全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 2期
拟南芥转录因子 CBF1和 CBF4基因的克隆与序列分析
徐春波 1 王勇 2 杨志如 3 赵海霞1 李兴酉 1
( 1中国农业科学院草原研究所,呼和浩特 010010; 2内蒙古农业大学生态环境学院,呼和浩特 010018;
3内蒙古鄂尔多斯市水利勘测设计院,东胜 017000)
摘 要: 利用聚合酶链式反应技术 ( PCR )从拟南芥 ( A rab idop sis tha liana )植株中扩增出 CBF1和 CBF4基因,并将其连接
到 pGEMT vector载体上。 PCR和酶切鉴定后进行基因测序,结果表明所克隆的 CBF1和 CBF4基因序列与 GenBank中基因序
列同源性分别可达 9984%和 99 41% ,说明这两个片段确为拟南芥 CBF1和 CBF4基因。
关键词: CBF1 CBF4 拟南芥 PCR 克隆
Cloning and Sequences Analysis of Transcription Factor CBF1 and
CBF4 Gene inArabidopsis thaliana
Xu Chunbo
1
W ang Yong
2
Yang Zhiru
3
ZhaoH aix ia
1
L iX ingyou
1
(
1
Grassland Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences,H uhhot 010010;
2
Co llege of Ecology and Environm ent InnerM ongolia Agricultural University,H uhhot 010018;
3
Water Conservancy Survey and D esign Institute in ErdosCity, D ongsheng 017000)
Abstrac:t CBF1 and CBF4 genes w ere obta ined by PCR technique from the p lants o fA rabidop sis tha liana and then connected
those into the pGEMT vector. PCR, Restr iction enzym e digestion and Sequenc ing resu lts showed that the cloned gene sequences of
CBF1 and CBF4 have h igh ly hom o logous w ith GenBank, reached 9984% , 9941% RespectivelyThus, the tw o fragm ents w ere proved
as CBF1 and CBF4 gene fragm ents
Key words: CBF1 CBF4 A rabidop sis thaliana PCR C lone
收稿日期: 20091102
基金项目:中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助项目 ( 2006101)
作者简介:徐春波,女,硕士,主要从事牧草种质资源、遗传育种与生物技术研究; Em ai:l xcb972002@ 163. com
低温、干旱等逆境条件不仅限制苜蓿种植的区
域,而且会导致产量的重大损失, 因此, 培育耐逆性
强的苜蓿新品种对草地畜牧业和苜蓿产业化快速发
展具有重要意义。
植物的耐逆性属于复杂的数量性状,是多种耐逆
机制共同作用的结果。用单一的功能基因转化植物,
虽能使转基因后代的耐冷性、耐旱性或耐盐性得到提
高,但效果并不十分理想。CBF转录激活因子的发现
则为基因工程改良植物耐逆性提供了一种全新的技
术途径 [ 1]。CBF转录激活因子是一类受低温特异诱
导的反式作用因子 [ 2- 4]。它们能与 CRT /DREDNA
( Crepeat /dehydrationresponsive element( DRE ) DNA
binding protein)调控元件特异结合,促进启动子中含
有这一调控元件的多个冷诱导和脱水诱导基因的表
达,从而激活植物体内的多种耐逆机制 [ 5]。目前,国
内外均已开展这方面的转基因研究 [ 6 - 9]。
本研究利用 PCR技术从拟南芥植株中成功克
隆了 CBF转录激活因子中的 CBF1和 CBF4基因,
为下一步克隆苜蓿 CBF转录激活因子和利用这两
个基因改良苜蓿抗逆性快速培育耐逆性强的苜蓿新
品种奠定基础。
1 材料与方法
11 材料
