全 文 ：综述与专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 10期
诱导多能干细胞最新进展
胡敏华 郭欣政 张守全
(华南农业大学,广州 510642)
摘 要: 通过导入特定基因诱导完全分化的体细胞重编程为诱导多能干细胞 ( iPS), 这为干细胞的研究及应用带来了
革命性的变化。短短 3年时间, 细胞重编程的机理研究、探索疾病的发生机制以及临床医学的应用等领域取得了很多突破性
的进展, 主要从 iPS诱导机理、效率以及诱导新技术上作一综述, 以期对 iPS的研究提供参考。
关键词: 体细胞 重编程 多能干细胞 机理
Research Progress of Inducing P luripotent Stem Cells
HuM inhua Guo X inzheng Zhang Shouquan
( South China Agricultural University, Guangzhou 510642)
Abstrac:t The strategy tha t use transduction o f defined transcriptiona l factors into som a tic cells to induce reprog ramm ing bring the
evo lutiona l prog ress for the stem cells research. Just three year past, w e m ake large breakthrough in the area of the m echan ism of stem
ce lls reprogramm ing, d isease occurrence and application in c linicalm edic ine. Th is article summ ar ize from them echan ism, efficiency and
the new techno logy o f induc ing reprogramm ing, to prov ide the reference fo r the research of induc ing p lur ipo tent stem cells( iPS).
Key words: Som atic cells Reprogramm e P lur ipo ten t stem ce lls M echanism
收稿日期: 20100608
作者简介:胡敏华,男,博士研究生,研究方向:动物繁殖技术; Em ai:l myem ailcony@ 163. com
通讯作者:张守全,男,教授,博士,研究方向:动物繁殖技术; Em ai:l sqzh ang@ scau. edu. cn
1 细胞重编程技术
细胞重编程 ( reprogramm ing )是指在特定条件
下将完全分化的细胞逆转成为具有与胚胎干 ( em
bryon ic stem, ES)细胞类似特点的多能性干细胞。
体细胞核移植技术 ( som atic cell nuclear trans
fer, SCNT)是研究较早的体细胞重编程技术,它是将
体细胞核移入去核卵母细胞中,经过培养,核移植后
的细胞会经历一个重编程的过程, 逆转到全能的状
态。但是,该技术试验要求高, 技术繁琐, 而且胚胎
来源的限制以及涉及到伦理问题, 严重阻碍了其
发展。
细胞融合技术 ( cellular fusion) , 将体细胞与胚
胎癌细胞 [ 1]、胚胎生殖细胞、ES细胞融合 [ 2] ,也可以
发生重编程,但此技术会导致基因组的不稳定性,而
且很难获得正常的二倍体重组细胞, 其融合率低,移
植后亦会发生排斥。
转录因子诱导技术是由 Yam anaka等 [ 3] 于
2006年用逆转录病毒载体在小鼠成纤维细胞中表
达 O ct3 /4、Sox2、K lf4和 cM yc等转录因子, 成功获
得了具有 ES细胞特性的诱导多能干细胞 ( in
duced pluripotent stem cel,l iPS cell) , 取得了细胞重
