全 文 ：·综述与专论·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 7期
诱导多能干细胞研究进展
罗庆　宋关斌　袁琳
(重庆大学生物工程学院 生物流变科学与技术教育部重点实验室 ,重庆 400044)
　　摘 　要 : 　用 4个外源基因从完全分化的人成纤维细胞诱导获得了具有胚胎干细胞特性的诱导多能干细胞 ( iPS细胞 ) ,
成功逆转了细胞单向发育的规则 ,取得了细胞重编程和干细胞研究中的重大突破。围绕 c2M yc基因和基因载体、诱导效率和
外源基因替代因子等方面的研究内容 ,综述了自 2007年人 iPS细胞构建至今 ,国内外在改进 iPS细胞诱导方法上的主要研究
进展。
关键词 : 　诱导多能干细胞 　重编程 　肿瘤形成 　诱导效率 　替代因子
Research Progress of Induced Plur ipotent Stem Cell
Luo Q ing　Song Guanbin　Yuan L in
( College of B ioengineering, Chongqing University, Key Laboratory of B iorheological Science and
Technology, M inistry of Education, Chongqing 400044)
　　Abs trac t: 　The findings of induced p luripotent stem cells ( iPS cells) reserved the developmental arrow of cells and considered a
great breakthrough of rep rogramm ing and stem cell researches1 The research p rogress of the method imp rovement of iPS induction were
reviewed and three aspects of researches including c2M yc gene and vectors, inductive efficiency as well as candidates for exogenous
gene rep lacement were focused1
Key wo rds: 　Lnduced p luripotent stem cell　Rep rogram　Tumorgenesis　 Inductive efficiency　Rep lacement factor
收稿日期 : 2009204217
基金项目 :国家自然科学基金 (30770530) ,重庆大学研究生科技创新基金 (200707A1A0170254)
作者简介 :罗庆 (19792) ,女 ,在读博士生 ,主要从事生物力学及细胞生物学相关研究
通讯作者 :宋关斌 ,教授 , Tel: 023265102507, E2mail: song9973@1261com
　　2006年 Yamanaka等 [ 1 ]用逆转录病毒载体在小
鼠成纤维细胞中表达 Oct3 /4、Sox2、Klf4和 c2Myc等
4个转录因子 ,成功获得了具有胚胎干细胞特性的
诱导多能干细胞 ( induced p luripotent stem cell, iPS
cell) ,取得了细胞重编程研究中重大的突破。2007
年底 Yamanaka等 [ 2 ]用相同的基因 , Thom son等 [ 3 ]用
N anog和 L in28替代 Klf4和 c2M yc基因均成功获得
了人成纤维细胞来源 iPS细胞。随后 ,各实验室相
继实现了内胚层、中胚层和外胚层来源细胞的 iPS
重编程诱导 [ 4 ] ,并成功从病体细胞获得了含有特定
