全 文 ：·综述与专论·
生物技术通报
B IO TECHNOLO GY　BULL ETIN 2009年第 9期
诱导多能干细胞的研究进展
张鹏
(北京林业大学生物科学与技术学院 ,北京 100083)
　　摘 　要 : 　体细胞诱导成为多能性干细胞 ( induced p luripotent stem cell, iPS cell)的研究成果被国际生命科学界誉为具有
里程碑意义的创新之举。在短短 3年多的时间里 ,这项研究已经在细胞重编程的机理研究、探索疾病的发生发展机制以及临
床医学的应用等领域引发了很多突破性的进展 ,而且 ,这一非克隆干细胞技术的诞生 ,成功地避开了长期以来争论不休的伦
理问题 ,极大地推动该领域和相关科学领域的发展。从 iPS细胞的研究历程、iPS细胞的构建机理、iPS细胞研究的最新应用成
果以及 iPS细胞的发展前景和研究方向等方面进行了评。
关键词 : 　体细胞 　多能干细胞 　重编程 　外源因子
Progress on Induced Plur ipotent Stem Cells
Zhang Peng
( College of B iological Sciences and B iotechnology, B eijing Forestry University, B eijing 100083)
　　Abs trac t: 　The research on inducing somatic cells into p luripotent stem cells has been seen as dramatic breakthroughs in the ex2
p loration of mechanism of the disease and app lying in clinical medicine within three2year time. Moreover, the appearance of this non2
cloning stem cell technology successfully avoid the long2vexed question of ethics, is a strong impetus to the field and related scientific
fields. The paper focused on several aspects of iPS, including the research course, constitution mechanism, the latest app lication, and
development p rospects.
Key wo rds: 　Somatic cells　Pluripotent stem cells　Rep rogramm ing　Exogenous gene
收稿日期 : 2009204209
作者简介 :张鹏 (19872) ,男 ,本科生 ,研究方向 :细胞生物学 ; E2mail: zhangpengdyx@163. com
1　 iPS细胞的研究概况
111　细胞重编程
细胞重编程是指成熟细胞由分化的状态被逆转
到一种未分化状态的过程 [ 1 ]。在核移植实验中被
发现的细胞重编程现象 ,证明了体细胞能够被逆转
到全能的状态 ,并且可以用于区分遗传学和表观遗
传学的变化。目前 ,已经有多种实验方法可以实现
体细胞的重编程。
体细胞核转移技术 ( somatic cell nuclear trans2
fer, SCNT)是研究较早的体细胞重编程技术 ,它是将
体细胞核移入去核卵母细胞中 ,经过培养 ,核移植后
的细胞会经历一个重编程的过程 ,逆转到全能的状
态。经过多年的研究 ,人们利用这种方法已经获得
了多种核移植动物 ,也建立了来源于核移植胚胎的
胚胎干细胞系。然而 ,此项技术具有很多的局限性 :
实验条件要求高、技术繁杂 ;克隆的效率很低 ;涉及
到胚胎的破坏 ,有伦理道德的限制。
其次 ,将成熟的体细胞与胚胎干细胞 ( ES细
