全 文 ：中国生态农业学报 2013年 4月 第 21卷 第 4期
Chinese Journal of Eco-Agriculture, Apr. 2013, 21(4): 409415


* 国家自然科学基金项目(40801097)和福建省自然科学基金项目(2012J01107)资助
宋亚娜(1973—), 女, 副研究员, 博士, 主要从事微生物分子生态学研究。E-mail: syana@sina.com
收稿日期: 20120903 接受日期: 20121122
DOI: 10.3724/SP.J.1011.2013.00409
稻田厌氧氨氧化菌群落结构对氮肥的响应*
宋亚娜 吴明基 林 艳
(福建省农业科学院生物技术研究所 福州 350003)
摘 要 为探明稻田厌氧氨氧化菌多样性及其对氮肥用量的响应状况, 利用厌氧氨氧化菌 16S rRNA 基因特
异引物对定位试验稻田土壤 DNA 进行 PCR-DGGE(聚合酶链反应变性梯度凝胶电泳)并结合 DNA 克隆测序,
研究了氮肥供应量对厌氧氨氧化菌群落结构的影响。DGGE 图谱及依据其条带位置和亮度数值计算的多样性
指数均显示 : 高氮处理 [N3: 225 kg(N)·hm2]的厌氧氨氧化菌群落结构多样性在表层或根层土壤中均显著
(P<0.05)高于中、低氮[N2: 150 kg(N)·hm2; N1: 75 kg(N)·hm2]处理和不施肥对照(CK); 同时, 高氮处理下表层
土壤厌氧氨氧化菌群落多样性指数显著高于根层土壤(P<0.05)。冗余分析(RDA)结果表明, 表层土壤中厌氧氨
氧化菌群落结构组成与不同氮肥水平处理存在显著相关性(P=0.006)。此外, 本试验获得厌氧氨氧化菌 DGGE
条带 DNA序列 18条, 登录 GenBank并获得登录号。研究表明稻田厌氧氨氧化菌群落结构对高氮水平具有较
强的响应, 尤其是在表层土壤中。
关键词 厌氧氨氧化菌 群落结构 氮肥 稻田 PCR-DGGE 冗余分析
中图分类号: S154.3 文献标识码: A 文章编号: 1671-3990(2013)04-0409-07
Response of anammox bacteria community structure
to nitrogen in paddy soils
SONG Ya-Na, WU Ming-Ji, LIN Yan
(Institute of Biological Technology, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003, China)
Abstract Anaerobic ammonium oxidizing (anammox) bacteria of phylum Planctomycetes origin have been identified to be
responsible for N removal in terrestrial and aquatic environments through combined NH4+ oxidation and NO2 reduction. Anaerobic
ammonium oxidation mediated by anammox bacteria has been noted to be a key process of biogeochemical N cycle in various
ecosystems. It was also possible to have anammox processes in flooded paddy fields because of the low oxygen habitat conditions.
To investigate the existence of anammox bacteria and the bacteria community diversity response to applied N fertilizer in paddy
fields, anammox bacteria community structures in paddy fields were investigated with the aid of denaturing gradient gel
electrophoresis and cloning sequencing by assay 16S rRNA gene in the third year of N fertilizer experiment in the field. DGGE
images of 16S rRNA gene in surface or root-zone soil showed rich anammox bacteria in paddy soils. The numbers of DGGE band in
the images of surface soil or root-zone soil under high N level treatment [N3: 225 kg(N)·hm2] were greater than those under other N
levels [N2: 150 kg(N)·hm2, N1: 75 kg(N)·hm2 and CK: without fertilizer]. The Shannon-Wiener index based on the number and
density of DGGE band showed significantly (P < 0.05) higher diversity of anammox bacteria in surface soil or root-zone soil under
N3 treatment than N2, N1 or CK treatments. At the same time, Shannon-Wiener index of anammox bacteria in surface soil was
markedly (P < 0.05) higher than in root-zone soil under N3 treatment. Redundancy discriminate analysis (RDA) based on 16S rRNA
gene DGGE profiles showed significant correlation (P = 0.006) of anammox bacteria community structure in surface soils of paddy
fields with different levels of N fertilizer application. RDA plot depicted that anammox bacteria community structure in surface soil
under N3 treatment obviously differed from that under N1 or CK treatment. Furthermore, 18 DNA sequences cloning from DGGE
band was obtained and logged in GenBank. The findings demonstrated that anammox bacteria community structure in paddy soils
strongly responded to intensive N fertilizer use especially in surface paddy soils. Anammox bacteria possibly played a critical role in
N cycle in paddy soil ecosystem.
410 中国生态农业学报 2013 第 21卷


