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生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 10期
基于氨单加氧酶基因的自养脱氮菌群结构分析
郑雪松 龚钢明
(上海应用技术学院 ,上海 200235)
　　摘 　要 : 　全程自养脱氮是一种在高氨氮低溶氧条件下完全由自养菌群作用脱除氮素的现象。以全程自养脱氮污泥为
研究对象 ,特异性扩增氨单加氧酶活性基因 am oA片段 ,建立克隆文库并对克隆序列进行系统发育学分析 ,考察全程自养脱氮
系统从建立到退化过程中氨氧化菌的结构变迁。结果表明 : N itrosom onas oligotropha和 N itrosom onas europaea细菌是系统中的
主要氨氧化菌 ,而随着系统的退化前者逐渐被后者完全取代 ,而氨氧化菌的种群变迁可能并不是全混流系统全程自养脱氮效
率下降的原因。
关键词 : 　氨氧化菌 氨单加氧酶基因 自养脱氮 克隆文库
Phylogenetic Analysis based on the am oA Gene of Ammon ia
Oxidizers in an Autotrophic Nitrogen2Removal Reactor
Zheng Xuesong Gong Gangm ing
( Shanghai Institu te of Technology, Shanghai 200235)
　　Abs trac t: 　 In order to analyze ammonia2oxidizing population in deammonification2sludge, a partial stretch of the gene encoding
the active2site polypep tide of ammonia monooxygenase ( am oA ) was amp lified and the gene libraries were constructed1 The result of
gene sequences and phylogenetic analysis showed that two species of ammonia2oxidizing bacteria, including N itrosom onas oligotropha
and N itrosom onas europaea are the dom inant species in the deammonification reactor. W ith the degeneration, N itrosom onas oligotropha
were taken p lace with N itrosom onas europaea, which also suggested that the changing of ammonia2oxidizing population may not cause the
degeneration of deammonification reactor1
Key wo rds: 　Ammonia2oxidizing bacteria Ammonia monooxygenase gene ( am oA) Autotrophic nitrogen2removal Clone library
收稿日期 : 2009207227
基金项目 :上海市教委高校优秀青年教师科研专项基金项目 ( yyy07022)
作者简介 :郑雪松 (19722) ,男 ,博士 ,讲师 ,研究方向 :环境生物技术和分子生态学 ; E2mail: sinson26@vip11631com　　全程自养脱氮 (Deammonification)是一种新型的污水脱氮工艺 ,它是指在同一反应器中 ,在限氧和较高 pH值条件下 ,完全由自养菌群作用将氨氮转化为氮气而除去的现象。近 10年来 ,国内外学者对全程自养脱氮系统中的微生物群落组成和结构进行了初步研究 ,取得了一些重要的成果 [ 1～8 ]。本试验中市政污水处理厂活性污泥经接种 ,驯化 ,在实验室建立了全混流全程自养脱氮反应器 ,从驯化开始大约 80 d后 ,总氮去除率可达 62% ,系统的容积去除率达到 85 mg N / (L d)。批式试验证明 , 80 d时的污泥生物相可以在限制溶氧条件下 ,将NH4 + 2N氧化成 NO2 - 2N,同时又可催化 NH4 + 2N和NO2 - 2N反应生成 N2 ,整个脱氮过程不需外加有机 碳源 ,符合全程自养脱氮的条件 [ 9 ]。作者前期的研究还表明 :在全程自养脱氮系统中 ,起关键作用的种群是氨氧化菌 ( ammonia oxidizing bacteria, AOB )和浮霉状菌属细菌 P lanctom ycetes[ 10 ]。然而 ,试验也发现 ,全混流反应器具有明显的不可持续性 ,在稳定运行一段时间后 ,系统即迅速退化 ,直至最后脱氮作用丧失。针对全程自养脱氮全混流反应器菌群从驯化成功到迅速退化这一现象 ,研究该过程中氨氧化细菌的种群演变 ,分析这种演变对反应器退化可能造成的影响。主要针对氨氧化菌独有的氨氮加氧酶活性基因片段 ———am oA基因片段组建克隆文库 ,通过序列比对和系统发育分析 ,探寻关键种群的
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 10期
变迁规律。
1　材料和方法
1. 1　材料
所用污泥共 3种 : (1)污泥样品 samp le C:取自
上海闵行污水处理厂二沉池 ,代表普通的市政污水