胞 )、胚胎癌细胞 ( EC细胞 )等具有多潜能的细胞融
合 ,也可以在一定程度上使体细胞发生重编程 [ 2, 3 ]。
Cowan等 [ 4 ]发现 ,用病毒和聚乙烯乙二醇使 ES细胞
与皮肤成纤维细胞融合 ,能获得稳定的杂交细胞 ,这
种杂交细胞的分裂方式、细胞周期等与 ES几乎一
样 ,拥有 ES的特征物质并能在一定药物诱导下分
化为各种组织细胞。但这种方法也存在着明显的弊
端 ,即体细胞与多能性细胞的染色体共存于一个细
胞核中 ,使得融合的细胞具有两套染色体。同时 ,此
项技术还面临着融合效率偏低 ,移植后会发生排斥
现象等很多难以突破的技术障碍。
多能细胞的提取物与体细胞共孵育也可一定程
2009年第 9期 张鹏 :诱导多能干细胞的研究进展
度上的实现体细胞的重编程。Taranger等 [ 5 ]的研究
表明 ,使用多能细胞的提取物来诱发体细胞重编程 ,
能驱动体细胞新的基因表达模式。这种方法为研究
体细胞重编程的调控机理开辟了新的途径 ,但目前
还存在一定的争议 ,而且技术手段不成熟 ,所诱导的
重编程效果也十分有限。
此外 ,最近的一些研究也表明 ,多能性干细胞还
可以由某些类型的细胞在体外培养时自发产生。
J iang等 [ 6 ]发现 ,成年动物骨髓来源的细胞能在长期
体外培养后形成多能性成体前体细胞 (MAPCs)。
精原干细胞在体外培养时偶尔能形成类似 ES细胞
的多能性干细胞的现象也相继被发现 [ 7, 8 ]。
总结上述方法 ,其重编程的效率和程度都非常
有限 ,而且由于受到实验条件和政策的严格限制 ,发
展和应用一直难以寻得突破 ,这使得科学界希望寻
找到一种实用性强 ,又不会引起伦理争端的细胞重
编程手段。
iPS细胞的构建方法是 ,通过导入与多能性相
关的外源因子诱导体细胞核发生重编程 ,从而使体
细胞转变成多能性干细胞。这是一种具有很强创新
性的研究方法 ,与之前的方法相比 ,简便易行 ,重编
程的效率和程度也都有了很大的提升。更重要的
是 ,摆脱了材料来源和伦理学的诸多限制 ,因而该研
究成果自诞生就引起了生命科学领域一次巨大的轰
动 ,对今后重编程研究的发展也起到强有力的推动
作用。
112　iPS细胞的研究简史
Takahashi和 Yamanaka[ 9 ]将 24个候选基因的
cDNA序列分别装入逆转录病毒载体 ,将它们导入
到小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF)和鼠尾成纤维细胞
( TTF) ,在小鼠胚胎干细胞 ( ES)的培养条件下培
养 ,结果发现被 O ct4、Sox2、c2M yc和 Klf4 4种基因组
合感染的细胞获得了 Fbx15 +的多潜能干细胞系 ,该
细胞系在细胞形态、生长特性、表面标志物等方面与
小鼠 ES细胞非常相似 ,研究小组将这种细胞命名
为诱导性多能干细胞 ( iPS cell)。将 iPS细胞注射到
先天免疫缺陷的裸鼠皮下 ,得到包含三胚层细胞的
畸胎瘤 ,进一步证明它具有类似 ES细胞的发育
潜能。
这一研究成果于 2006年 8月发表后 ,立刻引起
了研究 iPS细胞的热潮。一年后 ,另一研究小组
W ernig等 [ 10 ]证明了 iPS细胞的实验可靠性 ,并与 Ya2
manaka研究小组 [ 11 ]同时发现 iPS细胞能够通过种系
传递 ,他们使用 Oct4或者 Nanog的内源性表达作为
筛选标志取代了最初的 Fbx15,得到的 iPS细胞在形
态学、基因表达状况和表观遗传修饰方面都与 ES细
胞十分相似。此外 ,这些 iPS细胞可以产生嵌合小
鼠 ,并能够嵌合到生殖系中。随后 ,另外两项研究相
继报道了利用形态学作为筛选标准来建立 iPS细胞
的方法 ,这一方法在建立人类 iPS细胞的研究中具有
潜在的优势 [ 12, 13 ]。
2007年 11月 ,两个研究小组同时宣布 ,人类体
细胞被成功诱导为多能干细胞。Takahashi等 [ 14 ]是
利用慢病毒载体携带他们在小鼠实验中使用过的 4
