全 文 ：·综述与专论·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 9 期
典型环境污染物修复基因工程菌的构建及应用
关向杰 杨海君 盛博文 黄水娥
(湖南农业大学生物安全科学技术学院，长沙 410128)
摘 要: 随着人类活动的增加，对有机物和重金属的应用越来越广泛，同时造成的环境污染程度越来越严重。综述了
石油、农药、表面活性剂及重金属类污染物治理中基因工程菌的构建及应用的研究进展，指出利用基因工程菌解决环境中的
石油、农药、表面活性剂及重金属的污染问题已成为环境污染修复领域的研究热点，并提出基因工程菌的构建及应用过程中
的难点及发展趋势。
关键词: 基因工程菌 石油 农药 表面活性剂 重金属 微生物修复
Construction and Application of Genetic Engineering
Bacteria in Typical Environmental Pollutants Bioremediation
Guan Xiangjie Yang Haijun Sheng Bowen Huang Shuie
(College of Bio-safty Science ＆ Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128)
Abstract: As the human activities increasing，organic matter and heavy metal used widely caused the environmental pollution
more and more serious． This article summarized the construction of genetic engineering bacteria and its applications in oil pollution，
pesticide pollution，heavy metal pollution and surfactant pollution bioremediation，which has proved to be a hot pot in environmental
pollutants bioremediation researching． It also put forward the difficulties in the construction and application of genetic bacteria and de-
veloping trend．
Key words: Genetic engineering bacteria Oil Pesticide Surfactants Heavy metal Micro-biological remediation
收稿日期:2011-04-01
基金项目:湖南省自然科学基金项目(09JJ4016) ，湖南省环境保护厅重点项目(湘财建指［2009］364)
作者简介:关向杰，男，硕士研究生，研究方向:环境微生物学;E-mail:chongda2010@ 126． com
通讯作者:杨海君，男，博士，副教授，硕士生导师，E-mail:yanghaijun352@ yahoo． com． cn
随着农业、工业的不断发展，化工、印染、采矿等
带来的三废超标排放，以及农用化学品的过度使用
造成了严重的环境污染，特别是重金属污染越来越
严重。传统生物处理污染物的方法大多以自然生长
的微生物群体驯化，繁殖利用为主。但由于微生物
混合培养在处理污染物的过程中，因其代谢过程复
杂，能量利用不经济，使得污染物的修复效率不佳，
而且大多混合培养的微生物之间的相互关系和作用
机制的研究还不完全清楚等问题，制约着混合微生
物的广泛应用。由此，为克服上述不足和提高污染
物的处理效果，许多研究者开始了基因工程菌的构
建及其应用方面的研究［1］。
1 基因工程菌的构建及应用
1. 1 石油类污染物降解基因工程菌的构建及应用
石油是一种成分十分复杂的混合物，由上千种
有机化合物组成，其中一些有毒的化学物质具有致