处理厂污水处理系统生物相。 (2) Samp le S90:取自
本实验室的全程自养脱氮全混流反应器 ,此时系统
脱氮效果最佳。 ( 3) Samp le S240:取自本实验室的
全程自养脱氮全混流反应器 ,此时系统退化 ,污泥几
乎没有脱氮效果。
1. 2　方法
1. 2. 1　总 DNA的提取和纯化 　按照文献 [ 11 ]中
的化学法 ,以溶菌酶、蛋白酶 K和 SDS处理菌体、
酚 2氯仿抽提、乙醇沉淀获得污泥样品的总 DNA。
1. 2. 2 　PCR反应的引物和扩增条件 提高扩增的
专一性 ,采用套式扩增。
第一轮引物 amo F1 /amo R1用于扩增氨氧化菌
am oA基因上长为 625 bp的片段 [ 12 ]。
amo F1: 5′2AAG ATG CCG CCG GAA GC23′
amo R1: 5′2GCT GCA ATA ACT GTG GTA23′
第二轮引物 amo F2 /amo R2嵌套于上述外围引
物的内部 ,可扩增氨氧化菌 am oA基因上 490 bp的
片段 [ 13 ]。
amo F2: 5′2GGG GTT TCT ACT GGT GGT23′
amo R2: 5′2CCC CTC KGS AAA GCC TTC TTC2
3′, S = G or C
PCR的反应体系组成 : 50μl体系。两种引物各
1μl, dNTPs(10 mM ) 1μl, 10 ×buffer (20 mM Mg2 + )
5μl,模板 DNA为 1μl, TaqDNA聚合酶 215 U,其余
体积以无菌超纯水补足。上述试剂均购自上海博彩
公司。两轮扩增条件 94℃热启动 3 m in, 80℃加酶。
30个循环为 94℃变性 30 s, 56℃退火 40 s, 72℃延
伸 50 s,最后一个循环结束后 72℃延伸 5 m in。2轮
PCR反应的产物通过 1%琼脂糖 (Agarose)凝胶电
泳分离。
1. 2. 3　PCR产物的克隆和克隆子的筛选 3个污
泥样品分别构建克隆文库 ,方法如下 : PCR产物经
电泳分离割胶回收后 ,使用 3S Agarose胶回收试剂
盒 (上海博彩 )回收纯化。使用 T2Vector PCR产物克
隆试剂盒 (上海生工 )完成连接转化 ,随后进行蓝白
斑筛选。每个文库随机挑选 15个的克隆子 ,经扩大
培养后提取质粒送测序。
1. 2. 4 克隆子序列的测定、处理和系统发育分析
测序工作交由上海博彩公司完成 ,测得序列通过
BLAST程序在 GeneBank数据库中搜索 ,运用DNAman
v1410, ClustalX v11181,和 TreeV iew软件进行序列
相似性比对并绘制系统发育树。
2 结果
2. 1　am oA基因片段的套式扩增
3个污泥样品总 DNA的套式扩增结果见图 1。
这一结果表明 :套式扩增的特异性很好 , 490 bp的
目标条带清晰明亮。同时也说明 3种污泥样品中都
有氨氧化菌存在。
图 1　3种污泥样品 am oA基因套式扩增的结果
2. 2　am oA基因克隆文库的筛选和序列分析
3个泥样的 am oA文库各包含 15个克隆子 ,经
测序并对序列进行分析比对 ,归并完全相同的序列。
最终结果 : samp le C文库包含 4种不同的克隆子 ,分
别是 C2amo2、C2amo5、C2amo10、C2amo14; samp le S90
文库包含 4种克隆子 ,分别是 S902amo3、S902amo10、
S902amo11、S902amo12; samp le S240文库包含 2种
克隆子 ,分别是 S2402amo4和 S2402amo11。
参与比对和后续系统发育树绘制的克隆子序列
被统一整理为 453个核苷酸。表 1和表 2分别是活
性污泥样品 Samp le C文库和全程自养脱氮反应器
样品 Samp le S90、Samp le S240文库中的克隆子与常
见氨氧化菌 am oA序列的相似性矩阵。图 2表明了
克隆子的系统发育地位。
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2009年第 10期 郑雪松等 :基于氨单加氧酶基因的自养脱氮菌群结构分析
表 1 市政污水处理厂污泥 C的 am oA基因文库中的克隆子与常见 AO B相应序列的相似性
菌株 菌株 /克隆子
序列相似性 ( % )
1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 C2amo2
2 C2amo5 8418
3 C2amo10 8616 8113
4 C2amo14 8411 9516 8415
5 N sm 186 8611 9114 8213 9011
6 N sp140 7715 7618 6417 7511 7616
7 N 1 europaea 7115 7513 6813 7610 7416 6918
8 N 1 eutropha 7212 7515 6815 7515 7317 6911 8712
9 N 1 m arina 8216 8319 7911 8411 8416 7315 7315 7412
10 N 1 oligotropha 8411 9514 8018 9217 9110 7616 7412 7412 8312
表中菌株 /克隆子基因序列号 : 1～4. FJ984594～FJ984597; 5. AY123819; 6, . AY123840; 7. AF058691; 8. U51630; 9. AF272405; 10. F272406
表 2　全程自养脱氮污泥 S90和 S240的 am oA基因文库中的克隆子与常见 AO B相应序列的相似性