种因子 ,实现了人类皮肤成纤维细胞的重编程 ;而
Thom son的实验小组 [ 15 ]则独立从 14种 ES高表达
基因中筛选出 4种基因 O ct4, Sox2, N anog和 L in28 ,
转入胎儿和幼儿成纤维细胞后获得类 ES细胞。
随后 , Daley小组 [ 16 ]用实验手段排除了 iPS细
胞来自成纤维细胞中混有的极少量成体祖细胞的可
能。来自中国的邓宏魁等 [ 17 ]通过将多种因子联合
4个基本的转化基因 OCT4, SOX2, KL F4 和 c2M YC
诱导 iPS细胞 ,再经过一个筛选平台对多种因子进
行筛选 ,结果发现有 2种因子 p53 siRNA和 UTF1可
提高 iPS的转化效率达到 100倍。
目前 , iPS细胞的建立方法已经有了明显的改
善 ,并且其安全性也在不断的提高 ,很多研究更是成
功地将其应用于人类细胞的研究和疾病模型动物的
治疗 ,说明这一方法具有较高的可操作性和稳定性 ,
对将来的医学研究和临床应用极具价值。
2　 iPS细胞的构建
iPS细胞的建立主要包括 3个过程 :将几个重
要的多能性相关基因导入已分化细胞中 ;通过药物
或形态学特征对转染的细胞进行筛选 ;对 iPS细胞
进行鉴定 ,证明其具有多能性。
211　诱导因子
Oct24和 Sox2都是典型的多能干细胞特异转录
因子。Oct24只在未分化的胚胎干细胞 ( ES细胞 )、
胚胎癌细胞 ( EC细胞 )和胚胎生殖细胞 ( EG细胞 )
中表达 ,当这些细胞被诱导分化为体细胞时 , Oct24
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 9期
表达下降 [ 18 ] ,由此可见 , Oct24在动物胚胎发生中是
一个关键的调控因子 ,而且可能在维持细胞的全能
性及未分化状态中起着重要的作用。 Sox2的表达
则并不局限于多能性细胞 ,但其对早期胚胎发育和
抑制分化起着十分重要的作用。 Sox2在胚胎发育
过程中存在两个表达高峰 ,即囊胚内细胞团 ( ICM )
和神经干细胞时期 , Sox2在这两种细胞中的高表达
与维持该细胞的状态并抑制细胞分化密切相
关 [ 19, 20 ]。有研究表明 , Sox2基因敲除的小鼠能发育
至囊胚 (可能与母源蛋白的持续存在有关 ) ,但不能
形成上胚层 [ 21 ]。
c2M yc为卟啉 2原癌基因 ,它是 L if/STAT3和 W nt
信号通路的一个主要的下游基因 ,这两条信号通路对
于多能性的维持都很重要 ,其强制表达诱导 ES细胞
分化和凋亡 [ 22, 23 ]。C2M yc可以激活转录 ,调节包括细
胞分裂和增殖相关基因的表达 ,从而打开整个染色质
结构 ,此外还调节非编码 RNA的表达 [ 24, 25 ]。
Klf4既是原癌基因又是抑癌基因 ,它的过表达
可以维持 Oct4的表达 ,并抑制 ES细胞的分化 [ 26 ]。
Klf4的强制表达可以促进小鼠 ES细胞的自我更
新 ,而在体细胞的表达中强制表达可抑制 DNA的复
制 ,阻滞细胞周期处于 G1 /S期 [ 27 ]。因此 ,它在细胞
增殖和分化之间起开关作用。
ES细胞的基因组有着很高的可塑性 ,其染色质
结构比较开放 ,具有转录活性 ,而体细胞的基因组可
塑性比较差 , c2M yc可以诱导体细胞染色质结构发
生改变。因此可以合理推测 ,在重编程过程中 ,最初
由 c2M yc将关闭的染色质打开 ,以便其他因子结合
开放的染色质 , Klf4, Sox2和 O ct4等因子得以对靶
基因的转录进行调节 ,通过它们的相互作用诱导细
胞进入多能状态。
Thom son等的研究是通过 O ct4, Sox2, N anog和
L in28这 4个基因的组合导入来实现人类成纤维细
胞转变为 iPS细胞 ,说明 iPS细胞的产生可以通过
不同的因子组合来诱导。这 4个因子是否与 Ya2
manaka小组的 4个因子有着相似的作用方式还不
得而知 ,目前 ,人们对于转导因子诱导的重编程的机