疾病遗传特征的疾病特异 ( disease2specific ) iPS
细胞 [ 5 ]。
iPS细胞具有同胚胎干细胞类似的特性并能在
适当的诱导条件下分化为 3个胚层的细胞 ,是具有
全能分化能力的干细胞。它的研究出现不但成功跨
越了长期困扰胚胎干细胞研究的伦理问题 ,为科学
研究和临床应用提供了新的细胞来源 ,并且 ,疾病特
异 iPS的诱导成功更为体外研究遗传疾病发生、发
展和组织形成提供了更加广泛和大量的研究模型 ,
并将有力推动基因治疗和药物研发的发展。
虽然 iPS细胞具有非常高的应用价值和前景 ,
但目前仍有几大问题阻碍着 iPS细胞应用于临床 :
(1) Yamanaka方法中的 c2M yc基因本身就是癌基
因 ,外源 c2M yc在细胞中的表达可能导致肿瘤生成 ;
(2)逆转录病毒或慢病毒载体感染细胞会将外源基
因序列随机整合到基因组 ,可能导致插入突变 ( in2
sertional mutagenesis) ; ( 3 )诱导效率非常低。不管
是采用 Yamanaka或 Thom son的方法 ,诱导效率均低
于 0101% ,且在诱导 30 d左右才有克隆出现。低效
率成为进行大规模 iPS细胞分子机理研究的主要障
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 7期
碍。如何改进 iPS细胞这几大缺陷 ,是目前学术界
关于 iPS细胞研究的一大热点。
1　 iPS细胞诱导方式探索
111　c2M yc基因和基因载体
c2M yc基因是 Yamanaka方法中 4个主要的转
录因子之一 ,同时也是公认的癌基因 ,外源 c2M yc基
因的导入可能会引发癌变。最近 , Yamanaka等报道
在不使用 c2M yc基因的情况下 ,仅采用 Oct3 /4、Sox2
和 Klf4也能高质量的诱导小鼠胚胎成纤维细胞和
人皮肤成纤维细胞重编程为 iPS细胞 ,且小鼠活体
试验并无发现由植入 iPS细胞导致的肿瘤。但此方
法的诱导效率约低于 4个转录因子共同作用 10
倍 [ 6 ]。相关也报道在 4基因诱导系统中去除 c2M yc
基因 ,会延迟 iPS细胞克隆出现的时间 ,诱导效率要
低于 Yamanaka的 4基因诱导方法 [ 3, 7 ] ,提示 c2M yc
基因并不是体细胞重编程为 iPS细胞所必需的 ,但
细胞重编程中 c2M yc基因的参与有助于提高诱导
效率。
不管是采用慢病毒还是逆转录病毒作为基因载
体 ,都会将外源基因序列随机整合到基因组 [ 2, 3, 8 ] ,
引起插入突变并可能进一步导致肿瘤。Graf等 [ 8 ]
研究了由逆转录病毒载体诱导的 6组不同克隆的小
鼠 iPS细胞 ,从对外源基因序列插入基因组整合位
点的比较中发现 ,逆转录病毒插入到基因组是随机
的 ,任意 2组细胞间不存在共同的插入位点。这一
结果提示 ,由病毒载体介导的基因组插入突变并不
是诱导 iPS细胞所必需的 ,利用瞬时转染的方式可
能足以获得 iPS细胞。Yamanaka等 [ 9, 10 ]利用质粒
载体和腺病毒载体在无染色体整合的情况下诱导获
得的 iPS细胞有力的支持了这一观点。
112　诱导效率
根据最新的报道 ,要实现从完全分化的体细胞
到具有胚胎干细胞特性的 iPS细胞的重编程需要至
少 3个 [ 6 ]或 4个 [ 3 ]外源基因同时参与 ,当细胞完成
重编程后 ,这些外源基因在细胞中的表达逐渐沉默。
只有外源基因表达完全沉默 ,转而由内源基因调控
细胞生理特征的细胞才能最终发展成为 iPS细胞 ,
否则这些已完成重编程的早期 iPS细胞可能在外源
基因的引导下重新分化为其它细胞或在重编程后的
初始阶段停滞不前 [ 11 ]。
因此 ,影响重编程效率的原因可能包括 : ( 1)感
染效率。只有当至少 3种基因载体同时感染的细胞