111 供试材料 拟南芥由北京市农林科学院北
京农业生物技术研究中心提供,为哥伦比亚生态型。
112 菌株及载体 大肠杆菌 (E. co li ) DH5由北
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 2期
京市农林科学院北京农业生物技术研究中心园林实
验室保存; 载体 pGEM T vector载体购自上海生物
工程有限公司。
113 供试试剂 各种限制性内切酶, RN ase A、
Taq酶、dNTP、T4连接酶等购自 TaK aRa公司; 质粒
试小提试剂盒、T 载体连接试剂盒等购自 Prom ega
公司; M arker购自 TaKaRa公司; 其它试剂均为国产
分析纯产品。
12 方法
121 拟南芥基因组 DNA的提取 取拟南芥叶片
2 g,用 CTAB法 [ 10 ]提取拟南芥叶片总 DNA。
122 引物设计 根据 NCB IGenBank已报道的拟
南芥 CBF1和 CBF4基因的 DNA序列, 分别设计了
CBF1基因和 CBF4基因的各两对引物。引物合成
由北京奥科生物技术有限责任公司完成。
表 1 引物序列
引物名称 序列 ( 5 3 )
F1基因
引物对 1 CBF1BamH I TCTGGGATCC ATGAACTCAT TTTCAG
CBF1Sac1 TCTGGAGCTC TTAGTAACTC CAAAGCG
引物对 2 CBF1B amH I TGGATCC ATGAACTCAT TTTCAG
CBF1Sac1 TGAGCTC TTAGTAACTC CAAAGCG
CBF4基因
引物对 3 CBF4B amH I GTCCGGATCCATGAATCCATTT
CBF4Sac1 CGTGAGCTCTTACTCGTCAAAACTC
引物对 4 CBF4B amH I TGGATCCATGAATCCATTT
CBF4Sac1 TGAGCTCTTACTCGTCAAAACTC
123 PCR体系 PCR反应体系 20 L: 10 ! PCR
buffer 2 L, dNTP 04 L,引物各 05 L,模板 DNA 1
L, Taq酶 05 L, ddH2O补至 20 L。 CBF1基因
PCR反应条件: 95∀ 预变性 5m in, 94∀ 变性 30s、55∀
退火 30 s、72∀ 延伸 1 m in, 35个循环, 72∀ 延伸 10
m in; 4∀ 保存。CBF4基因 PCR反应条件: 95∀ 预变
性 5m in, 94∀ 变性 30 s、60∀ 退火 30 s、72∀ 延伸 1
m in, 1个循环, 94∀ 变性 30 s、55∀ 退火 30 s、72∀ 延
伸 1m in, 34个循环, 72∀ 延伸 10 m in; 4∀ 保存。
124 PCR产物与 pGEM T vector载体的连接 连接
体系 10 L: 2 ! buffer 5 L, pGEM T vector 05 L, PCR
产物 4 L, T4DNA连接酶 05 L。16∀ 保温 14- 16 h。
125 重组子的筛选及鉴定 将连接产物转化大肠
杆菌 DH5感受态细胞,在含有 Amp、IPTG和 XG al
的 LB固体平板上筛选白色菌落,对重组子进行 PCR
和酶切检测鉴定后,送交北京奥科生物技术有限责任
公司进行测序,序列同源性由 DNAMAN软件完成。
2 结果与分析
21 引物筛选
经过 PCR反应分别对 CBF1、CBF4基因的两对
特异引物进行筛选,引物对 1和引物对 3能扩增出
相应的目的片段,表明这两对引物特异性强,可用于
下一步的试验。
22 CBF1基因的克隆及鉴定
以拟南芥 DNA为模板,用筛选出的特异引物对
1进行 PCR扩增,得到 650 bp左右的 DNA片段 (图
1),与预期结果相符。提取其质粒进一步进行酶切
鉴定后,得到 3 000 bp和 650 bp左右的两条 DNA
片段 (图 2) ,与预期结果一致。将其送交北京奥科
生物技术有限责任公司进行测序验证。
1. m ak er; 2. PCR扩增产物 CBF1
图 1 CBF1基因片段的 PCR扩增
1. m arker; 2. BamH#和 Sac#
双酶切产物
图 2 酶切鉴定
23 CBF1基因序列分析
测序结果表明所克隆的 CBF1基因 DNA片段
长度为 642 bp,将该序列与 G enB ank上拟南芥 CBF1
基因序列进行 DANMAN序列比较分析,同源性可达
9984% (图 3) ,在 461 bp的碱基 A置换成 T,碱基
的置换导致了一处氨基酸的差异, 但这一氨基酸并
不在基因的功能结构域上, 推测其不会影响基因功
能。核苷酸比较结果表明本试验通过 PCR克隆的
CBF1片段确为拟南芥的 CBF1基因,具有正常的生