癌、致畸和致突变的潜在性。其在开采、炼制、运输
和使用过程中，不可避免地会抛洒或泄漏于海洋、河
流和土壤，由此也造成了石油对土壤、河流和海洋的
严重危害［2］。为此，许多学者利用多种方法开展了
石油类污染物的治理研究［3 － 5］，比如化学方法、物理
方法、生物方法以及物理与化学结合法等。生物方
法中的微生物法因其费用低、作用迅速、效果好、无
二次污染等特点，成为石油类污染治理研究的热点。
2011 年第 9 期 关向杰等:典型环境污染物修复基因工程菌的构建及应用
由于单一石油类高效降解菌应用的局限性等原因，
研究者利用生物技术构建石油类污染物工程菌及其
应用，并取得了一系列成果。
早在 20 世纪 70 年代，Chakrabayty［6］在同一菌
株中植入降解乙烷、辛烷和癸烷，降解二甲苯，降解
萘和分解樟脑的 4 种假单胞菌的不同质粒，由此得
到的工程菌具有超常规的能力，能够同时降解脂肪
烃、芳烃、萜和多环芳烃，且降解石油的速度快、效率
高，在几个小时内能降解完海上溢油中 2 /3 的烃类，
而自然菌种则需要用一年多的时间，但质粒容易丢
失或转移，遗传稳定性差。李尔炀等［7］采用染色体
DNA转化原生质球的方法，构建了一株处理含 PTA
废水的工程菌 LEY3。该菌能同时降解 PTA、萘、苯
甲酸、十六兢、乙二醇和甲醇 6 种化合物。用该菌对
含 PTA 生产废水作降解试验，COD 的去除率达
66% －91%。但供体基因进入细胞后随机整合到受
体染色体上，导致各供体基因所获启动子活性不同，
由此造成各基因之间表达强度不同，宏观上表现为
对 6 种化合物降解率不同。宋绍富等［8］采用原生质
体融合技术，将一种耐高温(72℃)、耐盐(30%
NaCl)、耐酸碱(pH5 － 9. 4) ，并可利用原油为碳源代
谢生物表面活性剂的芽孢杆菌属菌Ⅰ和另一种为可
在 30℃利用糖蜜代谢水不溶性多糖聚合物的肠内
杆菌属菌 JD融合，后将得到的融合子进行多次传代
培养优选，最终获得了 9 株遗传性状稳定和代谢多
糖性能优异的融合菌。但受融合子的耐酸性能改进
不大的影响，与 JD亲本菌比较接近，只能在 pH为 6
－ 10 的环境中产生多糖。李焕杰等［9］通过构建血
红蛋白基因表达质粒并电击导入德氏假单胞菌中，
得到基因工程菌。该菌与原始菌相比，生长速率较
高且最大脱硫活性提高了 214 倍。但在实际的柴
油脱硫试验中，工程菌的脱硫率为 69. 19%，而原
始菌为 57. 12%，两者相差不明显。宋永亭［10］将
烷烃单加氧酶基因 slad A 克隆到质粒 pSTE33
上，并将重组质粒通过电击转化导入嗜热脱氮土
壤芽孢杆菌中，得到了基因工程菌 SL-21。该工
程菌具有嗜热功能，并且对原油降解效果明显。
但烷烃单加氧酶基因 slad A 在不同的基因工程
菌株中表达的效率不同，且质粒的遗传稳定性有
待进一步研究。
1. 2 农药类污染物的降解基因工程菌的构建及
应用
农药是一类有毒化学物质，在生产、贮存、运输
和使用过程中都可能发生环境污染问题，不仅造成
生态环境的破坏，而且危害人类的健康。因此农药
污染已成为全世界关注的环境问题之一［11］。
目前世界上可用作农药的化学物质有千余
种，制剂数万个。我国生产的农药主要有无机类
农药、有机氯农药、有机磷、氨基甲酸酯、有机氮类
杀虫剂以及磺酸脲类除草剂，并在实践中大量使
用了这些农药［12］。上述农药有些随着时间的推移
被自然降解，而有些长期存在环境中，并且对生物
界产生不利影响。因此，处理这些残留的有机农
药成为了人们关注的热点。有机农药的结构复杂
和降解这些农药的代谢途径差异性大，导致了单
一微生物种群降解效率不高。所以构建高效降解
多种农药的多功能工程菌则成为目前研究的前沿
和热点［13］。
Song等［14］分离到一株以 1，2，4-三氯苯为唯一
碳源的施氏假单胞菌 THSL-1，并将施氏假单胞菌
THSL-1 的质粒，用 Ca2 +诱导大肠杆菌转化法，转化
到 E． coli JM109 中，得到转化子能以 1，2，4-三氯苯
为唯一碳源生长，且对 1，2，4-三氯苯有降解作用，但
有待进一步检验质粒遗传的稳定性。张丽青等［15］
将抗性库蚊解毒酶酯酶 B1 基因片段引入融合表达