Key words Anammox bacteria, Community structure, N fertilizer, Paddy soil, PCR-DGGE, Redundancy discriminate
analysis
(Received Sep. 3, 2012; accepted Nov. 22, 2012)
在氧供应不足或电子供体有限的自然生态系统
中 , 存在一种由浮霉状菌目(Planctomycetales)细菌
驱动的厌氧氨氧化过程, 即厌氧氨氧化菌(anammox)
以亚硝酸盐作为电子受体将氨氧化为 N2的过程[1]。
由于厌氧氨氧化菌对氧极度敏感、生长缓慢且在较
高细菌浓度条件下才表现出厌氧氨氧化活性, 因此
用传统的微生物分离、纯化培养方法来研究厌氧氨
氧化菌的群落组成十分困难。现代分子生物学技术
的迅速发展为厌氧氨氧化菌的研究提供了高效快捷
的手段。目前已经鉴定到 8 个厌氧氨氧化菌种, 分
别属于 5个属, 16S rRNA系统发育分析表明, 这些
厌氧氨氧化菌都归属于浮霉状菌门(Planctomycetales)
并构成了厌氧氨氧化菌科(Anammoxaceae)[2]。
厌氧氨氧化菌的生长要求环境中同时存在氨和
亚硝酸盐 , 通常在沉积物和水体的有氧无氧界面
能满足这样的条件, 在许多水生环境中均发现了厌
氧氨氧化作用 [3], 表明这一作用可能广泛存在于任
何含氮低氧的生态系统中[4]。同时, 结合 N15示踪技
术, 对生物标志物、FISH 分析和 16S rRNA 基因的
分析结果也均证实了厌氧氨氧化菌在自然界中广泛
分布, 且在氮素循环中起着重要的作用[5]。海洋和淡
水生态系统中的厌氧氨氧化菌的研究较早较多, 近
年来在不同陆地生态系统, 如沼泽、冻土和农田土
壤中也检测到了不同种群的厌氧氨氧化菌[6]。
水稻土及其稻田系统是环境友好、生态健康、
可持续利用的人工湿地生态系统[7]。稻田土壤氮素
的累积、迁移、流失等生物地球化学循环过程是稻
田生态系统可持续发展的重要保障之一。水稻生长
过程中稻田土壤长期处于淹水状态, 可为厌氧氨氧
化菌生长提供有利环境。因此, 稻田土壤中可能存
在厌氧氨氧化过程。笔者通过 16S rRNA基因分析,
发现在淹水红壤稻田土壤中存在较为丰富的厌氧氨
氧化菌[8]。但这些厌氧氨氧化菌的多样性、群落组
成对环境因素的响应及其在稻田土壤氮素循环中的
作用等问题都还不清楚。
本研究以田间定位试验为基础, 运用 PCR-DGGE
(聚合酶链反应变性梯度凝胶电泳)技术研究了稻田
土壤中厌氧氨氧化菌群落结构对氮肥水平的响应, 为
稻田厌氧氨氧化作用的深入研究提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 试验区概况
于 2009年起在位于福州市寿山乡前洋村(26o11′N,
119o16′E)的福建省农业科学院生物技术研究所试验
基地, 建立了水稻肥料定位试验。供试地点属暖湿
的亚热带季风气候, 无霜期长达 326 d, 年平均气温
19.6 ℃, 平均湿度 77%, 年均降水量 1 342.5 mm。供
试土壤基本理化性状为 : 有机质 16.87 g·kg1, pH
5.78, 全氮 1.29 g·kg1, 全磷 0.28 g·kg1, 全钾 19.39
g·kg1, 碱解氮 208.1 mg·kg1, 有效磷 15.97 mg·kg1,
速效钾 78.73 mg·kg1。
1.2 试验设计
试验设置低、中、高氮肥[N1: 75 kg(N)·hm2; N2:
150 kg(N)·hm2; N3: 225 kg(N)·hm2]及不施肥的对
照(CK)处理。氮肥种类为尿素, 磷肥和钾肥种类为
过磷酸钙和氯化钾, 全部磷钾肥和 2/3 氮肥用做基
肥, 1/3 氮肥在水稻分蘖后期追肥。3 个氮水平处理
中磷肥和钾肥均分别为 60 kg(P2O5)·hm2 和 150
kg(K2O)·hm2, 对照试验不施氮磷钾肥。每个处理重
复 3次, 共 12个田间小区随机排列, 小区面积 16 m2,
种植密度 300 株 ·小区 1。供试水稻品种为“天优
3301”(Oryza. sativa L. “Tianyou 3301”), 按当地常规
进行水稻栽培的田间管理。在 2009—2011年 3年定
位试验中水稻均做中稻栽培, 每年 5月播种, 6月移
栽, 10月收获。每年水稻收获后稻茬翻入土中, 下一
年按前一年小区排列进行种植。于田间定位试验第
3年的水稻抽穗期(2011年 8月)进行稻田土壤采集。
每次重复取 5 株水稻 , 整株挖起后取土层深度约
10~20 cm的根系周围土壤(根层土), 5株水稻根系取
得的土壤混合为 1 个样品; 每个小区随机选 5 个点
采集土层深度 0~5 cm的土壤(表层土), 将 5点采集
的土壤混合为 1个样品。田间采集的土样放入 4 ℃
冰盒中保存 , 于实验室内将混合后的土壤去除根
系、杂草、土壤动物和石块等杂质并混匀后分成 2
份。一份于20 ℃冷冻保存用于土壤微生物分析, 一
份风干后进行土壤养分分析。
1.3 分析方法
1.3.1 土壤微生物总 DNA提取
采用 FastDNA SPIN Kit For Soil (QBIOgene)
的试剂盒方法, 称取 0.5 g 于20 ℃保存的土壤样品,
按试剂盒的试验步骤进行土壤微生物总 DNA 的提
取, DNA样品20 ℃冰箱保存待用。
1.3.2 聚合酶链式反应(PCR)
采用嵌套式 PCR, 第 1步利用引物 pla46f/630r[9]
对浮霉菌属进行 PCR扩增, 第 2步以第 1步 PCR产
第 4期 宋亚娜等: 稻田厌氧氨氧化菌群落结构对氮肥的响应 411