理功能,可用于遗传转化研究。
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2010年第 2期 徐春波等 :拟南芥转录因子 CBF1和 CBF4基因的克隆与序列分析
上排为拟南芥 CBF1 cDNA;下排为 PCR扩增产物 CBF1
图 3 CBF1基因序列比对图 (同源性 9984% )
24 CBF4基因的克隆及鉴定
用特异引物对 3进行 PCR扩增, 得到约 700
bp,特异性强,单一的 DNA片段 (图 4), 结果与预期
相符。经酶切鉴定,得到 3 000 bp和 700 bp左右的
两条 DNA片段 (图 5), 其片段大小与预期结果一
致。将其送交北京奥科生物技术有限责任公司进行
测序验证。
1, 2. PCR扩增产物; 3. 对照 4 m aker
图 4 CBF4基因片段的 PCR扩增
1. B amH#和 Sac#双酶切条带; 2. m ak er
图 5 酶切鉴定
25 CBF4基因的序列分析
测序结果表明所克隆的 CBF4基因 DNA片段
长度为 675 bp, 图 6为所分离的 CBF4基因编码序
列与已注册序列的比较结果, 可以看出本实验获得
的 CBF4的核苷酸序列与已发表 CBF4的核苷酸序
列同源性达 9941% , 482 bp的 T置换成 G, 486 bp
的 G置换成 A, 488 bp的 A置换成 G, 493 bp的 G
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 2期
置换成 A, 碱基的置换导致了氨基酸的差异,但这些
氨基酸并不在基因的功能结构域上, 推测其不会影
响基因功能。这就证明本试验克隆的 CBF4片段确
为拟南芥的 CBF4基因,其起点为起始密码子 ATG,
终点为终止密码子 TAA, 是一完整的蛋白编码序
列, 可用于今后研究。
上排为拟南芥 CBF4 cDNA;下排为 PCR扩增产物 CBF4
图 6 CBF4基因序列比对图 (同源性 99. 41% )
5 讨论与结论
拟南芥 CBF 基因包括 CBF1、CBF2、CBF3、
CBF4、CBF5、CBF6,其成员在抗寒、抗旱及抗盐碱方
面起着很大的作用 [ 11 - 13]。 1997年 Stockinger利用
COR15ACOR78 /RD29A基因启动子的 CRT /DRE顺
式作用元件和酵母单杂交的方法, 从拟南芥中首次
克隆 CBF1[ 14]。后又陆续分离了 CBF2、CBF3[ 11 ]。
2002年 H aake[ 12] 在研究拟南芥抗旱时克隆了
CBF4。拟南芥基因组测序完成后, 经序列同源性比
较又发现了两个基因编码新的 CBF转录因子, 从而
克隆了 CBF5、CBF6[ 13]。低温诱导表达的拟南芥
CBF1、CBF2、CBF3基因不依赖 ABA, 而 CBF4基因
是干旱诱导表达和依赖 ABA的 [ 12] , CBF5、CBF6基
因不受低温调控 [ 15]。虽然 CBF基因在拟南芥发
现, 但研究结果证明, CBF冷反应途径的组成因子
在开花植物中高度保守, 而且不只是局限于能够冷
驯化的植物 [ 16]。蛋白质和核酸数据库的搜索结果
也显示, 许多植物中均存在有潜在的 CBF同源基
因 [ 17]。这在水稻 [ 18]、大麦 [ 19]、小麦、黑麦与番茄 [ 20]
等多种植物中分离和鉴定出 CBF转录因子的报道
中得到了证明。
本研究以拟南芥 DNA 为模板, 用筛选出的
CBF1和 CBF4基因特异引物进行 PCR扩增,分别得
到了约 650 bp和 700 bp两条 DNA片段, 通过 PCR
和酶切鉴定后进行 DNA测序, 结果表明, 这两条
DNA片段实际大小分别为 642 bp和 675 bp,将它们
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2010年第 2期 徐春波等 :拟南芥转录因子 CBF1和 CBF4基因的克隆与序列分析
的基因序列与 G enB ank中 CBF1和 CBF4基因序列
进行比对, 同源性分别可达 9984%和 9941%, 且
存在差异的氨基酸并不在基因的功能结构域上,具
有正常的生理功能, 就说明这两个片段 DNA确为
CBF1和 CBF4基因片段,克隆成功, 为下一步克隆
苜蓿 CBF转录激活因子和利用这两个基因改良苜
蓿抗逆性快速培育耐逆性强的苜蓿新品种奠定了
基础。
参 考 文 献
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1 0351040.
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