才有可能实现细胞重编程 ,而只有很少一部分细胞
能够同时获得 3种以上外源基因 ; ( 2)外源基因表
达沉默时机。外源基因表达沉默过早 ,无法完成对
细胞的重编程 ,沉默过晚则可能引起细胞再分化或
转化停滞不前。体细胞只有同时被至少 3～4个外
源基因载体感染 ,且能精确掌握由外源基因调控转
化为内源基因调控时机 ,才能最终实现由完全分化
的体细胞到 iPS细胞的转变。显然 ,能同时满足这
两方面条件的细胞少之又少 ,这也是 iPS细胞诱导
效率低下的主要原因。
近来 ,国内外学者从分子生物学和生物化学的
角度对改进 iPS细胞诱导效率的方法作了多方面的
探索。首先 ,多基因参与细胞重编程可以提高 iPS
细胞诱导效率。L iao等 [ 12 ]用 Yamanaka和 Thom son
方法中涉及的 Oct3 /4、Sox2、Klf4、c2Myc、Nanog和
L in28全部 6个转录因子同时感染人体成纤维细胞 ,
获得了 10倍于 4因子感染的诱导效率 ,这可能与
N anog和 L in28基因的加入增加了同时感染重编程
必需基因的细胞比例有关。Cheng等用 Yamanaka
的 4个基因同 SV40大 T抗原 ( SV40 large T anti2
gen)基因共同感染人成体和胎儿的成纤维细胞 ,可
以将诱导效率提高 23～70倍 ,但具体机理还并不清
楚 [ 13 ]。p53 siRNA能通过沉默 p53基因而抑制细胞
中 p53引起的凋亡 , Sox2的下游基因 U TF1能促进
Sox2对细胞的再编程 ,将 p53 siRNA 和 U TF1 与
O ct3 /4、Sox2及 Klf4基因共同作用 ,可以将诱导效
率提高 100倍 [ 14 ]。其次 ,盐酸强力霉素 ( doxycyc2
line, Dox)诱导表达系统能可靠的调节外源基因在
宿主中表达或沉默的时机 ,目前已经广泛应用到
iPS细胞诱导系统中 [ 15～17 ] ,使得人为调控外源基因
表达 /沉默和优化诱导条件成为可能。Hochedlinger
等 [ 15, 17 ]建立了成纤维细胞 → iPS细胞 → iPS细胞来
源成纤维细胞 →次代 iPS细胞 ( secondary iPSC)的
二次诱导模式 ,并采用 Dox可诱导基因表达系统 ,调
控诱导中外源基因的开关时机 ,成功将人成纤维细
胞来源 iPS细胞的诱导效率提高到 2% ～3%。其
次 ,细胞中重编程相关基因的内源表达可能影响
iPS细胞诱导效率。Belmonte等用逆转录病毒感染
6
2009年第 7期 罗庆等 :诱导多能干细胞研究进展
人角质细胞 ,获得了 1%的诱导效率 ,比成纤维细胞
诱导效率高 100倍 ,同时诱导时间也缩短了 1倍 [ 7 ]。
Hochedlinger等用慢病毒载体在人角质细胞中表达
相同的 4个基因 ,虽然只获得了 01002%左右的诱
导效率 ,但能在感染仅 10 d后获得 iPS细胞 ,同 Bel2
monte的报道一致 [ 15 ]。人角质细胞是目前文献报道
诱导生成 iPS细胞最快和效率最高的细胞。该细胞
高表达内源 M yc和 Klf4基因 ,可能有助于提高重编
程的效率。另外 ,诱导过程中添加可溶化学因子也
可以提高诱导效率。报道显示 ,可溶性刺激因子丙
戊酸 ( valp roic acid, VPA ) [ 18 ]、W nt3a[ 19 ] 能提高
O ct3 /4、Sox2、和 Klf4 3基因诱导的成纤维细胞重编
程效率。其机理可能同刺激细胞内源重编程有关基
因表达、开启细胞重编程相关信号通路有关。
113　替代因子
越来越多的证据显示 ,依靠非转基因技术诱导
iPS细胞并非空想。当细胞内源高表达某些重编程
所需要的基因时 ,诱导生成 iPS细胞的效率会有明
显提高 [ 7 ] ,甚至在不需要该外源基因参与的情况下
也能实现细胞的再编程 [ 20, 21 ]。因此 ,寻找化学分子