载体 pThioHisA中，转化入大肠杆菌 DH5α，并获得
了酯酶 B1 在大肠杆菌的融合高效表达，占菌体总
蛋白的 48. 7%，并具有较高的酯酶 B1 活性，能高效
降解酯酶的特异性底物 β-乙酸萘酯(β-NA) ，并能
快速降解有机磷类农药，但也未对该工程菌遗传稳
定性进行研究。彭冉等［16］采用质粒消除技术对铅
抗性菌和高效酚降解菌的抗铅降酚基因进行定位，
提取高效酚降解菌降解质粒，并将其转化到铅抗性
菌中进行遗传重组，得到了抗铅降酚工程菌。该工
程菌对铅具有较强抗性并具有强降解苯酚功能，使
得对酚的降解率达 95%以上。与原降酚菌株相比，
工程菌存在较长的延滞期，且工程菌的质粒稳定性
较差，随着转接次数增加，降解苯酚能力明显下降。
陆鹏等［17］通过转座子介导同源重组法，将甲基对硫
磷水解酶基因 mpd 导入到六六六降解菌 BHC-A 的
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 9 期
染色体上，构建了能同时降解六六六和甲基对硫磷
的工程菌 BHC-A-mpd。BHC-A-mpd 表达出有活性
的底物广谱性有机磷水解酶，能降解多种有机磷农
药;在遗传稳定性方面也优于以质粒为载体构建的
基因工程菌，且生长特性与原始菌株没有差别。但
工程菌 BHC-A-mpd是否存在安全性问题，需要进一
步研究。Wu 等［18］用 PCR 从一株六六六降解菌
BHC-A扩增出完整的氯化氢酶基因 lin A，克隆到含
有 mini-Tn5 的自杀性质粒 Put4K 上，通过三亲接
合，将脱氯化氢酶基因 lin A整合到一株高效降解多
菌灵菌株 Rhodococcus sp． DJL-6 的染色体 DNA 上，
得到了同时降解多菌灵和六六六的工程菌株 DJL-
6A。该工程菌的 lin A基因可以持续稳定遗传。可
见转座子介导同源重组法在解决遗传稳定性方面具
有良好的表现，但工程菌的安全性和是否能保持遗
传稳定性，还需要进一步研究。
1. 3 表面活性剂类污染物降解的基因工程菌的构
建及应用
表面活性剂作为能改变(通常降低)水和其他
液体表面张力或两相间界面张力的物质，具有润湿、
分散、乳化、增溶、起泡、洗涤、防腐和杀菌等作用，广
泛地用于纺织、造纸、皮革、毛皮、医药、染料、环保、
化妆品、消防和农业等方面［19］。表面活性剂按极性
基团的解离性质分为阴离子表面活性剂、阳离子表
面活性剂、两性离子表面活性剂、非离子表面活性
剂。然而，表面活性剂在造福人类的同时，也带来了
系列的环境污染问题。如使水中溶氧量明显降低、
水质恶化;通过食物链进入人体，造成疾病;对有害
物形成增溶、乳化、分散作用;富集有机污染物，抑制
微生物对有机物的降解，增强其对环境的危害等问
题［20］。随着人们对环境保护的重视，表面活性剂污
染的修复也越来越引起研究者们的兴趣。与物理化
学修复相比，微生物修复对人和环境造成的影响小，
是一种高效、经济和环境友好的清洁技术。所以筛
选对表面活性剂具有高效降解能力的菌株用于修复
表面活性剂对环境的污染具有重要的理论意义与应
用价值［21］。
国内外研究者们已经大量报道了从不同的污染
环境中筛选到降解不同种类表面活性剂的降解菌，
并对它们的生理生化、影响因素及降解特性方面进
行了研究。张敏等［22］从洗涤剂生产车间暖气池活
性污泥中分离出一株降解 AE0 型非离子表面活性
剂 C12E7的高效嗜冷菌株，低温下该菌的降解率可
达 70%以上。杨海君等［23］从工厂排污口废水中分
离、纯化并筛选出一株降解十二烷基聚氧乙烯醚
(Brij-30)的菌株，鉴定为伯克氏菌属(Pandoraea
sp．) ，命名为 B30。该菌对土壤中非离子表面活性
剂 Brij-30 有强降解作用，降解率在 67% － 86%之
间，但没有对该菌进行应用研究，且该菌的降解对象
存在局限性。在这些降解菌中研究者还发现了与降
解表面活性剂有关的基因和质粒。Davison 等［24］研
究发现 sdsA和 sdsB两个基因决定了假单胞菌是否
能降解十二烷基硫酸钠(SDS)。Jovcic 等［25］进一步
研究了十二烷基硫酸钠(SDS)降解菌 Pseudomonas
sp． ATCC19151 基因表达时，发现基因 sdsA 使该菌