编程研究中重大的突破。 2007年底 Y amanaka
等 [ 4 ]用相同的基因, Thomson等 [ 5 ] 用 Nanog和
L in28替代 K lf4和 cMyc基因均成功获得了人成
纤维细胞来源 iPS细胞。自人和老鼠成纤维细胞
成功被重编程以后, 科学家们亦对其它供体细胞
进行了重编程研究。至今小鼠 B淋巴细胞 [ 6]、小
鼠脑膜细胞 [ 7]、小鼠纤维原细胞和肝脏细胞 [ 8 ]、成
熟恒河猴成纤维细胞 [ 9]、小鼠神经干细胞 [ 10]、人
包皮细胞 [ 11]、大鼠体细胞 [ 12]、脐带血 [ 13 ]细胞都能
够重编程为 iPS细胞, 且 Zhou等 [ 14 ]利用重编程技
术实现不同种成体细胞间直接转化。通过基因工
程操作, 用腺病毒载体导入 Ngn3、Pdx1和 M afa, 使
患糖尿病的小鼠的胰腺内大约 20%的外分泌细胞
重编程成胰岛 细胞。随后, M ichae l[ 15 ]用老鼠胚
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 10期
胎成纤维细胞重编程而来的 iPS,诱导成具有生育
能力的成熟老鼠。Lan[ 16 ]利用 4个转录因子 O ct4、
Sox2、K lf4、cMyc重编程而来的 iPS细胞系, 通过
四倍体补偿技术能够产生足月小鼠, 证明了 iPS的
全能性。
细胞重编程这一非克隆干细胞技术的诞生,成
功地避开了长期以来争论不休的伦理问题, 极大地
推动该领域和相关科学领域的发展。但目前仍有几
大问题阻碍着 iPS细胞应用于临床: ( 1) Yamanaka
方法中的 cMyc基因本身就是癌基因, 外源 cMyc
在细胞中的表达可能导致肿瘤生成; ( 2)逆转录病
毒或慢病毒载体感染细胞会将外源基因序列随机整
合到基因组, 可能导致插入突变 ( insert ional muta
genesis); ( 3)诱导效率非常低,不管是采用 Yamanaka
或 Thomson的方法, 诱导效率均低于 001%,且在诱
导 30 d左右才有克隆出现。低效率成为进行大规模
iPS细胞分子机理研究的主要障碍,如何解决这些缺
陷是当前研究热点。
2 iPS诱导因子
2. 1 O ct3 /4
O ct3 /4又称 Pou5f1, 属于 Oct蛋白家族, 含有
POU结构域一个 150个氨基酸残基的序列。Oct3 /4
参与多种基因的调节,在胚胎癌细胞、早期胚胎和生
殖细胞中特异性地表达, 是维持细胞自我更新和多
能性的关键因子。
2. 2 Sox2
Sox家族是一类 SRY ( sexdeterm ination reg ion
of Y chromosome, SRY )相关基因构成的基因家族,
编码一系列 Sox( SRYre latedHMG box)家族的转录
因子, 参与胚胎发育的调控。 Sox基因家族是进化
过程中高度保守的一类基因,参与胚胎发育的转录
调控, 对多种组织器官的发育具有重要的作用。Sox
家族中的 Sox2最早被发现就是在 EC细胞中被鉴定
出来的。研究结果显示, Sox2在早期胚胎发生、神
经分化和晶状体发育等多种重要的发育事件中都起
着关键的作用, 从而引起了广泛的关注。在干细胞
中,它与 O ct4形成蛋白复合体, 共同调控 FGF3、
UTF1等生长因子的表达, 被认为是保持 Oct4表达
的关键因素。
2. 3 cM yc
cM yc基因是继 p53基因之后最受关注的原癌
基因之一, cMyc属于 HLH 蛋白家族,还有一个 n
Myc成员。 cM yc的 N端可以与 TRRAP、T IP48相
作用,影响组蛋白乙酰化酶、ATP酶的作用, 而 C端
含有螺旋 (HLH )及亮氨酸拉链结构域, 在与 Max蛋
白形成稳定的复合物后与 DNA序列 ( CACA /GTG )
相结合,调节基因的表达。
2. 4 K lf4
K lf4属于 K ruppe llike facto rs( K lfs)家族的一
员, 在小鼠 ES与有丝分裂后期的皮肤和胃肠上皮