诱导剂和抑制剂 ,在适当的时机调控细胞内源重编
程基因的表达量上调和下降 ,通过对内源基因的调
控来实现细胞的重编程 ,将有可能为 iPS细胞的体
外诱导提供新的思路。目前研究发现 ,一种 G9a组
蛋白甲基转移酶抑制剂 ———B IX201294 (B IX)能够
替代 c2Myc和 Sox2,同 Oct3 /4和 Klf4转基因共同作
用 ,在神经祖细胞的重编程诱导中获得与 4基因诱
导系统相同的诱导效率 [ 22 ]。另一种组蛋白脱乙酰
化酶抑制剂 ———丙戊酸也能替代外源 Klf4基因功
能 ,与 O ct4和 S ox2基因一同诱导人成纤维细胞重
编程为 iPS细胞 [ 18 ]。虽然关于这些化学因子替代
作用的报道还只是局限于某一种特定细胞 ,不具有
广泛性 ,但却为 iPS细胞的重编程诱导打开了一条
崭新的思路。此外 ,一种运用可转导蛋白诱导 iPS
细胞的方法也正在探索中 [ 23 ]。相信随着对 iPS细
胞重编程机理的深入、全面了解 ,实现非外源转基因
诱导 iPS细胞是完全有可能的。
2　展望
iPS细胞的获得成功逆转了细胞单向发育的规
则 ,成为生物医学发展史上的里程碑。 iPS细胞具
有胚胎干细胞的全能分化特性 ,可作为种子细胞应
用于临床 ; iPS细胞由成熟分化的体细胞诱导而来 ,
突破了长期困扰胚胎干细胞研究的伦理问题 ; iPS
细胞可根据治疗需要由病人体细胞诱导获得 ,有效
避免了免疫排斥反应 ; iPS细胞还可以由病体组织
获得 ,含有疾病特异遗传基因 iPS细胞使疾病和病
人特异的基因治疗、药物设计的研究成为可能。但
是 ,外源转基因的诱导方法和低诱导效率却严重阻
碍了 iPS细胞应用于临床。此外 ,由于 iPS细胞的
研究才刚刚开始 ,加之已经建立的可供研究的 iPS
细胞系数量有限 ,对于 iPS的分子机理认识非常有
限。首先 , iPS细胞虽然在干细胞相关特性上与胚
胎干细胞非常接近 ,但 iPS细胞能否在功能上完全
替代胚胎干细胞需要通过更广泛深入的研究来确
定。其次 ,对于外源基因对体细胞重编程并最终诱
导形成 iPS细胞的机理还知之甚少。Yamanaka和
Thom som报道中的 6个基因在细胞重编程中如何发
挥作用还一无所知。了解细胞重编程的机理不但能
够实现对诱导过程有的放矢的调控 ,还能够为改进
诱导方法 ,提高诱导效率 ,寻找重编程化学替代因子
等研究提供理论依据。
自 2007年 11月人体细胞来源 iPS细胞宣布诞生
以来 ,学术界在 iPS细胞抗肿瘤形成和诱导效率提高
等方面的探索。在抗肿瘤形成方面目前已经取得比
较大的进展 :已经证实 c2M yc基因并不是实现细胞重
编程的必需基因 ,病毒载体介导的外源基因序列在基
因组中的随机整合已可以通过使用质粒载体或腺病
毒载体等非基因组整合载体来解决。在诱导效率方
面 ,通过采用增加外源基因种类、二次诱导、化学因子
刺激等方法 , iPS细胞的诱导效率从小于 0101%提高
到 1%左右。虽然 1年间已经取得了诱导效率 100倍
的提高 ,但效率水平仍然非常低。同时 ,要获得 iPS
细胞克隆 ,诱导周期长 ,通常需要 30 d左右时间。一
些不会对细胞造成不可修复伤害的理化因素的应用
可能会为 iPS细胞的重编程研究提供新的思路。然
而 ,这方面研究的发展很大程度上需要依赖于分子生
物学上关于 iPS细胞重编程机理的研究进展。在 iPS
细胞诱导方法的改进探索之外 ,通过外源基因实现细
胞重编程的机理和 iPS细胞全面的功能特点研究将
是今后该领域的主要研究热点。 (下转第 11页 )
7
2009年第 7期 饶俊等 : BURP蛋白家族研究进展
细胞和发育过程 [ 14 ] ,其具体功能仍有待于进一步的
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