺分别称重后 , 剪碎并 加入 3倍 p }J ,j . 魂 1毛 M 缓 冲液 ( O· 0 1 n l o l / L T r i s一 H C I , 1 . 5
n 、 m o 一/ L E n T A 一 ZN a , I n m o l / L 琉 基 乙 醇 , 0 . 5 n 、 m o l / L M s e x: , 0 . 2 5 m d / L 蔗 糖 和 2 0 m m o 一/ L
N a ZM o o
4
)
, 置于四氟乙烯玻璃匀浆器 (西德 B r a u n M e ls u n s e n A . G . ) 匀浆 2 0 m sn ,再 用超声波细
胞 破碎仪 (美 国 M cxj e l 1 6 一 8 5 0 , G a r d in e r ) 破碎细胞 3 o m sn ( 相对输 出功率 0 . 5 ) , 所得 匀浆经
20 0 0 沐 8 离心 30 m in , 用注射器针头通过离心液表面脂肪层吸取中问清液 , 即为乳腺胞浆液 。
卜述操作都在 刁 C 卜进行 。
1
.
7 乳腺胞浆 E R c 的放射受体分析
纯化的 “ H 一 E Z ( 比放射性 7 8 e i / m n 飞。 一, 进 n 分装 , 卜海内分泌研究所提供 )按表 一加样 , 刁℃孵
育 j s , , ,加 5 0 0 ; , 1 D C C 液 ( 0 . 0 5% 葡聚糖 包膜 0 . 5环活性碳液 ) , 振荡 1 0 , , , in , 4 0 O r /。 l in 离心 1 0
n l i n
, 卜清液加入含 一o n日 二 甲苯闪烁液 ( 0 . 5% P P o 和 0 . 0 2 % P o P o P )的计数杯 中 ,避光 一Z h
后用 eB ck m an 15 9 8 0 0型液闪计数器测定 d pm 。 根据饱和曲线和 cS at cl ar d 曲线 ,计算饱和浓度和
K d 值 。
增刊 王伟群等 ; 芒柄花素的促乳腺发育作用及其机理探讨
表 1 放射受体测定步骤
T ab cl 1 M ae , u er sc l健 d 川 e for r a d k甘州笼 p tor as , y
项 目 总特异结合管匀耽 jif e ib n d i n g
( A
,
A
`
)
3 5~ 1 8 00 f m
o l
0
5 0 0 闪
0
非特异性结合管
N o l l
~ s详。 fj e ib n d i n g
( B
,甘 )
3 5~ 1 80 0 企n均 1
2 00 ( 35~ 1 8 0 0 ) f IT旧 l
5 0 0 卜l
0
总放射性
T以 al r a d 10 . c it 讨汀
(C
,
C )
H ,
一几
E之
乳腺胞浆心 tOS o l
T E M 缓冲液 T E M bu f fc r
35~ 1 8 00 f m ol
0
0
5 0你二 l
单点法测定乳腺胞浆 ER c 的结合容量时 ,在 3H 一 E Z中加入 ER 。 (饱和浓度 1 60 o f mo l ) , N S B
管加入 20 0倍 E Z , 其它步骤同 1 . 7 。
1
.
8 F o 的放射受体竞争分析
不 同浓度的 F o ( 0 . 0峨~ 刁0 o m o l / L )分别与 8 0 fm o 一的 ’ H 一 E Z和乳腺胞浆液 5 0 0 p一, J ℃孵育」8
h
,其余步骤同 1 . 7 。 用回归方程计算 IC 50和抑制常数 iK 。
数据处理以 云 士 s D 表示 , 统计用 艺检验 。
2 结果与分析
么 1 F O 对小白鼠乳腺发育的影响
如表 2所示 ,皮下注射 F o 的小鼠乳腺相对重量和乳腺 R N A 含量均较对照组显著增加 ,乳
腺 D N A 含里和胞浆蛋 白质浓度亦有所升高 ,但统计不显著 。 皮下注射 E Z亦有类似结果 。
表 2 皮下注射芒柄花素后去卵巢小白鼠乳腺盆. 、 胞浆蛋白和核酸含t 的变化
aT b l
e 2 E f fce 拐 of cs F O 阴d cs E : 洲 陀 l a 柱v e 俄 igh t , yC 句. 0 1 p r o往加
a n d n u e le ie a e ids of ma m m
a r y g la n ds i n o v r a ir eC 嘴。m i z已 m ice
项 日 对 照 阳 E Z
1t e m 臼 n r r o l (。 = 1 0 ) ( : = 1 2 ) ( : = 1 0 )
腹部第一对乳腺相对重
cR 恤 t i v o wc ihg t (m g八 0鲍 BW )
10 2
.