理研究还刚刚开始。
212　iPS细胞的筛选
在导入相关基因之后 ,诱导的过程中 ,挑选可能
具有了多能性的细胞对于整个工作来说至关重要 ,
筛选的方式一直以来也是 iPS细胞研究的重点 ,表 1
列出了筛选方式的发展历程 ,并总结了各种方法的
特点。
表 1　筛选方式的发展历程和特点
研究小组 筛选方法 特点
Yamanaka
Fbx15 作为报告基因 , 产生对
G418的抗性
细胞集落具有 ES细胞的部分特征。然而 ,在基因表达模式和 DNA甲基化模式
上都与 ES细胞有所不同 ,且无法产生发育到期的嵌合小鼠
W ernig, Yamanaka
采用对多能性更为关键的 O ct4
或者 N anog作为报告基因
在各个方面都表现出与 Es细胞极为相似的特征 ,但导入报告基因的技术仍然比
较困难 ,且很难避免插入突变
Maherali 形态学标准 不对供体细胞做任何额外的遗传修饰 ,筛选效果出色
213　iPS细胞的鉴定
细胞的多能性具有两个基本特征 :强大的自我
更新能力和分化潜能。目前所建立的 iPS细胞都在
形态和生长特性方面与 ES细胞一致。人们也从细
胞标志分子的表达、表观遗传状态、基因表达模式和
发育潜能等方面对其进行了一系列的鉴定。
21311　表面标志分子的鉴定 　现在得到的克隆细
胞普遍具有高核质比和明显的核仁 ,这些都是 ES
细胞的典型特征 ,并且培养依赖性和增殖状态也都
很类似 ES细胞。流式细胞和免疫组化技术鉴定出
iPS细胞表达多能干细胞特异的表面标志 SSEA21、
SSEA23、SSEA24、TRA21260、TRA21281和 TRA222
49 /6E等 ,而这些蛋白在转染前的成纤维细胞并不
表达 ,此外 ,与多能性相关的端粒酶活性也由零点上
升到近似 ES细胞的高水平 [ 14, 15 ]。
21312　表观遗传状态的鉴定 　 iPS细胞与 ES细胞
具有相似的 DNA甲基化模式。 iPS细胞重编程后 ,
N anog、O ct24和 R ex1等重要多能基因的启动子区
CpG岛从高甲基化转变为类似 ES细胞的低甲基化
状态 ,表明这些启动子处于转录活性状态 [ 11, 14 ]。
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iPS细胞的组蛋白修饰也发生了相应的改变 ,
通常 H3K4三甲基化促进转录 ,而 H3k27三甲基化
抑制转录。人 iPS细胞组蛋白 CH IP (染色质免疫共
沉淀 )分析证实了 iPS细胞的 O ct24、Sox2、N anog和
Gata6等多能基因的启动子区域具有高 H3K4三甲
基化和低 H3K27三甲基化水平 ,与 ES细胞一致而
与转染前细胞有较大差异 [ 14 ]。
21313　基因表达模式和发育潜能 　目前得到的 iPS
细胞的基因表达谱与 ES细胞的基因表达谱基本上
类似 ,只有少部分基因的表达不同。Maherali等 [ 28 ]
发现 ,在 iPS细胞发生分化的同时 ,一条 X染色体也
发生了随机的失活。小鼠、人胚胎和成体来源的
iPS细胞注射到裸鼠皮下 ,均可以获得包含三胚层
细胞的畸胎瘤 ,而且 iPS细胞不仅有发育成 3个胚
层的能力 ,并能参与生殖系的发育 ,这些都与正常的
ES细胞相同。
3　 iPS细胞的应用价值和发展方向
311　应用价值
iPS细胞这一极富创新性的研究具有重大的理
论意义和实用价值 ,而且从根本上解决了干细胞研
究一直以来存在着的伦理问题 ,在生物基础研究领
域和生物医学领域都有着巨大的推动作用。
在基础研究方面 , iPS细胞为研究细胞重编程
提供了一个全新的视角 ,让人们对多能性的调控机
制有了突破性的认识 ,而且它还为发育生物学、基因
与蛋白质功能分析等领域提供了重要的模型。获得
iPS细胞的方法相对简单和稳定 ,在技术上更具有
优势。最近的研究中 , Jeong Beom Kim等 [ 29 ]更是成
功的只利用 Oct4这一种转录因子就能完成了细胞
的重编程 ,更少的诱导因子也就意味着更少的遗传