菌株 菌株 /克隆子
序列相似性 ( % )
1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 S902amo3
2 S902amo10 6719
3 S902amo11 7315 8110
4 S902amo12 7311 8014 9817
5 S2402amo4 8714 6813 7519 7513
6 S2402amo11 9516 6616 7216 7216 8710
7 N 1 europaea 9419 6813 7414 7315 8719 9511
8 N 1 eutropha 8817 6815 7414 7317 8611 8618 8712
9 N 1 m arina 7219 7911 8314 8314 7416 7313 7315 7412
10 N 1 oligotropha 7315 8018 9819 9815 7517 7216 7412 7412 8312
表中菌株 /克隆的基因序列号 : 1～6. AY369166～AY369171; 7. AF058691; 8. U51630; 9. AF272405; 10. AF272406
图 2 市政污水厂污泥和全程自养脱氮反应器
污泥 am oA克隆文库中克隆子的系统发育关系
3 讨论
从以上试验结果可以看出 ,在市政污水处理厂
污泥的 am oA基因文库中的 4种克隆在系统发育学
上还可以归为 2种生物相中 ,一种与 N 1 oligotropha
关系密切 ,包含 12个克隆子 ,另一种与 N 1 m arina
亲缘关系较近 ,包含 3个克隆子 ,但没有克隆子显示
与 N itrosospira属细菌和 N itrosom onas eu ropaea种的
细菌有很高的同源性。而这 2种细菌则是许多水生
态系统中最常见的氨氧化菌类型。在 S90样品文库
中 , 15个克隆子中的 10个与 N 1 oligotropha同源 , 4
个克隆子在系统发育学上属于 N 1 europaea,余下的
1个克隆子难以确定其归属 ,数据库中的所有序列
与其相似度都低于 85%。S240的克隆文库中只发
现了 N 1 europaea的克隆子。结果说明 ,随着驯化的
进行 ,面对高浓度的氨氮 , N itrosospira属细菌和 N i2
trosom onas oligotropha细菌逐渐被淘汰 ,而能够耐受
高氨氮低溶氧的 N itrosom onas eu ropaea细菌成为反
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 10期
应器中的 AOB优势种。
此外 ,在反应器的脱氮效果由好变差的过程中 ,
氨氧化菌的种群结构变化并不是非常显著 ,其中个
别优势种的变迁并不能影响全程自养脱氮过程的本
质 ,因此 ,氨氧化菌的种群变迁可能并不是全混流系
统全程自养脱氮效率下降的原因。
参 考 文 献
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(上接第 184页 )
3　讨论
荧光实时定量 PCR是在 PCR指数扩增期间 ,
连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产
物的量 ,它以已知不同浓度的同种模板的系列稀释
品作为标准品 ,在相同条件下与待测模板一起进行
PCR扩增 ,通过比较待测样品与标准品的扩增结
果 ,推断出待测样品中目标模板的原始量 [ 5, 6 ]。准
确合理构建定量标准品是荧光实时定量 PCR检测
体系最为基础和重要的工作。标准品的构建可分为
3种方式 : (1)化学合成目的基因 ,其优点是纯度高、
定量准确 ,缺点是受化学合成工艺的限制 ,只能合成
120 bp以下的长度 ; (2)将 PCR扩增产物直接梯度
稀释 ,它的优点是方便、简单 ,缺点是不准确、不稳定、
容易造成污染 ; (3)将 PCR产物克隆到载体上 ,然后
抽提出质粒 ,经过测量浓度和拷贝数的换算 ,可准确
定量 ,其优点是稳定、准确 [ 5 ]。因而选用第 3种方式
构建标准品。
鉴于荧光实时定量 PCR技术的关键是定量 ,所
以标准品的构建成为实时定量 PCR检测研究中的关
键环节。通过建立与目的片段一样的标准品 ,可以保
证目的片段与标准品的扩增效率一致 ,减小试验误
差 ,使定量 PCR定量更加准确。本研究针对铜绿假
单胞菌的 gyrA基因构建了一种重组质粒的标准品 ,
能满足实际检测对标准品的需求 ,在试验中也取得较
好的效果 ,与常规的从生物公司购买标准品相比此方
案更可信 ,更能保证目的片段的扩增效率。
本研究所建立的铜绿假单胞菌 SYBR Green I
荧光实时定量 PCR检测技术保留了常规 PCR检测
的特异性和敏感性 ,省去了常规 PCR的电泳步骤 ,
整个过程由电脑控制 ,从加样到结果只需要 2 h左
右。可同步完成多达 96个样品的扩增及定量 ,适宜
于大批样品的检测处理 ,极大地提高了检测时限 ,为
水污染的监测和水中毒事件的快速反应提供了技术
支持。尽管实时定量 PCR检测相对比较昂贵 ,但由
于其能对样品中细菌污染进行定量 ,且灵敏度高于
传统 PCR,更易于自动化 ,必然会成为细菌检测的
常规手段 [ 7 ]。
参 考 文 献
1　 O smon S,W ard S, Fraser VJ, et al. Chest, 2004, 125 (2) : 607～616.
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