9士 13 . 6刁 1 19 . 2士 1 6 . 9 1 . 1 2 1. 3士 2 0 3 6 .
乳腺胞浆蛋白质含址
C yt 璐0 1 p r ot ic n e o n t e n r (m g /m l )
.
5 4士 0 . 5 0 6 1 . 8 2士 0 . 4 9 5
湿乳腺 ,卜D N A 含量
D N A e o n t e n t i n f r cs h
n l a m m a r y 以a n d ( m g / g ) 2
.
9士 1. 0 8 3 . 0士 1. 1 4 3 . 2士 0 . 6 1
湿乳腺 ,卜NR A 含量
R N A 伪 n re n t j n fr cs h m a m nr a r y gl a n d ( n 、g / g ) 5
.
3士 0 . 9 6 6 . 7士 1 . 07二 6 . 4士 0 . 8 6 .
· 尸 < 0 . 05 ;二 尸< 0 . 0 1 (与对照组比较 i n com 皿
r询 n iw th e o n t r ol )
图 1为皮 卜注射 F o 、 E Z和对照液的去卵巢小白鼠乳腺石蜡切片光镜照片 。 山图可见 ,皮下
注射 F o 和 E Z组乳腺导管 明显发育 ,并在导管中出现较多染成红色的蛋白分泌颗粒 。
南 京 农 业 大 学 学 报 一6卷
山此可知 , F o 类似于 E Z ,对乳腺发育具 有促进作用 ,它促进导管发育 , 并使乳腺相对重量
显著增加 。这种增加似乎与乳腺细胞 D N A 的转录增加相关 。
2
.
Z
oF 对乳腺胞浆 E R 。 的竞争结合
由图 2可见 ,游离 几浓度为 8 0 0 f m o 一时 , s B 曲线已趋平缓 ; 1 5 0 0 fm o l 时 , 已经饱和 ,此时相
当于 E Z总浓度 1 6 0 0 f m o l 。
由图 2各点经 sc a 比ha dr 作图 ,可算出 E Z与乳腺胞浆 E R c 结合的解离常数 , K d 二 2 . 0士 0 . 78
户刀 。 l / L 。
F O 竞争结合乳腺胞浆 E cR 的竞争抑制曲线如图 3所示 。 F o 的竞争抑制曲线直线化方程为 Y -
2一 7 4义一 9 7一 s ( : = 0 . , 7 5 4 , 尸< 0 . 0 1 , r : B /氏 , x : 一 0 8 ( n飞。 一/ L ) ,半抑制浓度 IC S。一 1 . 7 一士
0
.
3 3 沐 一。一 7 n 、 0 1 / L ,抑制常数 K i - 一 6 j 火 r o一 7: 、、 0 1/ L 。 由此表明 , F o 对小 白鼠乳腺胞浆 E R e 有竞
争结合能力 。
2
.
3 FO 对乳腺胞浆 E R c 结合容量的影响
根据 E R c 的饱和点 , 用单点法测定了去卵巢小白鼠乳 腺胞浆 E R c 的结合容量 , 结果 皮 卜
注射 F o 组较对照组极显著地升高 (图 4 ) , 分别 为刁0 . 6 士 17 . 3 f m o l / n堪 p r o te in 和 17 · 5士 8 · 0 3
f m o l / m s P r o te in
。
增刊 王伟群等 : 芒柄花素的促乳腺发育作用及其机理探讨
:
ǎ欲à吕\山令撅冲巾织
.
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600 4加81山e sJ .且, .主
ǎ10尸LweJà刹囚Pun召
nCU户O月q目如织
r 一 0 . 99 8 9
尸< 0
.