操作和更高的安全性。
在生物医学方面 , iPS细胞也具有广阔的应用
前景。利用 iPS细胞可以产生个体特异性的多能干
细胞 ,移植用于治疗遗传和退行性疾病 ,可以最大限
度地避免免疫排斥。Hanna等 [ 30 ]用镰刀型贫血症
小鼠的皮肤成纤维细胞建立了 iPS细胞 ,通过对 iPS
细胞的改造和分化得到了具有正常功能的造血前体
细胞 ,移植到患有镰刀型贫血症的小鼠体内 ,极大的
改善了小鼠的症状。而利用 iPS细胞产生病症特异
的多能干细胞 ,可用于研究组织功能和疾病机理 ,也
为新药的开发提供了理想的模型。Thom son研究小
组 [ 31 ]将一位患有脊髓性肌萎缩症 ( SMA )儿童的皮
肤成纤维细胞诱导成为 iPS细胞 ,并利用这些 iPS
细胞培育出包含导致 SMA疾病遗传缺陷的运动神
经细胞 ,在试管内成功再现了神经细胞因疾病死亡
的过程 ,这是首次使用患者 iPS细胞重现病症的成
功尝试。目前 ,虽然将这种方法安全地用于临床仍
然还有重大的障碍需要克服 ,但它确是研究疾病发
生机理和研发药物的重要工具。
312　发展方向
在 iPS细胞的应用前景被广泛看好的同时 ,其
产生的具体机制却始终没有确定 ,这是制约其继续
发展和临床应用的一个障碍 ,是人们下一步亟待解
决的问题。关于各种诱导因子在细胞重编程过程中
所起的作用、起作用的时间顺序以及它们之间的协
调关系等问题都还没有得到确切的答案 ,人们希望
可以通过对这些问题的探索和继续的尝试以获得更
高效、更安全的转导因子或者因子组合。
关于导入方法的研究一直是此领域的热点 ,传
统的逆转录病毒导入方法有着很明显的弊端 :可能
会导致一些癌基因被激活 ,也可能导致某些重要基
因功能受阻。目前 ,已经出现了各种替代方法 ,例
如 , Yamanaka研究小组 [ 32 ]使用两个质粒完成了对
iPS细胞的诱导。通过探索 ,人们渴望能得到更加
便捷与安全的导入方法 ,这将有助于 iPS细胞技术
的普及和应用。
目前 ,研究人员获得 iPS细胞的效率依然不高 ,
这可能与转录因子、筛选方法以及细胞来源等多种
因素有关。虽然从实际的角度考虑 ,只要能得到稳
定的 iPS细胞系对于很多研究来说已经足够了 ,而
且与 ES细胞的建立和核移植等方法相比 , iPS细胞
的获得效率相对较高 ,但是人们还是希望通过探索
找到进一步提高转化率的方法 ,以利于研究的深入
和普及。
现阶段 iPS细胞的研究热潮有取代传统干细胞
研究的趋势 ,但继续研究传统的干细胞还是有必要
的 ,传统的胚胎干细胞是人们理解、分析 iPS以及研
究其疗效的标准。从 iPS细胞上人们看到了它为人
类疾病治疗所带来的希望和契机 ,然而由于还没有
完全揭示 iPS细胞的产生机理 ,技术手段上还存在
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 9期
着很多的问题 ,使得这一新技术对于临床应用还有
很长的距离 ,对这些问题的研究和探索 ,将进一步加
深人们对重编程和多能性调节机理的认识 ,也将对
其今后的临床应用提供基础。
4　结语
iPS细胞自诞生以来 ,在短短的 3年时间里 ,得
到了飞速的发展 ,这得益于对过去大量知识的积累
和运用 ,更在于观念和方法上的大胆创新 ,这种创新
的意识正是激励人类科学前进的动力。目前 ,许多
基于 iPS细胞的理论思想但又有所突破的技术也越
来越多的出现 ,例如 , Zhou等 [ 33 ]就利用患糖尿病的
小鼠外分泌胰腺细胞 ,通过 3种因子 Ngn3, Pdx1和
Mafa的组合使其重编程成为能够产生胰岛素的内
分泌细胞 ,这是细胞从一种分化状态直接进入另一
种分化状态 ,而中间不需要经历干细胞阶段的成功
探索。今后 , iPS细胞的研究会成为生命科学领域
的一个重要方向 ,随着技术的不断进步 ,相信 iPS细
胞研究的进展会比人们想象中更为迅速。
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