物为模板 , 利用厌氧氨氧化菌特异引物 Amx368f-
GC/Amx820r[9]扩增厌氧氨氧化菌 16S rRNA基因。
在引物 Amx368f 前加 1 个 GC 夹用来防止 DNA 在
进行变性梯度凝胶电泳时过早解链。PCR 引物序列
及扩增反应条件见表 1。第 1套 PCR反应体系 25 L,
其中 2 L稀释 5倍的土壤总 DNA模板加反应液 23
L, 反应液包括 0.5 L Taq DNA聚合酶(2.5 U·L1,
天根生物公司, 北京), 2.0 L dNTPs(2.5 mmol·L1各
碱基 , 上海生物工程公司 , 上海), 2.5 L 10×PCR
buffer(10 倍的 PCR 缓冲液, 天根生物公司, 北京),
前、后引物各 2 L(5 pmol·L1, 上海英骏生物工程
公司, 上海)和 14 L超纯水。第 2套 PCR反应体系
50 L, 其中 2 L第 1套 PCR产物 DNA模板加反应
液 48 L, 反应液包括 1 L Taq DNA聚合酶(2.5 U
L1, 天根生物公司 , 北京 ), 4.0 L dNTPs(2.5
mmol·L1各碱基, 上海生物工程公司, 上海), 5.0 L
10×PCR-buffer(10倍的 PCR缓冲液, 天根生物公司,
北京), 前、后引物各 4 L(5 pmol·L1, 上海英骏生
物工程公司, 上海)和 30 L超纯水。对 PCR产物进
行琼脂糖电泳 EB(溴化乙腚)染色检查。