能利用 SDS 为唯一碳源，基因 sdsB 能调控基因 sd-
sA和 sdsB的转录。Kostal 等［26］从表面活性剂降解
细菌 Pseudomonas C12B中提取到一种大质粒，该质
粒能够利用直链烷烃(C9-C12)和直链烯烃(C10 和
C12)。吴云等［27］从表面活性剂污水细菌中分离到
含有表面活性剂降解活性的大质粒，并发现该质粒
可进行接合转移。这些表面活性剂降解菌及其降解
基因和质粒的研究成果，为基因工程菌的构建奠定
了理论基础。
1. 4 重金属污染治理的基因工程抗性菌的构建及
应用
存在于环境中的重金属可通过食物链在生物体
内聚集，并极大地危害人类健康。传统治理重金属
污染的方法有淋滤法、客土法、吸附法、沉淀法、鳌合
树脂法和膜技术等物理方法以及络合浸提法等化学
方法和生物修复，其中微生物修复具有治理效果好，
无二次污染，运行费用低等特点受到人们普遍关
注［28］。微生物之所以能耐受一定浓度重金属的毒
性，是因为微生物的多样性及它们生存的特定环境
导致了抗性具有多样性，这种多样性主要体现在两
个方面:一是通过在细胞中产生对金属离子具有高
结合容量的络合物，以络合体内的重金属降低毒性
较大的活性游离态重金属离子存在，如真核微生物
中大量存在的金属硫蛋白;二是通过一些特定的金
属离子转运系统将胞内的重金属离子转运出去，以
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2011 年第 9 期 关向杰等:典型环境污染物修复基因工程菌的构建及应用
减少对重金属离子的摄取，大多数原核微生物主要
以这种方式体现对重金属的抗性［29，30］。但单纯使
用传统微生物法处理重金属在适应性和高效性等方
面存在局限性。针对上述问题，研究者们通过基因
工程技术对微生物的金属络合物和特定金属转运系
统进行了改良和改造，构建基因工程菌代替普通微
生物处理重金属污染物是近年来研究的热点。
邵群等［31］构建了含有完整的抗砷结构基因及
其启动子的重组质粒，通过接合的方法将重组质粒
转移到氧化硫硫杆菌中，筛选得到了接合子。接合
子的抗砷水平比对照菌提高了 2 倍。但接合转移频
率和接合子的抗砷能力，随受体菌的不同而有所差
异。赵清等［32］利用 DNA 体外重组技术，将大肠杆
菌质粒载体 pUM3 上的抗砷基因亚克隆到含有强启
动子并具有广泛寄主范围特性的质粒 pMMB24 上，
构建了抗砷质粒 pSDRA4，通过接合转移的方法将
其导入专性自养极端嗜酸性喜温硫杆菌 Acidithioba-
cillus caldus 中，构建了冶金工程菌 Acidithiobacillus
caldus(pSDRA4)。经抗砷性能力检测，与野生菌相
比，构建的喜温硫杆菌工程菌抗砷能力明显提高了
2 倍，且重组质粒在喜温硫杆菌中具有较好的稳定
性。但共存环境中影响工程菌抗砷能力的诸多因素
有待进一步研究。邓旭等［33］将带有汞操纵子和金
属硫蛋白编码基因的重组 DNA 质粒转化到大肠杆
菌 E． coli JM109 中，得到了从废水中富集汞离子能
力强的基因工程菌，且工程菌对 pH 变化不敏感。
但废水中其他共存离子的存在会导致菌体的平衡富
集能力下降 30%，从而影响了基因工程菌处理金属
离子的效果。Chen等［34］也将带有汞转运系统和谷
胱甘肽与豌豆金属硫蛋白融合基因(GST-PMT)的
重组 DNA质粒转化到大肠杆菌 E． coli JM109 中，使
该菌的抗汞能力比原始菌株提高了 7 倍，还发现金
属螯合剂 EDTA和柠檬酸对汞的富集影响不明显。
郑杨春等［35］也以大肠杆菌 E． coli JM109 为宿主菌
同时表达汞转运系统(Mer P和 Mer T 蛋白)和谷胱
甘肽与金属硫蛋白融合基因(GST-MT) ，发现该基
因工程菌可以在低 Hg2 +浓度环境中仍可有效富集
Hg2 +，并且利用连续操作搅拌槽式生物反应器，实
现了对有机废水配伍的含汞废水的连续化处理。虽
然金属螯合剂 EDTA 对该菌生长抑制作用明显，但
基本不影响柠檬酸对其生长富集耦合行为。Bae
等［36］将汞转运系统和植物螯合肽与麦芽糖融合蛋
白(MBP-EC20)转化到大肠杆菌 E． coli JM109 中，