细胞中高表达。K lf4的过表达导致 Oct3 /4表达的
维持和 ESC s分化的抑制。K lf4也可以通过抑制
p53的表达而间接上调 N anog的表达, 通过抑制
p53,阻止由 c Myc引起的细胞凋亡。
科学家们对重编程所需转录因子进行了相关研
究。Robert等 [ 17]通过用 nmyc取代 cMyc, 成功将
成纤维细胞重编程为 iPS细胞, 尽管 iPS细胞稳定
性较差, 但这表明 cMyc并不是重编程所必须。
Jeong等 [ 18]研究发现 仅仅两个因子 ( O ct4加上 K lf4
或 cM yc) ,就足以从成年小鼠神经干细胞生成 iPS
细胞。随后, Jeong[ 19 ]通过进一步研究表明, 利用反
转录病毒载体, 单个基因 Oct4或双因子 O ct4与
K lf4就可诱导出 iPS细胞, 获得的 iPS细胞在体外可
再培养成神经干细胞, 或者变成心肌细胞和生殖细
胞。而在神经祖细胞 ( neural progenitor cells, NPCs),
由于它表达 Sox2,因此通过病毒转导 Oct3 /4或 K lf4,
就可以重编程为 iPS细胞, 而且发现 G9a组蛋白甲
基转移酶的抑制剂 BIX01294( B IX ),能够提高其重
编程效率 [ 20]。
3 iPS诱导效率
影响重编程效率的原因可能包括以下方面。
( 1)感染效率: 只有当至少 3种基因载体同时感染
的细胞才有可能实现细胞重编程, 而只有很少一部
分细胞能够同时获得 3种以上外源基因; ( 2 )外源
基因表达沉默时机:外源基因表达沉默过早,无法完
成对细胞的重编程,沉默过晚则可能引起细胞再分
化或转化停滞不前。体细胞只有同时被至少 3 - 4
个外源基因载体感染,且能精确掌握由外源基因调
控转化为内源基因调控时机, 才能最终实现由完全
16
2010年第 10期 胡敏华等:诱导多能干细胞最新进展
分化的体细胞到 iPS细胞的转变。显然, 能同时满
足这两方面条件的细胞少之又少, 这也是 iPS细胞
诱导效率低下的主要原因。
Y ang等 [ 21]报道 p53 siRNA和 UTF1这两种因
子可提高人成纤维细胞转化成 iPS的效率。Marson
等 [ 22]在没有 cMyc逆转录病毒的情况下, W nt家族
成员Wnt3a可促进 iPS的诱导进程,这表明信号转导
途径和转录因子也能相互作用来重编程分化的细胞
成为 iPS细胞。Yosh ino ri等 [ 23]发现, 在低氧条件下
( 5% ),能够提高小鼠以及人类细胞的重编程效率。
L in等 [ 24] 利用 ALK5与 MEK的抑制剂 ( SB431542
与 PD0325901), 可提高人成纤维细胞诱导成 iPS细
胞的效率 ( > 200倍 )。目的细胞不同分化阶段对重
编程为 iPS细胞的效率有重要影响。造血细胞与祖
细胞重编程为 iPS的效率比 B和 T细胞重编程效率
要高 300倍,效率达到 28% [ 25]。 Esteban等 [ 26]发现
维生素 C可以增强无论是人或者老鼠体细胞的诱
导效率,虽然现在 iPS诱导效率上相对而言有了很
大改进,但是总的重编程效率始终偏低,如何使其诱
导效率得到质的飞跃仍需科学家们进行一系列基础
研究。
4 iPS诱导新技术
前期的 iPS细胞研究中普遍使用逆转录病毒作
为载体转染细胞,这种方法会导致载体序列及外源
因子序列永久地整合入细胞的基因组中, 引起插入
突变以致干扰正常的 iPS细胞系的功能,而细胞中
残余外源因子序列的表达会影响其分化, 甚至导致
肿瘤的发生。这种方法的缺陷严重限制了 iPS细胞
在基础和临床研究中的应用。找到能不扰乱原有细
胞基因组的诱导方法成为该研究领域迫切需要解决
的问题。
腺病毒载体法是最有前途的转基因方法之一,
具有许多优点:宿主范围广、对人致病性低、能转染
增殖和非增殖细胞、能有效进行扩增、与人类基因同
源、不整合到染色体中、能同时表达多个基因等。因
而腺病毒被极其广泛地应用于体外基因转导、体内
接种疫苗和基因治疗等各个领域。M atth ias [ 27 ]采用
非整合性载体 腺病毒载体, 转染的基因分别为