表 1 PCR扩增引物及反应条件
Table 1 Primers and PCR conditions used for the study
目标微生物
Target group
引物
Primer
序列
Sequence (5′-3′)
反应条件
Thermal profile
浮霉细菌
Planctomycetes
Pla46f
630r
GGATTAGGCATGCAAGTC
CAKAAAGGAGGTGATCC
95 ℃预变性 5 min, 94 ℃变性 30 s, 55 ℃退火 1 min, 72 ℃ 延伸 1 min, 35
个循环, 72 10 min℃
5 min at 95 , followed by 35 cycles ℃ of 30 s at 94 , 1 min at 55 , 1 min ℃ ℃
at 72 ℃, 10 min at 72 ℃
Amx368-GC

CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGG
GGCACGGGGGGTTCGCAATGCCCGAAAGG
95 ℃预变性 5 min, 94 ℃变性 30 s, 56 ℃退火 45 s, 72 ℃延伸 1 min, 35个
循环, 72 10 min℃
厌氧氨氧化菌
Anammox
Amx820r AAAACCCCTCTACTTAGTGCCC 5 min at 95 ℃, followed by 35 cycles of 30 s at 94 ℃, 45 s at 56 ℃, 1 min
at 72 ℃, 10 min at 72 ℃

1.3.3 变性梯度凝胶电泳(DGGE)
用 40 L 第 2 套 PCR 产物, 采用梯度为 30%~
55%的 8%的聚丙烯酰胺凝胶[化学变性剂为 100%尿
素 7 mol·L1和 40%(体积比)的去离子甲酰胺]在 1倍
TAE缓冲液中 150 V 60 ℃下电泳 5 h。电泳后用 10
mL SYBR green I(Sigma)(1倍TAE稀释 10 000倍)核酸
染料染色 45 min, 然后用 Bio-Rad成像系统拍照。
1.3.4 序列系统发育分析
对DGGE图谱中主要的DNA条带进行回收, 用
无 GC 夹的引物 Amx368f/Amx820r 扩增, 反应条件
如表 1所示。将 PCR扩增产物利用 PMD-18载体进
行克隆测序(上海英骏生物工程有限公司)。将测序结
果登陆 NCBI通过 Blast 2.0软件与 GenBank中的已
知序列比对来确定序列的微生物种类, 将序列递交
GenBank, 获得登录号(accession number): JX136678~
JX136695。利用 MEGA 4.0软件基于 DGGE条带序
列, 进行 Bootstrap 验证系统发育分析, 构建邻接法
(neighbor-joining, NJ)系统发育树。
1.3.5 土壤理化性状分析
分别用 0.01 mol·L1 CaCl2水土比 2.5∶1提取法
测定土壤 pH, 酚二磺酸比色法测定土壤硝态氮含量,
2 mol·L1 KCl 浸提靛酚蓝比色法测定土壤铵态氮
含量, 重铬酸钾容量法测定土壤有机质含量, 碱解
扩散法测定土壤碱解氮含量, 0.5 mol·L1 NaHCO3浸
提法测定土壤速效磷含量, NH4OAc 浸提火焰光度
法测定土壤速效钾含量[10]。
1.4 数据分析
用 Quantity One(Bio-Rad)软件对 DGGE图谱中
DNA 条带的位置和亮度进行数字化, 计算厌氧氨氧
化菌群落结构多样性指数 Shannon-Wiener index
(H′)=(n/N)×ln(n/N)(n为样品各个条带的亮度值,
N为样品所有条带亮度值的和)[1112]。采用 CANOCO
4.0(Microcomputer Power, Ithaca, USA)软件, 根据不
同处理 DGGE结果的条带亮度和位置的数字化数值
对微生物群落结构组成进行冗余分析 (redundancy
discriminate analysis, RDA), 分析微生物群落结构组
成与不同氮肥水平处理、土壤 pH、硝态氮、铵态氮、
碱解氮、有效磷、速效钾和有机质等环境因素的相
关性[1112]。利用 SPSS 13.0软件进行数据方差分析。
2 结果与分析
2.1 氮肥供应量对土壤养分状况的影响
表 2 显示了不同氮肥水平处理下稻田表层土壤
和根层土壤的养分状况。由此可见, 在表层土壤中,
不同处理之间的土壤 pH 和铵态氮含量没有显著差
异 , 氮肥处理(N1、N2 和 N3)的硝态氮含量显著
(P<0.05)高于不施肥对照(CK), 且在高氮(N3)处理
下土壤碱解氮含量显著(P<0.05)提高; 在根层土壤
中, 不同处理间的土壤铵态氮含量也没有显著差异,
硝态氮含量在 3 个氮肥水平处理下均显著(P<0.05)
提高, 且中、高氮处理(N2 和 N3)显著(P<0.05)高于
低氮处理(N1), 随氮肥水平提高土壤碱解氮含量逐
412 中国生态农业学报 2013 第 21卷