0 0 1
。 l牛费石~ 二渝坛瑞一百甜一专漏 ~游离 E : F r o e E ( f n 、 0 1)
T
:总结合 oT r a l b i ,、d i rl g ; S B :总特异结合
s畔 ir ie bi n d i n g ;陇 B :非特异结合 N切 1一 s pe c , f ,、
b i dn i
n g
图 2 E Z与小白鼠乳腺胞浆 ER c 结合的饱
和曲线
F i g
.
2 aS t
u r a t io ll e u r v e o f E Z b i r l d i ll g t o E R e of
n u n l n l a r y 以a rl d cy t o so l s i r l o v a r ic t o n劝 z (刘 m j印
.2 4 F O 对血浆 P R L 浓度的影响
。甸寸气勺一吉
竞争物量 co m伴 t i to sr 一 ! 0 5 ( 。 、 u l / L )
!冬!3 芒柄花素与 3 H 一 E Z对小白鼠乳腺胞浆
E R c 的竞争抑制曲线
iF g
.
3 C o m ep t i rj
v e in h i ib t i on
e u r v e of FO a n d
E : b i n d in g t o E R e
利用 h P R L 放免药盒分别测定了去卵巢小白鼠血浆 P R L 浓度 ,结果皮 卜注射 F o 组较对照
组极显著地升高 (图 5 ) ,分别为 5 8 . 3士 15 . 3 2 n 、U / L 和 2 9 . 4士 5 · 2 3 n 、 t J / L 。
产,ù\r曰尸u门1勺。一ód
几U
秘一击洲ù
…{ 。: 甘
;碑 自 …
C o n t ro 】 F O
” 一一一蕊赢 ; 一 一而
图4 皮 卜注射芒柄花素对小白鼠乳腺胞浆 ER 。 结
合容星的影响
lF g
.
4 E f疙c e o f FO on ib n d i n g ca 伸e i ty o f E R e o f
ma
n l
ma
r y gl a n d e y t佣01 i n o v a r ic c t o n u z曰 m jc c (二 P <
0
.
0 1
,伪m因 r ed w j rh e on t r ol )
!划5 皮 卜注射芒柄花素对小白鼠血浆 P R L 含量的
影响
iF g
.
5 fE f oc t of F O
o n P r o场 e t in co 戊 e n t r a t ion of P功 sma
in o v a r i戊 t o m止 ed 而 ce ( 二 P ( 0 . 0 1 , co m伸 r团 w i th
co
n t r o l )
以 _匕结果提示 , F O 促进乳腺发育的机理可能有直接和间接两种方式 。 一方 面 F o 直接与
乳腺胞浆 E R c 竞争结合 ,且其结合容童极显著增加 , 从而提高乳腺细胞对 ER c 配基的敏感度 ;
另一方面 , F o 可引起血浆 P R L 浓度的极显著升高 , 问接促进乳腺的发育 。
南 京 农 业 大 学 学 报 1 6卷
3 讨 论
本试验所用皮 卜注射 F o 剂量 为引起去卵巢小 白鼠阴道涂 片出现动情期 反应的最低剂
量 ,该剂量的雌激素活性相当于 E 2 0 . 0 1 0 8 / k沙 ’口。
用 h P R L 放免盒与小白鼠 P R L 的交 叉反应 ,测定结果只能作为相对值提供参考 。 oJ dr an .v
c
. 等 l[ 2〕报道 , 一些异黄酮植物雌激素可以促进体外培养的大 鼠垂体细胞释放 p R L 。提示 : 本试
验皮下注射 F o 引起的血浆 P R L 浓度升高 ,可能是 F o 与垂体细胞 E R c 竞争结合的结果 。
此外 , P R L 可以促进小 白鼠乳腺胞浆 E R。 结合容量的增大 l[ ”二。 因此 ,皮下注射 F o 引起的
乳腺胞浆 E R c 结合容量增加 ,可能是升高的 P R L 所致 。
( 卜海第二军医大学药学院韩公羽教授给予指导 、 帮助 ,特此致谢 。 )
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C c t只 o f s y n t上l e r ie a n d 一, a t u r 3孟生) , 伏识 , , r i: 一g f场 、 o n o id s o n m 一t `哪 n 一 idn u 。汉」P r o il fc r a t io n o f h u m a n
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P r in e iP le of P r o re in
一
d y e ib n d in g
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