O ct4, Sox2, K lf4,与 cMyc, 可使小鼠纤维原细胞和
肝脏细胞转变为 iPS细胞, 使用腺病毒载体诱导的
成功率太低。N ime t[ 28]和 D irk等 [ 29]只用药物 慢病
毒系统就能产生 iPS细胞, 制备的 iPS从结构和功
能上都与人类 ES细胞很相似。这种方法的独特之
处是用多西环素 ( doxycycline )来控制转录因子的
表达。
虽然病毒载体法有诸多优点,但其潜在的危害
不能忽视,开发非病毒载体技术是未来趋势。K ei
suke
[ 30]采用质粒载体, 一个质粒携带 cM yc; 另一
个携带 Oct3 /4、K lf4和 Sox2, 同时转入小鼠胚胎成
纤维细胞, 可将之转化成 iPS细胞。而培养的 iPS
细胞与以往的 iPS细胞一样能分化生成表皮、横纹
肌和神经组织等多种细胞, 但转化效率比用逆转录
酶病毒为载体要低一些。同样, Yu等 [ 31]用质粒系
统将人包皮细胞重新编程为 iPS细胞。
Ka ji和 Woltjen [ 32, 33]采用转座子进行转导, 获
得了无病毒载体和转基因的 iPS细胞。其中细胞来
源为人类胎儿的纤维母细胞;基因包括 cMyc, K lf4,
Oct4和 Sox2; 载体为 p iggyB ac转座子;其优点是提
高了安全性,不易使基因癌化,且能通过转座子的切
除获得无载体和转基因的 iPS细胞。
利用细胞重组因子 ( Oct4, Sox2, K lf4, and c
Myc)与细胞穿透肽 ( cellpenetrat ing peptide, CPP)融
合,诱导人成纤维细胞。蛋白诱导技术是目前惟一
完全避开基因操作的 iPS技术, 避免了用病毒作为
载体、DNA感染与潜在有害化学药物的风险。尽管
蛋白诱导技术十分的优越,但也存在一定的问题,例
如, 成本高、蛋白稳定性差 [ 34]。 Jia[ 35]将重编程基因
Oct4, Sox2, L in28, N anog和 GFP标记基因导入 DNA
微环 ( m in icircles), 成功对脂肪干细胞进行重编程。
这种微环不携带细菌 DNA, 即进入细胞的外源基因
更少,且微环基因的表达更好,此外, 由于微环遗失
了细胞分裂的相关基因, 使得本身不能复制从而保
证其稳定性。
5 iPS诱导机理的研究
DNA甲基化是最早发现的修饰途径之一, 大量
研究表明, DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构
象、DNA稳定性及 DNA与蛋白质相互作用方式的
改变,从而控制基因表达。在甲基转移酶的催化下,
DNA的 CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲
基,形成 5甲基胞嘧啶,这常见于基因的 5!CG3!序
17
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 10期
列。大多数脊椎动物基因组 DNA都有少量的甲基
化胞嘧啶, 主要集中在基因 5!端的非编码区, 并成
簇存在。甲基化位点可随 DNA的复制而遗传, 因为
DNA复制后,甲基化酶可将新合成的未甲基化的位
点进行甲基化。DNA的甲基化可引起基因的失活。
要让体细胞重新恢复到未分化的状态需要解决的一
个问题就是 DNA甲基化的问题, 所以 DNA去甲基
化问题成为诱导 iPS的一个重要难题。
为了研究 iPS诱导过程中的相关机制, He len[ 36]
构建了一个异核体细胞 (融合了小鼠 ES细胞和人
类成纤维细胞 ) , 这种异核体诱导的速度比正常的
体细胞诱导速度快很多,仅需 1 d时间, 诱导效率高
达 70%。小干扰 RNA介导的敲除技术表明活化诱
导胞嘧啶核苷脱氨酶 ( activat ioninduced cytidine de
am inase, A ID )在 启动子去甲基化与 O ct4和 Nanog
基因的诱导表达中是必需的。A ID蛋白在成纤维细
胞中与沉默并甲基化的 O ct4和 N anog启动子相结
合,诱导其表达, 但是在 ES细胞中却并不激活启动