表 2 不同氮肥水平处理下稻田表层和根层土壤养分性状
Table 2 Chemical properties in surface and root zone soil in the paddy field under different N fertilizer treatments
土层
Soil
layer
处理
Treatment
pH
(H2O)
NH4+-N
(mg·kg1)
NO3-N
(mg·kg1)
碱解氮
Alkali-hydrolyzable N
(mg·kg1)
有效磷
Available P
(mg·kg1)
速效钾
Available K
(mg·kg1)
有机质
Organic
matter
(g·kg1)
CK 5.86±0.22a 6.24±0.69a 4.78±0.80c 78.6±10.8bc 10.8±2.9a 41.3±6.3a 11.9±2.4a
N1 5.90±0.23a 6.00±0.47a 8.49±1.14ab 79.1±6.8bc 12.2±1.2a 40.0±8.9a 10.6±1.3a
N2 5.85±0.21a 5.07±0.89a 9.78±1.26a 86.5±5.5b 10.6±3.4a 49.0±8.4a 11.2±2.3a
表层
Surface
N3 5.65±0.17ab 5.29±0.56a 10.54±0.88a 100.0±3.5a 13.3±2.4a 49.8±9.6a 11.6±2.6a
CK 5.83±0.05a 6.12±0.73a 3.58±0.82c 69.7±4.8c 11.3±4.9a 41.3±4.1a 11.7±2.0a
N1 5.53±0.11b 5.67±0.77a 6.73±0.96b 82.3±2.9b 11.4±1.3a 41.2±3.8a 11.4±1.6a
N2 5.59±0.10b 5.52±0.35a 9.43±0.99a 82.7±5.1b 11.2±1.2a 42.3±3.4a 10.7±1.5a
根层
Root
zone
N3 5.41±0.10b 5.09±0.51a 8.80±1.06a 95.2±6.4a 11.3±1.2a 45.0±2.9a 11.3±1.1a
CK: 不施肥 No fertilization; N1: 75 kg(N)·hm2; N2:150 kg(N)·hm2; N3: 225kg(N)·hm2; 下同 The same below. 同列数据后不同字母表
示差异显著(P<0.05) Different letters in the same column mean significant difference at P < 0.05.