使该工程菌对汞的富集能力显著提高，而且 Ni2 +的
存在对汞的富集无影响。上述基因工程菌对汞都具
有很强的选择特异性和亲和性，但汞离子浓度、离子
强度、络合物、共存金属离子等环境因素对其富集
Hg2 +的影响却有所不同。
在对 Ni2 +生物富集研究方面，邓旭等［37］还通过
电穿孔法将含有异性镍转运蛋白基因重组质粒和金
属硫蛋白基因重组质粒对大肠杆菌 JM109 进行转
化，得到了同时表达高特异性镍转运蛋白和金属硫
蛋白的基因工程菌。该工程菌不仅对 Ni2 +的富集
速率快，而且对镍富集能力提高了 6 倍。该工程菌
对 pH值、离子强度的变化及其它共存重金属离子
的影响都表现出更强的适应性，但 Mg2 +、Hg2 + 和
Cu2 +对富集影响较大。张迎明等［38，39］利用 PCR 技
术从一株金黄色葡萄球菌的基因组中扩增出镍钴转
运酶基因，构建重组质粒，并转化到大肠杆菌 BL21
中，经筛选得到基因工程菌。该工程菌对镍的富集
容量与原始宿主菌相比提高了 3 倍多，表达的镍钴
转运酶对镍具有较高的特异性。通过遗传稳定性试
验，结果发现重组质粒具有良好的结构稳定性，基因
工程菌对镍的富集能力也保持较好的稳定性。但
Pb2 +和 Cd2 +的存在对基因工程菌吸附 Ni2 +的影响
比较大。此外，Sousa 等［40］以大肠杆菌为宿主菌表
达酵母金属硫蛋白(CUP1)、哺乳动物金属硫蛋白
(HMT-1A)和外膜蛋白 LamB的融合蛋白，发现该基
因工程菌对 Cd2 +的富集能力比原始宿主菌提高了
15 － 20 倍。蔡颖等［41］也将两种重组质粒转入大肠
杆菌 JM109，得到了同时表达高特异性镉结合转运
蛋白和豌豆金属硫蛋白的基因工程菌。该工程菌具
有较强的镉离子富集能力，但容易受其他重金属离
子的影响。并且螯合剂 EDTA对工程菌富集能力起
较强的抑制作用。两种重组质粒能否长期共存还有
待研究。
2 基因工程菌的构建及其应用发展趋势与
展望
综上所述，在基因工程菌的研究方面，许多学者
从不同领域进行了深入研究，并得到了一些有价值
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 9 期
的研究成果，但在以下方面，还有待进一步研究，也
是今后研究的重点和热点。
首先，彻底搞清基因工程菌遗传的稳定性。研
究发现，基因工程菌在保存及发酵生产过程中表现
出不稳定性。该问题的解决已成为基因工程的成果
能否转变为生产力的关键因素之一［42］。在影响重
组质粒稳定性的诸多因素中，宿主细胞的遗传特性、
重组质粒的组成和克隆菌所处的环境条件等三方面
受到人们的重视，从分子水平讲，影响某些质粒稳定
性的基因顺序以及定位;从细胞水平看，只有选择一
些具有特定遗传背景的细胞作为宿主方可获得比较
稳定的克隆菌。但还需从广度和深度上进一步研
究，以期从根本上提高重组质粒的稳定性。另一方
面，在目前还不完全清楚影响质粒稳定性的原因的
情况下，从工程水平上探究决定重组质粒稳定性的
各种因素及其对发酵生产的影响十分必要。
其次，是深入研究基因工程菌的安全性。在治
理污染过程中，人们也提出了关于基因工程菌自身
所造成的污染。由此，在一定条件下，是否可以诱导
基因工程菌在完成使命后自身死亡，成为了热点问
题。通过基因工程技术，将诱导自杀元件转入基因
工程菌的细胞内。这一元件就是一个可控制的自杀
系统，在温度、化学条件等达到要求时，基因工程菌
就会失去活性而死亡。由此，建立相关的监测与评
价指标体系，对于指导不同地区的基因工程菌修复
实践以及基因工程菌修复技术的发展与完善都具有
意义。
此外，利用生物信息技术探究基因工程菌的降
解机理。通过建立环境微生物的基因库，利用生物
信息技术进行基因序列分析、基因定位、克隆新基
因、蛋白功能分析及基因表达分析等，加快了人们对
微生物降解机理和发育系统生物学等方面研究，其
研究成果将成为环境污染综合治理的重要理论
基础［43，44］。
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(责任编辑 马鑫)
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