子甲基化。这些试验数据表明, 诱导哺乳动物 iPS
需要 A ID蛋白参与启动细胞的 DNA脱甲基化, 并
启动细胞核重新编程过程。
随着有机体生命的延长,其端粒会缩短,研究表
明,从端粒酶缺乏的老鼠身上取得的细胞在诱导成
iPS过程中, 其效率显著降低, 当再引入端粒酶时,
效率回升,表明了端粒生物学在 iPS诱导及其功能
性上的重要性 [ 37]。Tob ias [ 38]通过多西霉素诱导慢
病毒载体,重编程老鼠胚胎成纤维细胞成 iPS细胞
过程中发现, 转基因沉默是细胞分化的前提条件。
通过分析 iPS产生过程中已知多能性标记激活的时
间,发现碱性磷酸酶 ( alka line phosphatase, AP)最先
被激活, 然后是 SSEA1, 而 Nanog及内源 Oct4基因
的表达,却是在重编程的后期才能检测到。重要的
是,病毒转导的 cDNA必须最少表达 12 d,才能获得
iPS细胞。
Han等 [ 39]发现转录因子 Tbx3能极大地增强
iPS细胞的质量, 这对于重新编程干细胞技术而言
具有重要的意义。Tbx3基因是 Tbox ( Tbx)基因家
族的成员之一,这一家族属于发育调控相关转录因
子基因家族,表达产物作为真核生物的转录调控因
子,有 20多个成员, 其共同特征是编码具有高度保
守的 N末端 DNA结合区 ( T区 )的转录因子, 广泛
存在于多细胞生物,具有重要的发育调控功能,在脊
椎和非脊椎动物胚胎的形态和组织发生中发挥着重
要作用。
6 iPS临床应用研究
自从 iPS成功诱导以后, 科学家们对其在临床
医学上的应用迅速展开研究。利用 iPS细胞可以产
生个体特异性的多能干细胞, 移植用于治疗遗传和
退行性疾病, 可以最大限度地避免免疫排斥。Han
na等 [ 40]用镰刀型贫血症小鼠的皮肤成纤维细胞建
立了 iPS细胞, 通过对 iPS细胞的改造和分化得到
了具有正常功能的造血前体细胞, 移植到患有镰刀
型贫血症的小鼠体内, 极大地改善了小鼠的症状。
由 Park等 [ 41]从患有孟德尔或综合遗传病人身上取
组织细胞诱导成 iPS, 这种疾病特异性干细胞提供
了一个史无前例的机会去阐述体外人正常或者病变
组织的形成,促进了对疾病机理的探讨以及药物的
开发利用。随后 Ange l等 [ 42 ]发现, 来自范康尼贫血
( Fanconi anaem ia)患者的 ∀ iPS细胞 #在纠正了基因
缺陷之后,可被重新编程,而产生具有患者特异性的
∀ iPS细胞#,它们能产生属于骨髓细胞系和类红细
胞系的不含疾病的造血祖细胞。这些细胞对于细胞
疗法有潜在价值。重症神经疾病脊椎肌肉萎缩症
( sp inalmuscular atrophy, SMA)患者的皮肤细胞重编
程为 iPS细胞, 然后将这些 iPS细胞培育为神经细
胞后,在试管内成功再现了神经细胞因疾病死亡的
过程。用 iPS细胞可无限度繁殖病变细胞用于研
究, 意义实属非凡 [ 43]。
从 iPS细胞上人们看到了它为人类疾病治疗所
带来的希望和契机, 然而由于还没有完全揭示 iPS
细胞的产生机理,技术手段上还存在着很多的问题,
使得这一新技术对于临床应用还有很长的距离, 对
这些问题的研究和探索, 将进一步加深人们对重编
程和多能性调节机理的认识, 也将对其今后的临床
应用提供基础。
7 结语
iPS细胞的获得成功逆转了细胞单向发育的规
则, 成为生物医学发展史上的里程碑。 iPS细胞由
成熟分化的体细胞诱导而来, 突破了长期困扰 ES
细胞研究的伦理问题; 有效避免了免疫排斥反应。
18
2010年第 10期 胡敏华等:诱导多能干细胞最新进展
在短短 3年的时间里, iPS诱导的机理、效率等各个
方面对这项技术不断地改进和完善, 并且取得令人
瞩目的成就,但现阶段 iPS细胞的低诱导率是阻碍
其应用的一大难题, 研究人员还需探索既能大幅提
高诱导成功率又有安全可靠性的新方法。今后 iPS
的研究必将成为生命医学领域的一个重要研究方
向,从而为生物医学界开辟辉煌的天地。
参 考 文 献
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