渐增加, 呈 N3>N2、N1>CK的显著趋势(P<0.05); 同
时施用氮肥降低了稻田根层土壤 pH, N1、N2和 N3
的土壤 pH均显著(P<0.05)低于 CK。此外, 不同氮肥
水平间稻田根层或表层土壤中磷、钾有效性和有机
质含量均没有显著差异。
2.2 氮肥供应量对土壤厌氧氨氧化菌群落结构的
影响
利用厌氧氨氧化菌 16S rRNA 基因特异引物对
稻田土壤厌氧氨氧化菌的群落结构进行 PCR-DGGE
分析, 如图 1 所示。由 DGGE 图谱可见, 无论在表
层土(图 1a)还是根层土中(图 1b), N3 处理的 DGGE
条带数量均明显多于其他处理 , 且在不同处理的
DGGE图谱相同位置的 DNA条带中以 N3处理的条
带亮度较高。
基于厌氧氨氧化菌 16S rRNA基因 DGGE图谱
中条带位置和亮度的数字化数值计算了厌氧氨氧化
菌群落多样性指数(Shannon-Wiener index), 结果如
图 2所示。在表层土和根层土中, N3处理的厌氧氨
氧化菌群落多样性指数都显著(P<0.05)高于 N2、N1
和 CK 处理; 而且在高氮处理下(N3)表层土壤中厌
氧氨氧化菌的群落多样性指数还显著(P<0.05)高于
根层土壤。表明高氮处理显著提高了稻田土壤厌氧
氨氧化菌群落多样性。
图 3显示了利用 CANOCO 4.0生态学软件, 基
于 DGGE 图谱中 DNA 条带的位置和亮度进行的稻
田表层土壤和根层土壤厌氧氨氧化菌群落结构组成
的冗余分析(RDA)结果。由此可见, 表层土壤中不同
处理的厌氧氨氧化菌群落组成在变异较大的 x 轴方
向存在一定分布差异, 尤其是 N3处理的 3次重复均
与 CK或 N1的分布存在明显差异(图 3a); 在根层土
壤中不同氮肥水平处理的厌氧氨氧化菌群落结构组
成在变异较大的 x 轴方向上的分布差异不明显, N3
处理也仅有 2次重复的分布距其他处理较远(图 3b)。
同时冗余分析的显著性相关分析也显示, 表层土壤
中厌氧氨氧化菌群落结构组成与不同氮肥水平处理
存在显著正相关(P=0.006); 而根层土壤中厌氧氨氧
化菌群落结构组成与不同氮肥水平处理及土壤理化
性状等因素均没有相关性。上述结果表明氮肥水平
提高对稻田表层土壤中厌氧氨氧化菌群落结构的影
响较大。
2.3 稻田优势厌氧氨氧化菌种类分析
通过对 DGGE 图谱主要条带 DNA 序列分析研
究定位试验稻田土壤中厌氧氨氧化菌主要种类。对
主要的DGGE条带进行了DNA克隆测序, 获得厌氧
氨氧化菌 16S rRNA 基因片段序列 18 条 (m1~
m18)(图 1)。在 GenBank中进行 Blast比对确定本研
究中分离到的厌氧氨氧化菌均归于不可培养的浮霉
菌目(Unclutured Planctomycete sp.)。将不同序列登
陆 GenBank获得登录号: JX136678~JX136695。
进一步利用 MEGA4.0 软件构建 DGGE 条带序
列和其在 GenBank 中进行 Blast 比对的最高相似序
列的邻接法(NJ)系统发育树, 如图 4所示。由此可见
不同序列分别聚类为 2 大分支, 其中一个聚类分支
中条带m3和m6相似性较高, 首先聚类, 条带m13、
m7、m8、m10、m1和 m2依次聚类, 上述 8条序列
总体相似性较高, 在GenBank的Blast比对中具有相
同的最高相似序列; 而在另一大聚类分支中又存在
3个主要分支, m14和 m15相似性较高, 具有相同的
最高相似序列, 聚类在一支中, m4和m9虽具有不同
的最高相似序列, 但相似性仍较高, 聚类在一支中,
m16、m11、m18、m17和 m12具有同一最高相似序
列, 聚为另外一支, m5 与其他序列差异较大, 单独
聚类。
第 4期 宋亚娜等: 稻田厌氧氨氧化菌群落结构对氮肥的响应 413




图 1 不同氮肥水平下稻田表层土壤(a)和根层土壤(b)中
厌氧氨氧化菌 16S rRNA基因的 DGGE图谱
Fig. 1 Images of DGGE for 16S rRNA gene of anammox
bacteria in surface soil (a) and root zone soil (b) of the paddy
field under different N fertilizer treatments



图 2 不同氮肥水平下稻田土壤厌氧氨氧化菌群落多样性
Fig. 2 Shannon-Wiener index of anammox bacteria commu-
nity in the paddy field under different N fertilizer treatments
不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05) Values with dif-
ferent letters are significantly different at 0.05 level.

3 讨论
最初从人工生态系统中发现的厌氧氨氧化菌在
许多自然生态系统中广泛分布, 并对氮素循环起着
重要作用。如, 在海洋环境中厌氧氨氧化菌广泛分
布, 且对海洋沉积物氮素循环的贡献率可高达 50%
以上[13]。陆地生态系统中的某些缺氧区域可能同时
存在 NH4+和 NO2, 也可为厌氧氨氧化菌生长提供
良好生境。研究证实, 在湿地、冻土和农田土壤中
均存在厌氧氨氧化菌[6,14]。研究同时认为土壤含水率
和氮素含量等环境因子决定了厌氧氨氧化菌的存在
与否及其群落结构多样性[6]。含氮低氧的稻田土壤
为厌氧氨氧化菌提供了生长条件, 16S rRNA基因分
析发现在淹水红壤稻田土壤中存在厌氧氨氧化菌[8]。
本研究通过对第 3 年田间定位试验的稻田土壤分析
发现, 高氮处理[225 kg(N)·hm2]可促进土壤厌氧氨
氧化菌群落多样性的增加, 稻田表层和根层土壤的
厌氧氨氧化菌群落多样性指数在高氮处理下均显著
提高(P<0.05); 同时表层土壤厌氧氨氧化菌群落结
构组成与不同氮肥水平显著相关(P=0.006)。此外 ,
高氮处理下, 稻田表层土壤厌氧氨氧化菌的群落多
样性指数还显著高于根层土壤(P<0.05)。上述不同氮
肥水平处理的稻田土壤厌氧氨氧化菌群落组成和多
样性的变化与土壤硝态氮和碱解氮含量的变化较一
致。可初步推断氮肥用量增加提高了土壤氮素有效
性, 从而会促进稻田土壤厌氧氨氧化菌群落多样性
的提高及其结构组成的改变。
本研究中用于厌氧氨氧化菌研究的基因是 16S
rRNA基因。由于厌氧氨氧化菌与其他细菌存在复杂
的进化关系, 其 16S rRNA基因序列差异较大, 有时
在 16S rRNA上只有 85%的同源性[2]。所以, 在针对
厌氧氨氧化菌 16S rRNA 基因扩增中, 常常会扩增
到非目的基因序列, 降低环境中厌氧氨氧化菌多样
性研究的准确性。若结合厌氧氨氧化菌功能基因的
研究, 将能更准确有效地分析环境中厌氧氨氧化菌
多样性及其功能。此外, 缺氧环境中可能是由厌氧
氨氧化造成的氮损失却常常被认为是反硝化过程的
结果, 由于厌氧氨氧化与反硝化的效果相同, 用传
统的同位素示踪方法不易区分, 还需要利用其他示
踪技术和基因标记的方法来研究环境中厌氧氨氧化
过程。如利用稳定性同位素核酸探针(DNA-SIP)技术
分析厌氧氨氧化菌某些功能基因的活性, 将能更直
接有效地研究环境中厌氧氨氧化活性。
近年来, 研究发现厌氧氨氧化反应的关键酶之
一是位于厌氧氨氧化单体上的肼氧化酶(hydrazine-
oxidizing enzyme, HZO), HZO及其基因(hzo)已经在
一些相关微生物体内得到了鉴定[15]。hzo 基因系统
发育分析揭示至少存在 3 类厌氧氨氧化菌 hzo 基因
序列 , 其中至少一类与已公布的厌氧氨氧化菌的
16S rRNA的系统发育分析相一致[16]。因此, hzo基
因可初步作为功能标记基因用于分析环境中的厌氧
氨氧化菌。目前, hzo基因已经被作为功能标记基因
用于海洋、河流等水体系统中厌氧氨氧化菌群落的
414 中国生态农业学报 2013 第 21卷




图 3 不同氮肥水平下稻田表层土壤(a)和根层土壤(b)中厌氧氨氧化菌群落组成的冗余分析
Fig. 3 RDA analysis of community composition of anammox bacteria in surface soil (a) and in root zone soil (b) of the paddy field
under different N fertilizer treatments



图 4 基于 DGGE条带序列的稻田厌氧氨氧化菌邻接法系统发育树
Fig. 4 Neighbor-joining tree based on DGGE band sequences of anammox bacteria in the paddy field

研究[17], 但在土壤生态系统中的应用还鲜有报道。
若在本研究基础上, 进一步结合 hzo 功能基因的分
析, 将有助于进一步深入揭示稻田厌氧氨氧化菌群
落多样性及其生态功能。
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